CN114504051A - 一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法，属于乳制品加工技术领域。本发明公开的一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法，基于CN的主要过敏原αs1‑CN与IgE和IgG结合的主要结合表位，筛选出具有较高专一性水解αs1‑CN与IgE和IgG结合的抗原表位，从而降低抗原性，提高了抗原性靶向消除的效果。本发明充分利用凝乳酶预水解去除CN胶粒的保护层，提高酪蛋白的酶可及性，提高了酶解效率，缩短酶解工艺时间。

Description

一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的 方法

技术领域

本发明涉及乳制品加工技术领域，更具体的说是涉及基于分子模拟定向选酶联合凝乳酶辅助木瓜蛋白酶高效降解酪蛋白抗原性的方法。

背景技术

牛乳(CMP)具有丰富的营养价值，目前其制品——是以人乳为依据的最大限度接近人如化学组成的婴幼儿配方奶粉已成为母乳辅食的最佳替代品，然而由于婴幼儿消化系统和免疫系统不成熟等原因，摄入牛奶后出现特应性皮炎、湿疹和哮喘等牛奶过敏问题的婴幼儿高达6％，但过敏率随着年龄的增长而减少。数据显示2005-2019年间，由于健康、工作需要等原因，导致无法母乳喂养，世界标准婴幼儿配方奶粉(standard cow’s milkformula，CMF)的总销量增长了121％，预计2024年总量将达238万吨。随着婴幼儿配方奶粉辅食率提高，婴幼儿牛奶过敏率也在增加。为保证婴幼儿食品的安全，降低婴幼儿配方奶粉致敏性至关重要。

目前对过敏尚无有效治愈手段，主要依靠食物规避、诱导耐受和食物脱敏；过度食物规避容易导致营养不良，诱导耐受尚无可行的治疗方案。食物脱敏技术是能够在源头控制过敏原在安全范围内的的一种安全技术，主要有热加工和生物酶解等传统加工技术以及高压，超声，电磁波、电场冷等离子体等新加工技术。确诊的牛奶蛋白过敏婴幼儿(cow milkprotein allergy infant，CMAI)可以食用深度水解婴幼儿配方奶粉。但有研究显示使用深度水解配方奶粉(extensively hydrolysed formula，eHF)的婴幼儿首年成长体重显著低于正常儿童；一定程度表明深度水解配方奶粉丧失了牛奶蛋白原有的功能。此外这类产品存在味道和功能特性缺陷。而且，经过深度水解度的酪蛋白可能会失去诱导口服耐受的能力，也即表明CMAI在摄入完整酪蛋白时仍会产生过敏反应。鉴于此，使用抗原性残留相对少的部分水解蛋白诱导CMAI耐受成为预防CMA的最佳方案。

CMP主要由约80％的酪蛋白(casein，CN)和约20％的乳清蛋白(whey protein，WP；包括α-乳白蛋白：α-Lactalbumin，ALA，β-乳球蛋白：β-Lactoglobulin，BLG)组成，ALA、BLG和CN对儿童的致敏率分别为88.8％，87.5％和90％；其中CN与IgE的免疫反应性最强，高达77.5％，是目前认为CMP中抗原性最强的组分。通常认为CN分子量大不易消化从而引起过敏。CN是4个亚基(αs1:αs2:β:κ＝4:1:4:1)通过磷酸钙纳米簇和蛋白相互作用力构成的由κ-CN包裹的致密的亚胶束。目前研究认为CN抗原性主要来自αs1-CN亚基，与IgE的免疫反应性高达55.5％，被认为是CN中最主要的致敏组分。αs1-CN是由199个氨基酸构成的中度磷酸化的分子量为23.6kDa的单条酸性(pI＝4.1-4.5)肽链。与α乳白蛋白和β乳球蛋白等球蛋白不同，天然的CN蛋白结构灵活性很强，对酶敏感性很大。但是乳制品加工过程降低了消化酶等酶对CN的可及性，同时研究还显示与天然态CN相比，CN胶粒在低pH(2-5)变得更紧凑，导致消化酶可及性降低导致过敏的发生。

