CN103893135B - 一种人血浆蛋白c的冻干稳定剂组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物，它是乳糖、甘露醇、海藻糖、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸以及它们的盐中的任意一种或者任意两种以上的组合。本发明稳定剂可以有效保护蛋白C，制得的蛋白C制剂的外观成型好，蛋白Ｃ活性损失小，回收率高，具有良好的临床应用前景。

Description

一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物及其用途

技术领域

本发明涉及血浆制品领域，具体涉及人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物及其用途。

背景技术

人血浆蛋白C，又称蛋白C（protein C，PC）是一种分子量约为62kD的糖蛋白，在血浆中含量约为2-6mg/L。PC是一种维生素K依赖性血浆蛋白，与其他维生素K依赖的蛋白质(如凝血因子II、VII、IX和X)理化性质相似，通过灭活凝血因子Va、VIIIa，增高纤溶酶原激活因子，从而维持血液凝血和纤溶系统的动态平衡。由PC及其辅助因子，抑制因子组成的PC系统，目前已确认为机体抗凝血机制的一个重要调节系统，在抗血栓性疾病中起着重要作用。目前，蛋白C主要从血浆中分离纯化而制得。

人蛋白C在常温条件下易变性失活，因此该制品为了便于保存、运输，在制备过程中需冷冻干燥处理成为粉针制剂。人血浆蛋白C浓缩物制品中，蛋白C纯度较高，蛋白含量相对较少，在制品的冷冻过程中，溶液中不断产生冰晶，使制品盐离子浓度迅速增加，并引起制品内部pH的变化会损伤目的蛋白质的活性；在干燥过程中，制品溶液向玻璃态转变或呈玻璃态、蛋白质结合水的去除等因素也容易引起蛋白质结构的变化从而变性，导致蛋白C的活性降低。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物及其用途。

本发明人血浆蛋白C的冻干稳定组合物，它是乳糖、甘露醇、海藻糖、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸以及它们的盐中的任意一种或者任意两种以上的组合。

其中，所述组合物包括如下重量配比的成分：

乳糖 3～5份

甘露醇、海藻糖、精氨酸或天冬氨酸 2～10份。

优选地，所述组合物由如下重量配比的成分组成：

乳糖 4份

甘露醇、海藻糖、精氨酸或天冬氨酸 4份或8份。

其中，所述组合物包括如下重量配比的成分：

甘露醇 2～10份

组氨酸或精氨酸 2～10份。

优选地，它由如下重量配比的成分组成：

甘露醇 4份或8份

组氨酸或精氨酸 8份。

其中，所述组合物包括如下重量配比的成分：

甘露醇 3～5份

组氨酸 3～5份

精氨酸 3～5份。

优选地，它由如下重量配比的成分组成：

甘露醇 4份

组氨酸 4份

精氨酸 4份。

其中，所述组合物包括如下重量配比的成分：

海藻糖 3～5份

组氨酸或精氨酸 6～10份。

优选地，所述组合物由如下重量配比的成分组成：

海藻糖 4份

组氨酸或精氨酸 8份。

其中，所述组合物包括如下重量配比的成分：

精氨酸 3～5份

组氨酸 3～5份

天冬氨酸 3～5份。

优选地，所述由如下重量配比的成分：

精氨酸 4份

组氨酸 4份

天冬氨酸 4份。

本发明还提供了一种人血浆蛋白C稳定剂，以前述组合物为活性成分，加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

本发明制备权利要求前述的人血浆蛋白C稳定剂的方法，步骤如下：按照前述配比，取原料，加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分，混匀，即可。

本发明还提供了一种制备人血浆蛋白C制剂的方法，它包括如下步骤：

（1）取去冷沉淀上清，分离纯化得人血浆蛋白C溶液；

（2）在步骤（1）所得溶液中加入前述稳定剂，除菌、分装、冻干，即得。

去冷沉淀血浆（Cryoprecipitate-reduced plasma，CRP）是新鲜冰冻血浆（Freshfrozen plasma，FFP）在一定温度条件下制备冷沉淀时分离所得的上清血浆。

