WO2014020679A1 - 発酵乳類及びその製造方法 - Google Patents

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cystatin
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milk
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愛子 大町
松山　博昭
森田　如一
祐子 石田
貴幸 奈良
加藤　健
芹澤　篤
宏 上野
浩司 浦園
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雪印メグミルク株式会社
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    • C12Y301/27—Endoribonucleases producing 3'-phosphomonoesters (3.1.27)

Definitions

  • the present invention relates to a novel fermented milk and a method for producing the same.
  • the fermented milk of the present invention is useful for the prevention and treatment of various bone diseases such as osteoporosis, fractures, rheumatism and arthritis.
  • Bone quality refers to bone microstructure, turnover, micro fracture, and calcification.
  • osteoclasts As a method for preventing various bone diseases such as osteoporosis, fractures, and back pain, it is conceivable to suppress bone resorption by osteoclasts. Bone repetitively undergoes balanced resorption and formation (remodeling), but due to changes in hormone balance after menopause, etc., bone resorption exceeds bone formation, which leads to various bone diseases such as osteoporosis, fractures, and back pain Cause. Therefore, it is possible to strengthen the bone as a result by suppressing bone resorption by osteoclasts and keeping the bone strength constant.
  • calcium salts such as calcium carbonate, calcium phosphate, and calcium lactate
  • natural calcium preparations such as whey calcium, beef bone meal, eggshell, etc.
  • these calcium agents are ingested together with substances having a calcium absorption promoting effect such as casein phosphopeptides and oligosaccharides in medicines, foods and drinks, feeds and the like.
  • the absorption rate of calcium when ingesting these calcium salts and natural calcium preparations added to foods and drinks is 50% or less, and it is said that a lot of calcium is not absorbed and is discharged outside the body. Yes.
  • JP-A-8-151331 Japanese Patent Laid-Open No. 10-7585 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-28187
  • An object of the present invention is to provide fermented milk useful for the prevention and treatment of various bone diseases such as osteoporosis, fractures, rheumatism and arthritis.
  • the present inventors contain angiogenin and / or angiogenin degradation product, and contain cystatin and / or cystatin degradation product in a specific range of mass ratio with respect to angiogenin and / or angiogenin degradation product. It has been found that by ingesting fermented milk, an effect of effectively increasing bone density can be obtained, and the present invention has been completed.
  • this invention consists of the following structures. (1) 0.9 mg to 150 mg / 100 g of angiogenin and / or angiogenin degradation product, and the mass ratio of cystatin and / or cystatin degradation product to angiogenin and / or angiogenin degradation product is 0.1. Fermented milk containing in the range of 006 to 1.7. (2) A method for preventing a bone disease, wherein 100 g / day or more of the fermented milk according to (1) is ingested. (3) The method for producing fermented milk according to the above (1), which comprises a step of adding angiogenin and / or angiogenin degradation product and cystatin and / or cystatin degradation product to a milk raw material, sterilizing, and fermenting. (4) The method for producing fermented milk according to the above (1), comprising a step of adding angiogenin and / or angiogenin degradation product and cystatin and / or cystatin degradation product to the sterilized milk raw material and fermenting.
  • the fermented milk of the present invention has an effect of strengthening bones, and is useful for the prevention and treatment of various bone diseases such as osteoporosis, fractures, rheumatism and arthritis.
  • the features of the fermented milk of the present invention include angiogenin and / or angiogenin degradation products in a specific range of amounts, and angiogenin and / or angiogenin degradation products and cystatin in a specific range of mass ratio. And / or to contain a cystatin degradation product.
  • fermented milk contains about 0.2 to 0.8 mg / 100 g of angiogenin and / or angiogenin degradation products and about 0.4 to 1.1 mg / 100 g of cystatin and / or cystatin degradation products.
  • angiogenin and / or angiogenin degradation product and cystatin and / or cystatin degradation product are added, and angiogenin and / or angiogenin degradation product is 0.9 mg to 150 mg / 150 mg / mg.
  • 100 g is contained, and cystatin and / or cystatin degradation product is contained in a mass ratio of 0.006 to 1.7 with respect to angiogenin and / or angiogenin degradation product.
  • Angiogenin and / or angiogenin degradation products and cystatin and / or cystatin degradation products contained in the fermented milk of the present invention include angiogenin prepared from milk of mammals such as humans, cows, buffaloes, goats and sheep. And / or fractions containing angiogenin degradation products, fractions containing cystatin and / or cystatin degradation products, fractions produced by genetic engineering techniques, angiogenin purified from blood and organs and / or Angiogenin degradation products, cystatin and / or cystatin degradation products can be used. It is also possible to use purified and commercially available reagents for angiogenin and cystatin.
  • angiogenin-containing fraction angiogenin reagent or cystatin-containing fraction, cystatin reagent, etc., each containing an angiogenin degradation product or cystatin degradation product obtained by degradation with one or more proteolytic enzymes Is possible.