众所周知抗原抗体的结合是由构象决定的，构象性表位比线性表位更重要，但是目前由于αs1-CN缺乏晶体结构其抗原表位主要集中在线性表位。近来，深度学习在蛋白结构预测的应用大大提高了蛋白结构预测的精度和准确度，为从三维空间结构研究αs1-CN抗原性构象表位提供了可能。

CN102379359A中对酪蛋白利用碱性蛋白和胰蛋白酶进行分步水解，水解程度在10％～20％，虽然与原料相比过敏原含量降低99％以上，但是水解产物中主要由寡肽(180～1000Da)组成，占50～90％。乳蛋白在高水解度酶解导致味道和起泡性流变特性功能等缺陷限制了其应用，而由此应用必须用其他成分进行掩盖或技术修饰，这进一步增加了成本以及工艺和产品的复杂性。CN103966292A中采用复合酶解结合超滤工艺，制得适度水解酪蛋白肽粉。其平均分子量位于1500Da-3000Da之间，与市场上其他蛋白水解物相比，苦味值较小，加工性能良好。尽管主要过敏原αs1-酪蛋白含量较酪蛋白降低95％以上。但是CN水解物只有85％降低效果，CN总体抗原残留性相对较大，这对于高风险CMA婴幼儿是不利的(允许接受<10％抗原性存在)。而且酶解时间长达2-6h以及其与超滤工艺结合，一定程度也增加了成本以及工艺和产品的复杂性。类似的技术有，利用protamex和风味酶处理为酪蛋白，虽然抗原残留性降低至1/10000，但是水解物中主要有分子量为550Da的寡肽组成，且水解时间至少8h。CN105724578A披露的技术工艺步骤简单、处理时间短、温度低、有利于降低能耗，且在保持完整酪蛋白结构基础上可实现将牛乳中酪蛋白消化率提高到40％以上，但是该技术最大的过敏性抑制率不到40％，这远达不到生成低致敏性婴儿配方食品的要求。CN112646855A中提供的技术虽能获得苦味较小且稳定性较好的低致敏性酪蛋白肽，但该技术中引入了有毒有害物质甲基丙烯酸酐。US010245316B2中利用TG酶交联酪蛋白或酪蛋白酸钠掩盖抗原表位，显示出良好的诱导口服耐受，具有潜在的预防牛奶过敏的效果。尽管小鼠动物体内体外实验显示TG酶修饰的酪蛋白/酪蛋白酸钠显示出低的致敏性，但是由于小鼠和人体消除系统的差异，其掩盖的抗原表位很可能在婴儿消化系统中暴露而产生致敏症状，因此抗原表位的掩盖修饰技术产物对CMA患者是潜在的危险，如S.Damodaran and Y.Li(Food Chem.,2017,237,724-732)研究显示CN-TG聚合物中还存在大部分可与抗体结合的表位。在US5589357A技术方案中使用胰蛋白酶和胰蛋白凝乳酶组合水解乳清蛋白(60-80％)和酪蛋白(40-20％)复合物，水解度在4-10％，虽然该技术抗原抑制率达85-95％，但这个是针对乳蛋白复合物，并不是单独的酪蛋白。

长期以来，凝乳酶一直被用于凝乳(milk-clotting)，虽然单独使用凝乳酶对CMP抗原性影响不大，但是用凝乳酶对CN胶粒表面脱毛的效果大大提高了其他CNs酶的可及性。抗原表位的破坏是消除牛乳致敏性的根本所在，分析抗原(αs1-CN)和抗体(IgG)结合的热点氨基酸有助于靶向破坏抗原表位实现精准消除抗原性。

综上，经检索尚未发现采用凝乳酶对CN胶粒进行“开壳”预处理释放内含组分，提高蛋白水解酶的可及性，而且尚未有基于as1-CN结构与IgG抗体结合的热点氨基酸通过提高靶向性水解消除CN抗原性的报道。

因此，提供一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法，是基于分子模拟-生物信息学定向选酶联合凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法，利用凝乳酶破坏酪蛋白胶粒毛发层(κ-酪蛋白)联合木瓜蛋白酶靶向降解酪蛋白抗原表位蛋白酶，实现精准高效降解酪蛋白抗原性的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法，具体步骤如下：