步骤（2）中，所述稳定剂的终浓度为0.4～1.2%（w/w）。

步骤（2）中，所述冻干是在-40℃～30℃下冷冻干燥50h。

本发明还提供了前述方法制备的人血浆蛋白C制剂。

本发明稳定剂可以有效维持冷冻干燥过程人血浆蛋白C的活性，提高制品外观和成型，制得的蛋白C制剂的外观成型好，蛋白Ｃ活性损失小，回收率高到93％以上，具有良好的临床应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是蛋白Ｃ浓缩物制品在冷冻干燥过程中温度与时间的变化曲线。横坐标代表冷冻干燥过程的时间（ｈ），纵坐标代表冷冻干燥过程的温度（℃），曲线代表随着冷冻干燥时间的推移冷冻干燥温度的变化。

具体实施方式

实施例1本发明人血浆蛋白C制剂的制备

1、制备方法

Ⅰ、人蛋白Ｃ浓缩物制备

（1）人去冷沉淀血浆的制备

符合药典要求的人新鲜冰冻血浆约1000L（重量约为1000kg），用酒精消毒血浆袋后，注射用水在0-5℃融化血浆。离心除去冷沉淀的血浆备用。

（2）凝胶吸附、纯化

①DEAE Sephadex A50吸附：将2kg的DEAE Sephadex A50凝胶干粉充分溶胀，用平衡液（0.015M柠檬酸钠，0.08M氯化钠，pH7.3）平衡5次，每次60L，然后加入步骤（1）中得到的去冷沉淀血浆，在2-8℃搅拌吸附30分钟，上清液并入血浆罐，收集凝胶。

②洗涤：分别用60L pH7.3的含0.015M柠檬酸钠，0.20M氯化钠的洗涤液洗涤凝胶3次，每次搅拌30分钟。

③洗脱：分别用60L pH7.3的含0.015M柠檬酸三钠，0.5M氯化钠的洗脱液洗脱凝胶2次，每次搅拌20分钟。将两次洗脱得到的蛋白洗脱液混合置于洁净的容器中。

（3）超滤、透析

对步骤（2）中所得蛋白洗脱液用10kD孔径超滤膜超滤、透析，使最终得到的浓缩液的电导为5mS/cm。

（4）S/D病毒灭活

将步骤（3）的浓缩液（40L，即40kg），然后按10:1（w/w）比例缓慢加入S/D溶液（3.3%的磷酸三丁酯和11%的Tween80）4kg，搅拌均匀，24-26℃连续搅拌6小时（转速：100转/分钟），每1小时记录温度一次。

（5）肝素亲和层析

用0.45μm膜过滤经S/D灭活后的蛋白溶液，然后泵入肝素亲和层析柱（柱高20cm，底面直径450mm）中进行亲和层析。经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到蛋白C原液，其中层析温度范围为2～10℃，线流速113cm/h（体积流速为180升/小时）。

①平衡：用120升平衡液（0.008M柠檬酸钠，pH5.8，电导约4mS/cm）对肝素亲和胶进行平衡；

②上样：将步骤（4）S/D病毒灭活所得蛋白溶液用0.45μm膜过滤，泵入层析柱中；

③洗涤：用160升洗涤液（0.008M柠檬酸钠，0.08M氯化钠，pH5.8，电导约为8mS/cm）对肝素亲和层析柱进行洗涤，观察在线紫外吸收线，至紫外吸收线趋于基线时停止洗涤；

④洗脱：对肝素亲和层析柱进行洗脱（0.008M柠檬酸钠，0.16M氯化钠，pH5.8电导为15mS/cm），观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液（40升），即为蛋白Ｃ原液。

（6）超滤、透析

对步骤（5）中所得蛋白Ｃ原液用10kD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0.15M，并适当浓缩使每毫升溶液中的蛋白C活性单位大于30IU，得到蛋白C浓缩物。

Ⅱ、添加冷冻干燥稳定剂，并冷冻干燥

按表1～表3的种类和浓度加保护剂，测定pH，并用0.1mol/L-1mol/L的HCl或NaOH溶液调pH至6.8-7.5，除菌过滤、无菌分装后，-40℃至30℃条件冷冻干燥50h。