  • protein materials prepared by extracting fractions containing angiogenin and / or angiogenin degradation products and cystatin and / or cystatin degradation products directly from milk or milk-derived raw materials such as skim milk and whey It is also possible to make it.
  • a protein material is prepared by, for example, bringing milk or a milk raw material into contact with a cation exchange resin, and then eluting the milk-derived protein adsorbed on the resin at a salt concentration of 0.1 to 2.0 M for reverse osmosis.
  • Proteins such as trypsin, pancreatin, chymotrypsin, pepsin, papain, kallikrein, cathepsin, thermolysin, V8 protease, etc., as necessary It can be prepared by decomposing with a degrading enzyme so that the molecular weight becomes 8,000 or less.
  • the minimum of molecular weight shall be 500 or more.
  • the protein material obtained in this way can be dried by freeze drying, spray drying, or the like, and the dried material may be contained in fermented milk.
  • angiogenin and / or angiogenin degradation product cystatin and / or cystatin degradation product, protein material containing these, etc. are added to the milk raw material, and 0.9 mg of angiogenin and / or angiogenin degradation product is added. ⁇ 150 mg / 100 g is contained, and cystatin and / or cystatin degradation product is contained in a mass ratio of 0.006 to 1.7 with respect to angiogenin and / or angiogenin degradation product.
  • angiogenin and / or angiogenin degradation product cystatin and / or cystatin degradation product, bone strengthening more effectively than ingesting each component alone The effect can be obtained.
  • the fermented milk of the present invention is not particularly limited except that it contains angiogenin and / or an angiogenin degradation product, cystatin and / or a cystatin degradation product in a specific amount, and may be produced according to a general method.
  • the fermented milks produced by the present invention are all fermented milks such as fermented milk, dairy lactic acid bacteria beverages, and lactic acid bacteria beverages.
  • milk raw materials are mixed as necessary, angiogenin and / or angiogenin degradation products are blended in a specific amount range, and cystatin and / or cystatin degradation products are mixed with angiogenin and / or It is prepared by adding so as to have a mass ratio within a specific range with respect to the angiogenin degradation product.
  • milk beverages in addition to milk, defatted concentrated milk, defatted powdered milk, whey, butter, cream, etc., milk beverages, processed milk, ingredient-adjusted milk, low-fat milk, non-fat mixed with these as necessary Milk is included.
  • Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus (Streptococcus thermophilus), Lactobacillus helveticus (Lactobacillus helveticus), Lactobacillus helveticus (Lactobacillus helveticus)
  • Starter culture prepared by inoculating and fermenting yeasts such as Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces unisporus After seeds, by fermentation in a conventional manner, it can be prepared fermented milks of the present invention. It can also be sterilized after fermentation.
  • angiogenin and / or an angiogenin degradation product and cystatin and / or a cystatin degradation product may be added to an unsterilized milk raw material or a sterilized milk raw material.
  • sterilization is performed after the addition. Sterilization is preferably performed by heat sterilization. However, when heat sterilization is performed after adding angiogenin and / or an angiogenin degradation product, cystatin and / or a cystatin degradation product to a milk raw material, it is preferable to make it at 130 degreeC for 2 second or less.
  • the fermented milk of the present invention includes angiogenin and / or an angiogenin degradation product and cystatin and / or a cystatin degradation product, in addition to the above-described milk raw materials, sugars, lipids, proteins, vitamins, minerals, Flavors and other raw materials usually used in foods and drinks can also be blended, and other components that exhibit bone strengthening action, such as calcium, vitamin D, vitamin K, isoflavone, etc., can be blended.
  • the fermented milk of the present invention can reinforce bone by ingesting 100 g or more per kg of body weight in a test with experimental animals described later. Since the intake in this experimental animal corresponds to the intake per adult in the blood drug concentration (Mitsuyoshi Nakajima (1993), “Volume 8: Efficacy Evaluation”, Yodogawa Shoten, pages 2-18), usually adults Bone can be strengthened by ingesting 100 g or more of the fermented milk of the present invention per person per day, and the effects of prevention and treatment of various bone diseases such as osteoporosis, fractures, rheumatism and arthritis can be particularly expected.
  • the eluted fraction containing angiogenin is fractionated by S-Sepharose cation exchange chromatography (manufactured by Amersham Biosciences), and the obtained angiogenin-containing fraction is heated at 90 ° C. for 10 minutes and centrifuged. The precipitate was removed by separation. Further, this angiogenin-containing fraction was treated with Superose 12 gel filtration chromatography. This eluate was desalted with a reverse osmosis membrane and then freeze-dried to obtain 16.5 g of an angiogenin fraction having angiogenin purity of 90%. These series of treatments were repeated 30 times.
  • the cystatin-containing fraction was then eluted with 20 mM acetic acid-0.5 M sodium chloride solution.
  • the eluted fraction was immediately neutralized with 1M sodium hydroxide solution.
  • the eluate was desalted with a reverse osmosis membrane and then freeze-dried to obtain 9.6 g of a cystatin fraction having a cystatin purity of 90%. These series of treatments were repeated 20 times.