(1)预先将酪蛋白配制成浓度为3-5％(g/ml)的酪蛋白溶液，调节pH7.0-8.0溶解过夜；

(2)过夜后将酪蛋白溶液体系pH调成6.0-6.4，按酪蛋白质量加入0.01-0.05％凝乳酶，在25-40℃预水解10-60min；预水解结束后将pH调成7.0-7.4，获得预水解液；

(3)按酶与预水解液为1：2000U/g加入木瓜蛋白酶，在40-60℃进一步水解20-60min，水解结束后灭酶；

(4)经喷雾干燥得到低致敏性酪蛋白水解物。

进一步，步骤(3)所述灭酶为在沸水浴灭酶5min或85℃灭酶15min。

本发明首先通过凝乳酶预水解去除CN胶粒的保护层-hairy surface layer ofthe proteinκ-casein，破除并释放内含蛋白组分，提高其他酪蛋白的酶可及性，达到高效降解酪蛋白抗原性的目的。然后基于从头模建as1的三维结构，利用分子对接形成IgG-αs1-CN复合物并通过分子动力学模拟优化构象，通过残基结合自由能分析确定αs1-CN与IgE和IgG结合的热点氨基酸，并据此选择具有针对性水解热点氨基酸的食品级商用蛋白酶对CN进一步水解，通过间接ELISA评价不同蛋白酶水解对CN抗原性的影响，并利用液质联用验证热点氨基酸的准确性，达到精准高效降解CN过敏原的目的。其中获得的CN水解物抗原性降低90％以上，αs1-CN抗原性降低95％以上，并且CN的水解度不高于10％，肽段主要集中在1000Da左右。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法，基于CN的主要过敏原αs1-CN与IgE和IgG结合的主要结合表位，筛选出具有较高专一性水解αs1-CN与IgE和IgG结合的抗原表位，从而降低抗原性，与现有技术相比，一定程度上提高了抗原性靶向消除的效果。

本发明充分利用凝乳酶预水解去除CN胶粒的保护层-hairy surface layer ofthe proteinκ-casein，提高酪蛋白的酶可及性，与现有技术相比，一定程度上提高了酶解效率，缩短酶解工艺时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明凝乳酶联合分子模拟预处理辅助酶解精准高效降解酪蛋白抗原性的技术路线图；

图2附图为本发明αs1-CN活性位点预测分析结果；

其中，A为αs1-CN在25和100℃的分子动力学模拟；B为第一次构象迭代分子动力学模拟，具体为αs1-CN上的I81，K83，K132，I136和N139丙氨酸突变后的分子动力学模拟；C为第二次构象迭代分子动力学模拟，具体为αs1-CN上的Y165，Y166，L169，T171，Q172和L198丙氨酸突变后的分子动力学模拟；

图3附图为本发明αs1-CN与IgE-Fab和IgG-Fab结合的的氨基酸残基自由能分解图；

其中，A为αs1-CN与IgE-Fab结合的的氨基酸残基自由能分解图；B为αs1-CN与IgG-Fab结合的的氨基酸残基自由能分解图；C为丙氨酸扫描对αs1-CN与IgE-Fab结合界面氨基酸残基结合自由能的影响；D为丙氨酸扫描对αs1-CN与IgG-Fab结合界面氨基酸残基结合自由能的影响；

VDW：范德华力；ELE：库仑力；SA：为非极性溶剂化能；GB：为极性溶剂化能；

图4附图为本发明αs1-CN的主要表位肽段和IgE和IgG的免疫学反应；

其中，A为αs1-CN的主要表位肽段和IgE的免疫学反应；B为αs1-CN的主要表位肽段和IgG的免疫学反应；

图5附图为本发明木瓜蛋白酶水解物液质分析结果；

其中，每个箭头表示一个鉴定的多肽；

图6附图为本发明不同质量浓度凝乳酶预水解酪蛋白的时间扫描荧光动力学分析；

图7附图为本发明内源荧光扫描分析；

图8附图为本发明凝乳酶水解动力学分析；

图9附图为本发明凝乳酶水解过程中粒径动力学分析；

图10附图为本发明凝乳酶辅助木瓜蛋白酶水解对CN抗原性和水解度的影响；

图11附图为本发明水解物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；

图10-图11中，CN为酪蛋白；CHYH为凝乳酶水解60min；PAPH60为木瓜蛋白酶水解60min；PAPH360为木瓜蛋白酶水解360min；CPAH为凝乳酶辅助木瓜蛋白酶水解酪蛋白。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

