CN105111298A - 一种小分子牦牛奶酪蛋白多肽及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小分子牦牛奶酪蛋白多肽，主要涉及一种小分子酪蛋白多肽及制备领域。其序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ。其制备步骤包括（1）将牦牛奶1L与50-100ml凝乳酶混合，离心2000-3000rpm，5-10分钟，得到凝固沉淀物；（2）将凝固沉淀物加入水中，煮沸，离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；（3）将上清液加入pH4-5的酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；（4）将沉淀物溶于pH4.5-5.0缓冲液中，经Sephadex？G25，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。本发明的有意效益在于制备得到的多肽纯度大于60%，能显著促进Ca、Mg等微量元素的吸收，作用与酪蛋白相当，无抗原性，口感较好。

Description

一种小分子牦牛奶酪蛋白多肽及制备方法
技术领域
本发明涉及一种酪蛋白多肽领域，尤其涉及一种小分子酪蛋白多肽及制备领域。
背景技术
牦牛奶是优质的营养食品,但是又是较易引起过敏的食物之一。酪蛋白占牦牛奶蛋白总量的8O％，是牛乳中含量最高的蛋白质，也是牦牛奶5种具变应原性蛋白中，变应原性最强的蛋白质。异性蛋白质，如酪蛋白，由于其分子量过大，进入体内后，未发育成熟的婴儿胃肠缺乏分解它们的酶，便作为抗原进入血液循环，刺激人体产生抗体，从而引起过敏反应，如腹痛、腹胀或腹泻、哮喘、荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎、大便常带粘液和血等过敏等症状。这些症状会给婴幼儿带来很大的痛苦。
小分子蛋白质或多肽就不会诱发免疫变态反应。但是，小分子蛋白质往往会失去原形蛋白质的营养和功效。而且，氨基酸本身的味道较苦，分解越充分、纯度越高的氨基酸味道越苦，因此，会影响口感。如何才能让分解后的小分子蛋白质既有营养，口感又好，一直是一个难以协调的问题。
发明内容
发明目的
针对现有牦牛奶乳制品的现状，发明一种小分子酪蛋白多肽，该多肽既有酪蛋白的营养，而且对婴幼儿不易产生变态反应，口感又好的食品添加剂。
技术方案
本发明为一种小分子牦牛奶酪蛋白多肽，其序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ。其制备步骤包括(1)将牦牛奶1L与50-100ml凝乳酶混合，离心2000-3000rpm，5-10分钟，得到凝固沉淀物；(2)将凝固沉淀物加入水中，煮沸，离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；(3)将上清液加入pH4-5的酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；(4)将沉淀物溶于pH4.5-5.0缓冲液中，经SephadexG25分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。所述的凝乳酶，可以是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶、合欢蛋白酶、朝鲜蓟蛋白酶等。
有益效果
本发明的制备得到的小分子牦牛奶酪蛋白多肽，经蛋白质序列测定，序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ，纯度大于60％。药理实验表明，该小分子多肽能显著促进Ca、Mg等微量元素的吸收，作用与酪蛋白相当。抗原实验结果表明，该小分子多肽没有抗原性。由于该多肽为小分子多肽，而不是氨基酸，因此口感较好。
具体实施方式
实施例1
将牦牛奶1L与50ml木瓜蛋白酶混合，离心2000rpm，5分钟，得到凝固沉淀物；将凝固沉淀物加入水中，煮沸，离心2000rpm，5分钟，取上清；将上清液加入pH4-5的酸性缓冲液中，搅拌，离心10000rpm，30分钟，得到沉淀物；将沉淀物溶于pH4.5-5.0缓冲液中，经SephadexG25，pH7.2的PBS缓冲液作为流动相，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白质自动测序仪测定该多肽的序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ，纯度为87％。
实施例2
将牦牛奶1L与100ml合欢蛋白酶混合，离心3000rpm，10分钟，得到凝固沉淀物；将凝固沉淀物加入水中，煮沸，离心3000rpm，10分钟，取上清；将上清液加入pH4-5的酸性缓冲液中，搅拌，离心15000rpm，60分钟，得到沉淀物；将沉淀物溶于pH4.5-5.0缓冲液中，经SephadexG25，pH7.2的PBS缓冲液作为流动相，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白质自动测序仪测定该多肽的序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ，纯度为76％。
实施例3
免疫原性检测：BALB/c白鼠6只，雌雄各半，口服分别给予36mg/kg的实施例1制备得到的多肽。连续给药8周，于1-12周眼眶静脉丛定点取血每周一次，12000rpm离心2min，分离血浆取上清液，-20℃低温保存备用。待室温溶解后，取0.1ml上清液间接ELISA检测血清中抗体滴度，其中所述的ELISA检测试剂盒购自上海生工。以各样品实际A值(OD450)比阴性对照血清A值即得RA值，RA≥2.1即为阳性，将Bloodbio-samples样品作一系列稀释后进行检测，呈阳性反应的最高稀释度即为该样品的滴度。测定结果显示。1-12周收集的血样，经ELISA间接法检测多肽诱导抗体的RA均小于1.5，均为阴性。由此可见，本发明得到的小分子牦牛奶酪蛋白多肽无免疫原性。
实施例4
血清中钙离子的含量：ICR白鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，每组10只，分别为空白组、牦牛奶组、酪蛋白多肽低、高剂量组，分别口服生理盐水、牦牛奶、酪蛋白多肽9，36mg/kg。连续给药4周，于第四周末次给药后眼眶静脉丛定点取血测血清中钙含量。
结果：如表1，酪蛋白多肽低、高剂量组均能显著性升高血清中钙离子的含量(P<0.05)，与牦牛奶组相比无差异。
表1小分子牦牛奶酪蛋白多肽对血清钙离子含量的影响(means±s)
**p<0.05模型组相比。
SEQUENCELISTING
<110>常州亚当生物技术有限公司
<120>一种小分子牦牛奶酪蛋白多肽及制备方法
<130>
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
ProIleProTyrProIleLeuProGlnAsnPheLeuProProLeuGln
151015
ProAlaValMetValProPheLeuGln
2025

Claims (3)

1.一种小分子牦牛奶酪蛋白多肽，其特征在于，序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ。
2.根据权利要求1所述小分子牦牛奶酪蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤包括（1）将牦牛奶1L与50-100ml凝乳酶混合，离心2000-3000rpm，5-10分钟，得到凝固沉淀物；（2）将凝固沉淀物加入水中，煮沸，离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；（3）将上清液加入pH4-5的酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；（3）将沉淀物溶于pH4.5-5.0缓冲液中，经SephadexG25，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。
3.根据权利要求书2小分子牦牛奶酪蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的凝乳酶是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶、合欢蛋白酶或朝鲜蓟蛋白酶。
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