  • Each sample solution was diluted 6-fold with 10 fmol / ⁇ l of an internal standard peptide solution (containing 0.1% formic acid, 0.02% trifluoroacetic acid (TFA), 2% acetonitrile), and 2.5 ⁇ l of the diluted solution was diluted with LC. Analysis was performed with / MS / MS.
  • an internal standard peptide solution containing 0.1% formic acid, 0.02% trifluoroacetic acid (TFA), 2% acetonitrile
  • Peptide separation was gradient eluted using an HPLC system. Specifically, MAGIC C18 0.2 mm ID ⁇ 50 mm with a column 5 ⁇ l peptide trap was used, and the flow rate was 2 ⁇ l / min, using a MAGIC 2002 HPLC system.
  • HPLC As solvents for HPLC, A solution: 2% acetonitrile-0.05% formic acid and B solution: 90% acetonitrile-0.05% formic acid were used.
  • the B solution was gradient eluted from 2% to 65% over 20 minutes.
  • the measurement target ion of cystatin is m / z 914.4 when the parent ion is NH2-QVSGMNYFLDVELGR-COOH, the MS / MS target ion is m / z 948.7 when NH2-FLDVELGR-COOH, and the measurement target ion of angiogenin is
  • the parent ion was measured with NH2-YIHFLTQHYDAK-COOH at m / z 768.8, and the MS / MS target ion was measured with NH2-FLTQHYDAK-COOH at m / z 1122.8.
  • the internal standard peptide is NH2-ETTVFELPEK-COOH (wherein P carbon is labeled with C13 and nitrogen is labeled with N15) at m / z 656.9, and the MS / MS target ion is NH2-FENPEK-
  • the reaction was carried out at m / z 882.4 with COOH (wherein P carbon was labeled with C13 and nitrogen was labeled with N15).
  • LCQ Advantage was used for MS. From the obtained chromatogram, the peak area of each protein was determined, and the concentration was determined from the ratio to the internal standard peptide.
  • Example product 1 166 mg of angiogenin fraction of Reference Example 1 and 0.5 mg of cystatin fraction of Reference Example 3 are mixed with 100 g of 10% reduced skim milk powder sterilized by heating at 100 ° C. for 10 minutes, and the usual method And fermented milk (Example product 1) was obtained.
  • the obtained fermented milk contains 150 mg / 100 g of angiogenin and / or angiogenin degradation product, and the mass ratio of cystatin and / or cystatin degradation product to angiogenin and / or angiogenin degradation product is 0.00. 006.
  • Example product 2 100 g of 10% reduced skim milk powder sterilized by heating at 100 ° C. for 10 minutes was mixed with 13.5 mg of the angiogenin fraction of Reference Example 2 and 1.2 mg of the cystatin fraction of Reference Example 3 Fermented milk (Example product 2) was obtained by fermentation according to a conventional method.
  • the obtained fermented milk contains 0.9 mg / 100 g of angiogenin and / or angiogenin degradation product, and the mass ratio of cystatin and / or cystatin degradation product to angiogenin and / or angiogenin degradation product is 1.7.
  • Fermented milk (Example product 3) was obtained by fermentation according to a conventional method.
  • the obtained fermented milk contains 12.4 mg / 100 g of angiogenin and / or angiogenin degradation product, and the mass ratio of cystatin and / or cystatin degradation product to angiogenin and / or angiogenin degradation product is It was 0.12.
  • Example 1 The bone strengthening effects of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2 were examined by animal experiments. For the experiment, C3H / HeJ male mice aged 5 weeks were used. After one week of pre-breeding, the mice were divided into 6 groups of 10 animals, and the Example products 1 to 3 and the Comparative products 1 and 2 were twice a day with a sonde so that the mouse weight per kg was 100 g per day. Orally administered and reared for 2 weeks. In addition, the group not administered with Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2 was used as a control group. After completion of administration (2 weeks), the bone density of the right tibia of the mouse was measured by micro CT (manufactured by Rigaku Corporation). The results are shown in Table 1. As shown in Table 1, the bone density was significantly increased in the group in which the example products 1 to 3 were orally administered for 2 weeks, as compared with the control group or the group in which the comparative example products 1 and 2 were administered.
  • Reference Example 5 4 g of the protein material of Reference Example product 4 was dissolved in 800 ml of water, and trypsin (manufactured by Sigma) as a proteolytic enzyme was added so that the final concentration was 0.03% by weight, followed by enzyme treatment at 37 ° C. for 8 hours. And after heat-processing at 90 degreeC for 5 minute (s) and deactivating an enzyme, it lyophilized
  • trypsin manufactured by Sigma
  • Example Product 4 40 mg of Reference Example Product 4 was mixed with 97 g of 10% reduced skim milk powder, and after heat sterilization at 93 ° C. for 6 minutes, 3 g of starter culture was added, fermented according to a conventional method, and fermented milk (Example Product 4 )
  • the obtained fermented milk contains 2.4 mg / 100 g of angiogenin and / or angiogenin degradation product, and the mass ratio of cystatin and / or cystatin degradation product to angiogenin and / or angiogenin degradation product is 0.39.