酪蛋白购自上海源叶生物科技有限公司；凝乳酶购自索莱宝生物科技有限公司。

本发明的目的是实现精准高效降低CN抗原性，其中靶向性的实现是通过基于从头模建as1的三维结构，利用分子对接形成IgG-αs1-CN复合物并通过分子动力学模拟优化构象，通过残基结合自由能分析确定αs1-CN与IgE和IgG结合的热点氨基酸，并据此选择具有针对性水解热点氨基酸的食品级商用蛋白酶实现对主要抗原αs1-CN的靶向降解。高效性是通过凝乳酶预水解去除CN胶粒的保护层-hairy surface layer of the proteinκ-casein，提高酪蛋白的酶可及性。提高水解效率进而提升抗原降解的效率。

通过凝乳酶联合分子模拟预处理辅助酶解精准高效降解酪蛋白抗原性的技术路线见图1。

实施例1αs1-CN潜在活性位点预测

将αs1-CN的序列(P02662)提交到TrRosetta从头模建三维结构，通过从头模建(https://yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/)得到αs1-CN的三维结构，对初始αs1-CN构象进行500ns分子动力学模拟充分平衡获得稳定的最佳αs1-CN三维结构。以αs1-CN变性温度(374K)为参考点，采用构象迭代分子动力学预测αs1-CN潜在的活性位点，采用Gromacs2019.6进行分子动力学模拟。选择Amber14SB和TIP3P作为力场和溶剂模型，将蛋白封装在距边界0.1nm的周期性立方体盒子中，并填充水分子，同时加入抗衡Na⁺进行中和。首先在力收敛性准则为1000kJ/mol/nm采用steep法进行50000步能量最小化，然后依次进行恒温浴场(NVT)和恒压浴场(NPT)各100ps控温(298K和374K)和空压模拟。最后进行成品分子动力学模拟，选择V-rescale热浴器保持所需的温度，Parrinello-Rahman压浴器设定压力为1bar，脉冲电场设置为在蛋白质平衡系统的x轴上，进行100ns的模拟。结束后根据均方根波动(RMSF)，选取374K中RMSF大于0.2nm波动区的残基经丙氨酸突变后进行第一轮迭代构象分子动力学模拟，结束后选取374K中RMSF大于0.2nm的残基经丙氨酸突变后进行第二轮迭代构象分子动力学模拟，直至不再有新的波动区出现。结果如图2所示。

由图2A可知，αs1-CN随着温度的升高，5个区域出现明显波动，其中区域I和III显示αs1-CN的稳定性显著提高，而II、IV和V这三个区域的结构柔性变得更大，表明该区域的活性增强。为了避免主链出现较大的扭曲，选取除了脯氨酸在内的RMSF波动大于0.1nm的14个残基II(V25,A26,F28),IV(N74,S75,I81,Q82,K83)和V(K132,E133,M135,I136,V138,N139)进行丙氨酸突变进入第一轮ICDA，结果显示(图2B)新出现2个波动区域VI(W164,Y165,Y166,L169,G170,Y171,Q172,T174)和VII(S191,E192,T195,L198)，根据同样的规则进行第三轮ICDA，结果显示没有新的RMSF波动峰出现(图2C)。由此，αs1-CN通过ICDA分析共筛选得到分布在五个区域(F23-E35、N74-V86、H128-Q140、G162-T174和P185-L198)26个潜在的活性氨基酸。

实施例2αs1-CN与IgE-Fab和IgG-Fab结合表位分析

选取IgE抗体结合片段(antigen-binding fragment，IgE-Fab，PDB：2R56)和IgG抗体结合片段(IgG-Fab，PDB：4LQF)的重链H和轻链L作为受体，αs1-CN作为配体，分别以IgE-Fab和IgG-Fab作为蛋白1和αs1-CN作为蛋白2用RoessttaDock进行全局对接10000次，选取能量最低的IgE-Fab:αs1-CN和IgG-Fab:αs1-CN进行分子动力学模拟深入分析。利用分子力学/波恩广义表面积(MMPBSA)计算抗原抗体残基间结合的氢键、范德华力、静电引力和疏水相互作用以及吉布斯自由能；选取能量低于-3kcal/mol的残基为热点氨基酸(hot spots)。结果见图3。