观测成品的外观，检测其复溶时间和澄清度，检测蛋白Ｃ的活性回收率。

2、检测结果

（1）冷冻干燥后人蛋白C浓缩物制品成型外观结果见表1：

表1含不同稳定剂的人蛋白C浓缩物制品成型外观

从表1可以看出，冷冻干燥后，未添加稳定剂的空白对照组，外形有轻微萎缩，成型较差，而添加本发明稳定剂的制品，萎缩程度和成型度均有改善，说明本发明的稳定剂能有效支撑其制品外形。

（2）复溶时间及澄清度

室温条件下，注射用水溶解冻干制品，观察并记录其复溶时间，室温放置20min后观察澄清度，结果见表2。

表2不同稳定剂和稳定剂的制品复溶时间及澄清度

从表2可以看出，冷冻干燥后，未添加稳定剂的空白对照组，复溶的时间小于120s，但是复溶后溶液有轻微浑浊，而添加本发明稳定剂的制品，复溶时间小于120s，甚至小于60s，并且，复溶后溶液澄清，说明稳定剂能有效保护蛋白Ｃ。

（3）活性回收率

冷冻干燥的人蛋白Ｃ浓缩物制品复溶后，发色底物法检测蛋白Ｃ活性，结果见表3。

表3不同稳定剂的制品的蛋白Ｃ活性回收率

从表3可以看出，冷冻干燥后，未添加稳定剂的空白对照制品，蛋白C的活性回收率不到88%，而添加了本发明稳定剂的制品，蛋白C活性回收率达到93%以上，说明本发明的稳定剂能有效地保护冷冻干燥过程中蛋白Ｃ的活性。

其中，单独使用甘露醇、精氨酸和组氨酸时，蛋白C的活性回收率为98.7%、98.4%和98.7%，而相同剂量下，将甘露醇、精氨酸与组氨酸组合使用时，蛋白C的活性回收率高达101.7%，比三者单独使用高了2.7～3.4%。实验结果说明，相同剂量下，将甘露醇、精氨酸与组氨酸组合使用时，蛋白C的活性回收率显著优于三者单独使用，三者组合使用发挥了协同增效的作用。

血浆资源非常有限，具有稀缺和不可替代的特性，人血浆蛋白C制品的分离纯化又较难，国内暂无上市的人血浆蛋白C制品，国外有相关产品，但是价格非常昂贵，如英国在售的baxter公司的人血浆蛋白C制品每500IU/瓶的价格高达1000英镑。

通常，每1吨血浆（约含1×10⁶IU人血蛋白C）可以制备得到约1×10⁵IU人血浆蛋白C。

因此，若活性回收率提高2.7～3.4%，则每1吨血浆可以多得到2.7～3.4×10³IU人血浆蛋白C，也就是说，每1吨血浆的经济效益就可以提高5400～6800英镑（即人民币55334～69680元），取得了商业上的成功。

综上，在人血浆蛋白C制品的冷冻干燥的制备过程中，添加本发明稳定剂可以有效维持人血浆蛋白C的活性，提高制品外观和成型，其中，将甘露醇、精氨酸与组氨酸组合使用时，三者可以发挥协同增效的作用。

Claims (8)

1.一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物，其特征在于：它由如下重量配比的成分组成：

甘露醇 3～5份

组氨酸 3～5份

精氨酸 3～5份。

2.根据权利要求1所述的稳定剂组合物，其特征在于：它由如下重量配比的成分组成：

甘露醇 4份

组氨酸 4份

精氨酸 4份。

3.一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂，其特征在于：它是以权利要求1或2所述组合物为活性成分，加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

4.一种制备权利要求3所述的人血浆蛋白C稳定剂的方法，其特征在于：步骤如下：按照权利要求1或2所述配比，取原料，加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分，混匀，即可。

5.一种制备人血浆蛋白C制剂的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)取去冷沉淀血浆，分离纯化得人血浆蛋白C溶液；

(2)在步骤(1)所得溶液中加入权利要求3所述的稳定剂，除菌、分装、冻干，即得。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述稳定剂的终浓度为0.4～1.2％(w/w)。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述冻干是在-40℃～30℃下冷冻干燥50h。

8.权利要求5～7任意一项所述方法制备的人血浆蛋白C制剂。