  • Example Product 5 40 mg of Reference Example Product 5 was mixed with 97 g of 10% reduced skim milk powder, and after heat sterilization at 93 ° C. for 6 minutes, 3 g of starter culture was added and fermented according to a conventional method to produce fermented milk (Example Product 5). ) The obtained fermented milk contains 2.3 mg / 100 g of angiogenin and / or angiogenin degradation product, and the mass ratio of cystatin and / or cystatin degradation product to angiogenin and / or angiogenin degradation product is 0.4.
  • Example product 6 50 mg of Reference Example 4 was mixed with 98 g of 2.5% reduced skim milk powder sterilized by heating at 100 ° C. for 10 minutes, 2 g of starter culture was added, fermented according to a conventional method, and sterilized by heating at 130 ° C. for 2 seconds. Then, it cooled to 10 degreeC and fermented milk (Example product 6) was obtained. The obtained fermented milk contains 2.9 mg / 100 g of angiogenin and / or angiogenin degradation product, and the mass ratio of cystatin and / or cystatin degradation product to angiogenin and / or angiogenin degradation product is 0.32.

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Abstract

　安全で、日常的に摂取することにより、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である新規発酵乳類を提供することを課題とする。アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を０．９～１５０ｍｇ／１００ｇ含有し、かつ、シスタチン及び／又はシスタチン分解物をアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対して、質量比０．００６～１．７の範囲で含有する発酵乳類。このような発酵乳類を摂取することにより、骨を強化することができ、特に骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防ならびに治療に役立てることができる。

Description

発酵乳類及びその製造方法
　本発明は、新規な発酵乳類及びその製造方法に関する。本発明の発酵乳類は、特定の乳成分を含有することにより、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である。
　近年、世界的規模で、高齢化等に伴い、骨粗鬆症や骨折あるいは腰痛などの種々の骨に関連する疾患が増加しており、大きな社会問題となっている。これは、カルシウムの摂取不足やカルシウム吸収能力の低下、閉経後のホルモンのアンバランスなどが原因であるとされている。骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防するためには、若齢期から骨芽細胞による骨形成を促進して体内の骨量をできるだけ増加させ、最大骨量や骨強度（骨密度＋骨質）を高めることが有効であるとされている。なお、骨質とは、骨の微細構造や代謝回転、微小骨折、石灰化を指すものである。また、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防する方法としては、破骨細胞による骨吸収を抑制することも考えられる。骨はバランスのとれた吸収と形成を絶えず繰り返している（リモデリング）が、閉経後のホルモンバランスの変化等により、骨吸収が骨形成を上回り、これが骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の原因となる。したがって、破骨細胞による骨吸収を抑制して骨強度を一定に保つことにより、結果的に骨を強化することが可能である。
　このような現状から、骨を強化する目的で、炭酸カルシウムやリン酸カルシウム、乳酸カルシウムなどのカルシウム塩ならびに乳清カルシウムや牛骨粉、卵殻などの天然カルシウム剤を、それぞれ単独で医薬品や飲食品、飼料などに添加したものが摂取されている。又は、これらのカルシウム剤をカゼインホスホペプチドやオリゴ糖などのカルシウム吸収促進効果を有する物質と共に医薬品や飲食品、飼料などに添加したものが摂取されている。しかしながら、これらのカルシウム塩や天然カルシウム剤を飲食品に添加したものを摂取した場合のカルシウムの吸収率は５０％以下であり、多くのカルシウムは吸収されずに体外に排出されてしまうといわれている。また、体内に吸収されたカルシウムであっても、その形態や同時に摂取される他の栄養成分の種類によって骨への親和性が異なるので、必ずしも骨代謝の改善や骨強化の作用を示さないこともある。その他、骨粗鬆症治療や骨強化のための医薬として、女性ホルモン製剤や活性型ビタミンＤ３製剤、ビタミンＫ２製剤、ビスフォスフォネート製剤、カルシトニン製剤などが知られており、抗ＲＡＮＫＬ抗体などの新薬開発が進められている。しかし、これらの医薬品を用いた場合、耳鳴り、頭痛、食欲不振などの副作用を伴うことがある。さらに、これらの物質は安全性及びコストなどの面から、現在のところ飲食品に添加することができない状況にある。一方、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の疾病の性質から、長期的に経口摂取することができ、骨形成促進的及び骨吸収抑制的に作用して骨強度を高め、その予防または治療効果が期待できるような飲食品の開発が望まれている。