由图3A和图3B可知，通过能量分解到残基进一步分析每一个氨基酸残基在抗原抗体识别过程中的作用力，其中结合自由能小于-1kcal/mol的残基对复合物的结合和稳定具有重要的作用，而结合自由能大于0的残基对复合物的结合具有排斥作用。结果显示，来自IgE-Fab:αs1-CN复合物的14个氨基酸残基(Q59:-6.29,Y166:-5.74,P168:-5.55,M196:-4.21,Y165:-3.83,T194:-3.31,Y173:-2.15,Y154:-2.07,Y159:-1.75,A62:-1.58,G170:-1.49,L198:-1.37,Y156:-1.19,和T195:-1.10kcal/mol)和15个来自IgG-Fab:αs1-CN的氨基酸残基(W164:-3.64,Y165:-8.57,Y166:-3.25,T195:-3.28,M196:-4.31,P197:-3.77,L198:-2.40,K83:-2.25,Y154:-1.85,I81:-1.76,N114:-1.66,H80:-1.64,T174:-1.45,Q172:-1.32,和I136:-1.01)对复合物的结合有显著的突出作用。

进一步通过丙氨酸扫描分析复合物结合界面结合自由能影响，由图3C和图3D可知，αs1-CN与IgE-Fab主要结合区域有三个，为E55-I65，Y154-T174，N190-L198，与IgG-Fab也存在3个结合表位区为E77-Q97，Y154-T174，N190-L198)，其中Y154-T174、N190-L198是αs1-CN与IgE-Fab和IgG-Fab公共的识别和结合表位区，且存在6个公共热点氨基酸残基(Y154,W164,Y166,T174,T195,L198)；其中表位(E55-I65)和(E77-Q97)是αs1-CN与IgE-Fab和IgG-Fab识别的结合的特异性表位区。

实施例3αs1-CN热点氨基酸和主要表位的抗原性分析

通过固相多肽合成法合成7条的原始肽链表位以及9个突变体以验证热点氨基酸和主要抗原表位的抗原性。结果见图4。

图4显示，在IgE血清学评价实验中，表位L156-A176的OD值显著高于αs1-CN的OD值，除了表位M135-Q155和E77-Q97的OD值低于αs1-CN的OD值，其余表位的OD值与αs1-CN的OD值无显著差异；在突变体中，Q59、Y154、Y165和Y166的突变极其显著的降低了表位的OD值，均小于0.2，认为基本无免疫原结合反应，其余突变体OD值降低不显著(图4A)。在IgG血清学评价实验中，基本是所有的原始表位与αs1-CN的OD值无显著差异，而K83、Y154、W164和Y165的突变极其显著的降低了表位的OD值，均小于0.1，认为基本无IgG结合反应(图4B)。

综上结果显示Q59,Y154,Y165,Y166以及K83,Y154,W164和Y165是αs1-CN与IgE-Fab和IgG-Fab的关键结合位点，这6个热点氨基酸与αs1-CN的抗原性有重要关系。

实施例4专一高效破坏αs1-CN抗原性蛋白酶的筛选

对比当下几款流行的用于预测酶切位点的生物信息学软件，Pops(http://pops.csse.monash.edu.au/)、siteprediction(https://www.dmbr.ugent.be/prx/bioit2-public/SitePrediction/index.php)和PROSPERous(https://prosperous.erc.monash.edu/)。PROSPERous是基于机器学习可以快速、准确和高通量地预测蛋白酶与底物的酶切位点，但是PROSPERous只能预测天冬氨酸、半胱氨酸、金属和丝氨酸4类蛋白酶在内的包含75种单独的蛋白酶的底物切割位点，数据库范围相对狭小。而Pops是基于实验数据或一级序列特异性建立蛋白酶的计算特异性模型，可公开访问的数据库并从中检索其中包含迄今为止鉴定的所有蛋白酶，但是因为开发时间年久，已不可访问。Siteprediction是基于统计学评分的一种用于识别潜在切割位点的新颖且用户友好的工具，能够预测所有已知蛋白酶底物的酶切位点，因此以siteprediction为分析工具，以αs1-CN一级序列P02662(删去前15个属于信号肽的氨基酸，一共199aa)。

选取常用的14种商业蛋白水解酶作为分析对象，以E55-I65、E77-Q97、Y154-T174、和N190-L198为目标切割区域分析蛋白酶对主要表位的破坏情况，理论破坏程度为切割位点个数与总表位长度的比值。实际抗原残留性通过间接竞争ELISA表征，将抗原抑制率最高的蛋白酶作为优选对象。结果如表1所示。

表1基于生物信息学筛选14种商业蛋白酶对E55-I65、E77-Q97、Y154-T174、和N190-L198理论破坏程度和实际酶解效果分析

表1显示，除了复合风味蛋白酶为混合酶外，其余13种蛋白酶均通过siteprediction预测在4个表位中存在酶切位点，理论破坏程度在1.61％到11.29％，其中木瓜蛋白酶理论破坏程度最大，为11.29％，其次是菠萝蛋白酶和α-胰蛋白凝乳酶，均为9.68％，接着是胃蛋白酶、碱性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和蛋白酶K，为8.06％；凝乳酶理论破坏程度最低为1.61％。经免疫化学评估结果显示，抗原残留性最低的同样为木瓜蛋白酶水解物，抗原残留反应性为12.42％，其次是菠萝蛋白酶，为15.12％，抗原残留反应性最大的为凝乳酶水解物。

进一步通过液质联用分析木瓜蛋白酶水解产物，结果见图5；图5显示木瓜蛋白酶在主要表位的理论水解位点与实际结果一致，表明木瓜蛋白酶能有效破坏αs1-CN抗原表位。

综上分析表明，通过siteprediction预测不同蛋白酶在αs1-CN上的酶切位点与实际试验结果具有较好的一致性，表明实施例2所选的αs1-CN的4个表位能真实反映αs1-CN的抗原性。此外通过生物信息学分析以及免疫化学评估显示，木瓜蛋白酶在众多蛋白酶中能较大程度的专一性破坏αs1-CN的抗原表位，降低其抗原性，因此选择木瓜蛋白酶作为αs1-CN抗原性专一性降解蛋白酶。

实施例5凝乳酶预处理协同木瓜蛋白酶精准高效降解酪蛋白抗原性

配置3％(g/ml)的酪蛋白溶液并将pH调至6.0，按酪蛋白质量加入不同质量浓度凝乳酶，在37℃预处理60min，采用荧光分光光度计和马尔文激光粒度仪在线监测CN胶粒的变化分析凝乳酶脱除κ-CN毛层动力学。结果见图6-图9。

图6结果显示，由不同质量浓度凝乳酶预水解酪蛋白的时间扫描荧光动力学分析结果显示，凝乳酶的加入，对酪蛋白的荧光具有猝灭作用，凝乳酶质量浓度越高，猝灭强度越大。在浓度为3％(g/ml)的酪蛋白体系中，加入凝乳酶后，荧光强度先急剧下降，当凝乳酶反应60min后，酪蛋白体系荧光强度趋于稳定，通过不同体系分析可知，凝乳酶在反应60min基本达到平衡状态。

同样，图7内源荧光扫描分析结果也显示，随着时间的增长，酪蛋白体系内容源荧光先下降，后趋于稳定。图8凝乳酶水解动力学分析结果显示，在凝乳酶加入后的初始阶段，水解度急剧增大，后趋于平稳，在60min后水解度为3.5％左右。图9在该条件下粒径动力学分析结果表明，凝乳酶加入后酪蛋白粒径逐渐减小，后趋于稳定，粒径大小约减小了20nm左右，也即表明酪蛋白表层的κ-CN被脱除。综上，确定凝乳酶预处理时间为30min，酶与底物比为1:10000。