特開平８－１５１３３１号公報 特開平１０－７５８５号公報 特開２０００－２８１５８７号公報
　本発明は、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用な発酵乳類を提供することを課題とする。
　本発明者らは、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を含有し、かつ、シスタチン及び／又はシスタチン分解物をアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対して特定の範囲の質量比で含有する発酵乳類を摂取することによって、効果的に骨密度を高める作用が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、以下の構成からなるものである。
（１）アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を０．９ｍｇ～１５０ｍｇ／１００ｇ含有し、かつ、シスタチン及び／又はシスタチン分解物をアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対して質量比が０．００６～１．７の範囲で含有する発酵乳類。
（２）（１）記載の発酵乳類を１００ｇ／日以上摂取する骨疾患の予防方法。
（３）アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物とシスタチン及び／又はシスタチン分解物を乳原料に添加し、殺菌した後、発酵させる工程を含む上記（１）記載の発酵乳類の製造方法。
（４）殺菌した乳原料にアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物とシスタチン及び／又はシスタチン分解物を添加して、発酵させる工程を含む上記（１）記載の発酵乳類の製造方法。
　本発明の発酵乳類は、骨を強化する作用を有し、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である。
　本発明の発酵乳類の特徴は、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を特定の範囲の量で含有し、かつ、特定の範囲の質量比でアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物とシスタチン及び／又はシスタチン分解物を含有することにある。
　一般に発酵乳類中には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物は０．２～０．８ｍｇ／１００ｇ程度、シスタチン及び／又はシスタチン分解物は０．４～１．１ｍｇ／１００ｇ程度含まれている。
　これに対し、本発明の発酵乳類は、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物とシスタチン及び／又はシスタチン分解物を添加して、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を０．９ｍｇ～１５０ｍｇ／１００ｇ含有し、かつ、シスタチン及び／又はシスタチン分解物をアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対する質量比が０．００６～１．７の範囲で含有するものである。
　本発明の発酵乳類に含有されるアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物やシスタチン及び／又はシスタチン分解物としては、ヒト、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ等の哺乳類の乳から調製されるアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を含む画分、シスタチン及び／又はシスタチン分解物を含む画分や、遺伝子工学的手法により生産されるこれらの画分、血液や臓器から精製されたアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物、シスタチン及び／又はシスタチン分解物等が使用可能である。また、精製され、市販されているアンジオジェニンやシスタチンの試薬を用いることも可能である。
　また、上述のアンジオジェニン含む画分、アンジオジェニンの試薬やシスタチンを含む画分、シスタチンの試薬等をそれぞれ１種類以上のタンパク質分解酵素で分解したアンジオジェニン分解物やシスタチン分解物を含有させることも可能である。
　一方、乳、または脱脂乳や乳清などの乳由来の原料から直接、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物とシスタチン及び／又はシスタチン分解物を含む画分を抽出して調製したタンパク質素材を含有させることも可能である。このようなタンパク質素材は、例えば、乳又は乳原料を陽イオン交換樹脂と接触させた後、その樹脂に吸着した乳由来タンパク質を０．１～２．０Ｍの塩濃度で溶出して、逆浸透膜や電気透析膜、限外濾過膜、精密濾過膜などにより脱塩、濃縮した後、必要に応じて、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で分子量が８，０００以下となるように分解することにより調製することができる。なお、タンパク質分解酵素で分解する場合は、分子量の下限は５００以上とすることが好ましい。また、このようにして得られたタンパク質素材は、凍結乾燥や噴霧乾燥などにより乾燥することも可能であり、乾燥したものを発酵乳類に含有させてもよい。
　本発明では、上述したアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物、シスタチン及び／又はシスタチン分解物、これらを含むタンパク質素材等を乳原料に添加し、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を０．９ｍｇ～１５０ｍｇ／１００ｇ含有させ、かつ、シスタチン及び／又はシスタチン分解物を、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対する質量比が０．００６～１．７の範囲で含有させる。
　後の試験例で示すが、上述のようにアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物、シスタチン及び／又はシスタチン分解物を含有させることにより、各々の成分を単独で摂取するよりも効果的に骨強化作用を得ることができる。
　本発明の発酵乳類は、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物、シスタチン及び／又はシスタチン分解物を特定量で含有させること以外は特に制限はなく、一般的な方法に従って製造すればよい。本発明によって製造される発酵乳類は、発酵乳や乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料等のすべての発酵乳類である。例えば、乳原料を必要に応じて混合し、これにアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を特定量の範囲となるように配合し、かつ、シスタチン及び／又はシスタチン分解物をアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対し特定の範囲の質量比となるように添加して調製する。ここで、乳原料には、牛乳、脱脂濃縮乳、脱脂粉乳、ホエイ、バター、クリーム等に加え、これらを必要に応じて混合した乳飲料、加工乳、成分調整牛乳、低脂肪牛乳、無脂肪牛乳等が含まれる。その後、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）やストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒｉ）等の乳酸菌類やクルイベロミセス・マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ）やサッカロマイセス・ユニスポラス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）等の酵母類を接種して発酵させて調製したスターターカルチャーをこれに適量接種した後、常法に従って発酵させることで、本発明の発酵乳類を調製することができる。また、発酵させた後に殺菌することができる。
　乳原料に添加する場合、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物やシスタチン及び／又はシスタチン分解物は、未殺菌の乳原料に添加しても、殺菌した乳原料に添加しても良い。未殺菌の乳原料に添加する場合には、添加後殺菌を行う。殺菌は加熱殺菌により行うことが好ましい。但し、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物やシスタチン及び／又はシスタチン分解物を乳原料に添加した後に加熱殺菌を行う場合には、１３０℃で２秒間以下とすることが好ましい。
　なお、本発明の発酵乳類には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物やシスタチン及び／又はシスタチン分解物以外に、上述した乳原料のほか、糖類や脂質、タンパク質、ビタミン類、ミネラル類、フレーバー等、飲食品に通常使用する原材料等も配合することが可能であり、他の骨強化作用を示す成分、例えばカルシウムやビタミンＤ、ビタミンＫ、イソフラボン等を配合することも可能である。
　本発明の発酵乳類は、後述する実験動物での試験において、体重１ｋｇあたり１００ｇ以上経口摂取させることにより、骨を強化することができる。この実験動物における摂取量は、血中薬物濃度において、成人一人あたりの摂取量に該当することから（中島　光好　（１９９３）　「第８巻　薬効評価」　廣川書店　２－１８頁）、通常、成人一人一日あたり、本発明の発酵乳類を１００ｇ以上摂取することにより骨を強化することができ、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療の効果が特に期待できる。
　以下に、参考例、実施例及び試験例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、これらは例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
［参考例１］
（アンジオジェニン画分の調製１）
　陽イオン交換樹脂であるスルホン化キトパール（富士紡績社製）３０ｋｇを充填したカラムを脱イオン水で十分に洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳１，０００Ｌ（ｐＨ６．７）を通液した。次に、このカラムを脱イオン水で十分洗浄した後、０．１～２．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。そして、アンジオジェニンを含有する溶出画分をＳ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陽イオン交換クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス社製）で分画し、得られたアンジオジェニン含有画分を９０℃で１０分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱を除去した。さらに、このアンジオジェニン含有画分をＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した。この溶出液を逆浸透膜により脱塩した後、凍結乾燥してアンジオジェニンの純度が９０％のアンジオジェニン画分１６．５ｇを得た。これら一連の処理を３０回繰り返した。
［参考例２］
（アンジオジェニン画分の調製２）
　ヘパリンアフィニティセファロース（ＧＥヘルスケア社製）１０ｋｇを充填したカラムを脱イオン水で十分に洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳５００Ｌ（ｐＨ６．７）を通液した。次に、このカラムを０．５Ｍの塩化ナトリウム溶液で十分洗浄した後、１．５Ｍの塩化ナトリウム溶液で溶出した。そして、この溶出液を逆浸透膜により脱塩した後、凍結乾燥してアンジオジェニンの純度が５％のアンジオジェニン画分１８ｇを得た。これら一連の処理を５０回繰り返した。
［参考例３］
（シスタチン画分の調製）
　５％乳清タンパク質溶液１００，０００Ｌを９０℃で１０分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱を除去した。さらに、カルボキシメチル化パパインをトレシルトヨパール（Ｔｒｅｓｙｌ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、東ソー社製）に結合させた担体をカラムに充填後、０．５Ｍの塩化ナトリウム溶液で平衡化し、先の乳清タンパク質溶液を通液した。通液後、０．５Ｍの塩化ナトリウム溶液と０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む０．５Ｍの塩化ナトリウム溶液で順次カラムを洗浄した。次いで、２０ｍＭ酢酸－０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液でシスタチン含有画分を溶出させた。この溶出画分を直ちに１Ｍの水酸化ナトリウム溶液で中和した。この溶出液を逆浸透膜により脱塩した後、凍結乾燥してシスタチンの純度が９０％のシスタチン画分９．６ｇを得た。これら一連の処理を２０回繰り返した。