实施例6

(1)凝乳酶辅助木瓜蛋白酶水解酪蛋白(CPAH)：

预先将酪蛋白配制成浓度为4％(g/ml)的酪蛋白溶液，调节pH 7.0溶解过夜；过夜后将酪蛋白溶液体系pH调成6.0，按照酶与底物(酪蛋白)质量比为1:10000加入凝乳酶，在37℃条件下反应30min后，将体系pH调成7.0，获得预水解液；按酶与底物(预水解液)比1：2000(U/g)加入木瓜蛋白酶，在42℃条件下反应60min，反应结束后沸水浴灭酶5min，经喷雾干燥得到低致敏性酪蛋白水解物。

(2)凝乳酶水解60min(CHYH)：

预先将酪蛋白配制成浓度为4％(g/ml)的酪蛋白溶液，调节pH 7.0溶解过夜；过夜后将酪蛋白溶液体系pH调成6.0，按照酶与底物(酪蛋白)质量比为1:10000加入凝乳酶，在37℃条件下反应60min后，将体系pH调成7.0，在37℃条件下反应60min，反应结束后沸水浴灭酶5min，经喷雾干燥得到低致敏性酪蛋白水解物。

(3)木瓜蛋白酶水解60min(PAPH-60)和360min(PAPH-360)：

预先将酪蛋白配制成浓度为4％(g/ml)的酪蛋白溶液，调节pH 7.0溶解过夜，获得预水解液；按酶与底物(预水解液)比1：2000(U/g)加入木瓜蛋白酶，在42℃条件下反应60min和360min，反应结束后沸水浴灭酶5min，经喷雾干燥得到低致敏性酪蛋白水解物。

测定水解物的抗原残留性和水解度。结果见图10。

由图10结果可知，单独木瓜蛋白酶水解酪蛋白360min(PAPH-360)时，抗原残留性为约14％，水解度为12％左右。凝乳酶预处理辅助木瓜蛋白酶水解酪蛋白(CPAH)60min，水解物抗原残留性为12.14％，且水解度控制在9％左右，凝乳酶预处理辅助木瓜蛋白酶组效率提高了5倍，表明凝乳酶预处理结合木瓜蛋白酶水解酪蛋白可实现高效降解CN抗原性的低致敏性酪蛋白水解物制备的目的。

水解物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果见图11。由图11可知，凝乳酶辅助木瓜蛋白酶水解的水解物大分子片段减少，而大分子片段是抗原存在的潜在特性；因此，大分子片段的减少，也表明了抗原性的降低。

实施例7

预先将酪蛋白配制成浓度为3％(g/ml)的酪蛋白溶液，调节pH 7.4溶解过夜；过夜后将酪蛋白溶液体系pH调成6.4，按酪蛋白质量加入0.04％凝乳酶，在25℃预水解30min后，将体系pH调至7.4，获得预水解液；按酶与底物(预水解液)1：2000U/g加入木瓜蛋白酶，在55℃条件下水解30min，反应结束后立即在85℃条件下灭酶15min，经喷雾干燥得到低致敏性酪蛋白水解物，水解物抗原性为9.45％。

实施例8

预先将酪蛋白配制成浓度为5％(g/ml)的酪蛋白溶液，调节pH 8.0溶解过夜；过夜后将酪蛋白溶液体系pH调成6.2，按酪蛋白质量加入0.05％凝乳酶，在40℃预水解10min后，将体系pH调至7.2，获得预水解液；按酶与底物(预水解液)1：6000U/g加入木瓜蛋白酶，在60℃条件下水解20min，反应结束后立即在沸水浴灭酶5min，经喷雾干燥得到低致敏性酪蛋白水解物，水解物抗原性为8.52％。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (2)

1.一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)预先将酪蛋白配制成浓度为3-5％(g/ml)的酪蛋白溶液，调节pH7.0-8.0溶解过夜；

(2)过夜后将酪蛋白溶液体系pH调成6.0-6.4，按酪蛋白质量加入0.01-0.05％凝乳酶，在25-40℃预水解10-60min；预水解结束后将pH调成7.0-7.4，获得预水解液；

(3)按酶与预水解液为1：2000-1：6000U/g加入木瓜蛋白酶，在40-60℃进一步水解20-60min，水解结束后灭酶；

(4)经喷雾干燥得到低致敏性酪蛋白水解物。

2.根据权利要求1所述的一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法，其特征在于，步骤(3)所述灭酶为在沸水浴灭酶5min或85℃灭酶15min。

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