（発酵乳類に含まれるアンジオジェニン及びシスタチンの測定）
　発酵乳類に含まれるアンジオジェニンやアンジオジェニン分解物ならびにシスタチンやシスタチン分解物の測定は、特開２００８－１６４５１１号公報の方法を改変して実施した。即ち、超純水５ｍｌに発酵乳類８６μｌを加え、これに１／１，０００量のギ酸を添加し、試料溶液とした。この溶液１０μｌをドライアップした後、８Ｍ尿素および１ｍＭトリス（カルボキシエチル）フォスフィン（ＴＣＥＰ）を含む０．１Ｍ重炭酸アンモニウム２０μｌに溶解し、５６℃で３０分間加温した。室温に戻した後、１００ｍＭヨードアセトアミド溶液５μｌを添加して、遮光下で３０分反応させた。これに、５４μｌの超純水を添加後、０．１μｇ／ｍｌトリプシン１０μｌおよび０．１μｇ／ｍｌリシルエンドペプチダーゼ１０μｌを添加して、３７℃で１６時間反応させた。その後、３μｌのギ酸を添加して、反応を停止し、測定試料用ペプチド溶液とした。各試料溶液を１０ｆｍｏｌ／μｌの内部標準ペプチド溶液（含０．１％ギ酸、０．０２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２％アセトニトリル）で６倍に希釈し、希釈した溶液２．５μｌをＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて分析を行った。
　ペプチドの分離は、ＨＰＬＣシステムを用いてグラジェント溶出した。すなわち、カラム５μｌペプチドトラップつきＭＡＧＩＣ　Ｃ１８　０．２ｍｍＩＤ×５０ｍｍを用い、流速は２μｌ／ｍｉｎでＭＡＧＩＣ２００２のＨＰＬＣシステムを用いて行った。ＨＰＬＣの溶媒には、Ａ溶液：２％アセトニトリル－０．０５％ギ酸とＢ溶液：９０％アセトニトリル－０．０５％ギ酸を用いた。溶出条件は、Ｂ溶液を２％から６５％まで２０分間かけてグラジェント溶出させた。
　シスタチンの測定対象イオンは、ペアレントイオンがＮＨ２－ＱＶＶＳＧＭＮＹＦＬＤＶＥＬＧＲ－ＣＯＯＨでｍ／ｚ　９１４．４、ＭＳ／ＭＳターゲットイオンがＮＨ２－ＦＬＤＶＥＬＧＲ－ＣＯＯＨでｍ／ｚ　９４８．７、アンジオジェニンの測定対象イオンは、ペアレントイオンがＮＨ２－ＹＩＨＦＬＴＱＨＹＤＡＫ－ＣＯＯＨでｍ／ｚ　７６８．８、ＭＳ／ＭＳターゲットイオンがＮＨ２－ＦＬＴＱＨＹＤＡＫ－ＣＯＯＨでｍ／ｚ　１１２２．８で測定した。内部標準ペプチドは、ペアレントイオンがＮＨ２－ＥＴＴＶＦＥＮＬＰＥＫ－ＣＯＯＨ（但し、Ｐの炭素はＣ１３、窒素はＮ１５で標識）でｍ／ｚ　６５６．９であり、ＭＳ／ＭＳのターゲットイオンは、ＮＨ２－ＦＥＮＬＰＥＫ－ＣＯＯＨ（但し、Ｐの炭素はＣ１３、窒素はＮ１５で標識）でｍ／ｚ　８８２．４で行った。
　ＭＳにはＬＣＱ　Ａｄｖａｎｔａｇｅを用いた。得られたクロマトグラムから各タンパク質のピーク面積を求め、内部標準ペプチドとの比から濃度を求めた。
　１００℃にて１０分間加熱殺菌した１０％の還元脱脂粉乳にスターターカルチャーを添加したもの１００ｇに参考例１のアンジオジェニン画分１６６ｍｇと参考例３のシスタチン画分０．５ｍｇを混合し、常法に従って発酵させて、発酵乳類（実施例品１）を得た。得られた発酵乳類には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物が１５０ｍｇ／１００ｇ含まれており、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対するシスタチン及び／又はシスタチン分解物の質量比は０．００６であった。
　１００℃にて１０分間加熱殺菌した１０％の還元脱脂粉乳にスターターカルチャーを添加したもの１００ｇに参考例２のアンジオジェニン画分１３．５ｍｇと参考例３のシスタチン画分１．２ｍｇを混合し、常法に従って発酵させて、発酵乳類（実施例品２）を得た。得られた発酵乳類には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物が０．９ｍｇ／１００ｇ含まれており、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対するシスタチン及び／又はシスタチン分解物の質量比は１．７であった。
　１００℃にて１０分間加熱殺菌した１０％の還元脱脂粉乳にスターターカルチャーを添加したもの１００ｇに参考例１のアンジオジェニン画分１３．５ｍｇと参考例３のシスタチン画分１．２ｍｇを混合し、常法に従って発酵させて、発酵乳類（実施例品３）を得た。得られた発酵乳類には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物が１２．４ｍｇ／１００ｇ含まれており、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対するシスタチン及び／又はシスタチン分解物の質量比は０．１２であった。
［比較例１］
　１００℃にて１０分間加熱殺菌した１０％の還元脱脂粉乳にスターターカルチャーを添加したもの１００ｇに参考例２のアンジオジェニン画分１２ｍｇと参考例３のシスタチン画分２．７ｍｇを混合し、常法に従って発酵させて、発酵乳類（比較例品１）を得た。得られた発酵乳類には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物が０．９ｍｇ／１００ｇ含まれており、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対するシスタチン及び／又はシスタチン分解物の質量比は３．２であった。
［比較例２］
　１００℃にて１０分間加熱殺菌した１０％の還元脱脂粉乳にスターターカルチャーを添加したもの１００ｇに参考例１のアンジオジェニン画分１６６ｍｇと参考例３のシスタチン画分０．２５ｍｇを混合し、常法に従って発酵させて、発酵乳類（比較例品２）を得た。得られた発酵乳類には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物が１５０ｍｇ／１００ｇ含まれており、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対するシスタチン及び／又はシスタチン分解物の質量比は０．００４５であった。
［試験例１］
　実施例品１～３および比較例品１、２の骨強化作用を動物実験により調べた。実験には５週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪ系雄マウスを用いた。１週間の予備飼育の後、マウスを１０匹ずつ６群に分け、実施例品１～３と比較例品１、２をマウス体重１ｋｇあたり、それぞれ１日当り１００ｇになるよう１日２回ゾンデで経口投与して２週間飼育した。また、実施例品１～３および比較例品１、２を投与しないものを対照群とした。投与終了後（２週目）に、マウスの右脛骨の骨密度をマイクロＣＴ（（株）リガク製）により測定した。その結果を表１に示す。表１に示したように、実施例品１～３を２週間経口投与した群では、対照群または比較例品１、２を投与した群に比較して、骨密度が有意に上昇した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［参考例４］
　陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール（富士紡績社製）４００ｇを充填したカラム（直径４ｃｍ×高さ３０ｃｍ）を脱イオン水で十分洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳（ｐＨ６．７）４０Ｌを流速２５ｍｌ／ｍｉｎで通液した。通液後、このカラムを脱イオン水で十分洗浄し、０．７８Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）で樹脂に吸着したタンパク質を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透膜により脱塩した後、凍結乾燥して粉末状のタンパク質素材１８ｇを得た（参考例品４）。
［参考例５］
　参考例品４のタンパク質素材４ｇを水８００ｍｌに溶解し、最終濃度が０．０３重量％となるようタンパク質分解酵素であるトリプシン（シグマ社製）を加え、３７℃で８時間酵素処理した。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥して粉末状のタンパク質素材３．０ｇを得た（参考例品５）。
　１０％の還元脱脂粉乳９７ｇに参考例品４を４０ｍｇ混合し、９３℃にて６分間加熱殺菌した後、スターターカルチャー３ｇを添加し、常法に従って発酵させて、発酵乳類（実施例品４）を得た。得られた発酵乳類には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物が２．４ｍｇ／１００ｇ含まれており、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対するシスタチン及び／又はシスタチン分解物の質量比は０．３９であった。
　１０％の還元脱脂粉乳９７ｇに参考例品５を４０ｍｇ混合し、９３℃にて６分間加熱殺菌した後、スターターカルチャー３ｇを添加し、常法に従って発酵させて、発酵乳類（実施例品５）を得た。得られた発酵乳類には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物が２．３ｍｇ／１００ｇ含まれており、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対するシスタチン及び／又はシスタチン分解物の質量比は０．４であった。
［比較例３］
　１０％の還元脱脂粉乳９７ｇに参考例品４を３０ｍｇと参考例３のシスタチン画分を１０ｍｇ混合し、９３℃にて６分間加熱殺菌した後、スターターカルチャー３ｇを添加し、常法に従って発酵させて、発酵乳類（比較例品３）を得た。得られた発酵乳類には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物が１．９ｍｇ／１００ｇ含まれており、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対するシスタチン及び／又はシスタチン分解物の質量比は５．２であった。
[規則91に基づく訂正 12.07.2013]　
［試験例２］
　実施例品４、５および比較例品３の骨強化作用について動物実験により調べた。実験には５１週齢のＳＤ系雌ラット４０匹を用いた。ラットを８匹ずつ５群に分け、４群は卵巣摘出手術を施し、残りの１群は疑似手術を施した。４週間の回復期間を設け、卵巣摘出手術を施したラットに実施例品４、５および比較例品３をラット体重１ｋｇあたり、それぞれ１日当り１００ｇになるよう１日６回ゾンデで経口投与して１６週間飼育した。実施例品４、５および比較例品３を投与しないものを対照群とした。また、４週間の回復期間の後、疑似手術を施したラットも対照群と同様に１６週間飼育した。投与終了後（１６週目）に、ラットの右大腿骨の骨密度をマイクロＣＴ（（株）リガク製）により測定した。その結果を表２に示す。表２に示したように、実施例品４、５を１６週間経口投与した群では、対照群または比較例品３を投与した群に比べ、骨密度が有意に上昇し、その値は疑似手術群に近いレベルであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　１００℃にて１０分間加熱殺菌した２．５％の還元脱脂粉乳９８ｇに参考例品４を５０ｍｇ混合し、スターターカルチャー２ｇを添加し、常法に従って発酵させ、１３０℃で２秒間、加熱殺菌した後、１０℃まで冷却し、発酵乳類（実施例品６）を得た。得られた発酵乳類には、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物が２．９ｍｇ／１００ｇ含まれており、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対するシスタチン及び／又はシスタチン分解物の質量比は０．３２であった。

Claims (4)

  1. アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を０．９～１５０ｍｇ／１００ｇ含有し、かつ、シスタチン及び／又はシスタチン分解物をアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物に対して質量比が０．００６～１．７の範囲で含有する発酵乳類。
  2. 請求項１記載の発酵乳類を１００ｇ／日以上摂取する骨疾患の予防方法。
  3. アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物とシスタチン及び／又はシスタチン分解物を乳原料に添加し、殺菌した後、発酵させる工程を含む請求項１記載の発酵乳類の製造方法。
  4. 殺菌した乳原料にアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物とシスタチン及び／又はシスタチン分解物を添加して、発酵させる工程を含む請求項１記載の発酵乳類の製造方法。
     
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