CN103893135A - 一种人血浆蛋白c的冻干稳定剂组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物,它是乳糖、甘露醇、海藻糖、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸以及它们的盐中的任意一种或者任意两种以上的组合。本发明稳定剂可以有效保护蛋白C,制得的蛋白C制剂的外观成型好,蛋白C活性损失小,回收率高,具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及血浆制品领域,具体涉及人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物及其用途。
背景技术
人血浆蛋白C,又称蛋白C(protein C,PC)是一种分子量约为62kD的糖蛋白,在血浆中含量约为2-6mg/L。PC是一种维生素K依赖性血浆蛋白,与其他维生素K依赖的蛋白质(如凝血因子II、VII、IX和X)理化性质相似,通过灭活凝血因子Va、VIIIa,增高纤溶酶原激活因子,从而维持血液凝血和纤溶系统的动态平衡。由PC及其辅助因子,抑制因子组成的PC系统,目前已确认为机体抗凝血机制的一个重要调节系统,在抗血栓性疾病中起着重要作用。目前,蛋白C主要从血浆中分离纯化而制得。
人蛋白C在常温条件下易变性失活,因此该制品为了便于保存、运输,在制备过程中需冷冻干燥处理成为粉针制剂。人血浆蛋白C浓缩物制品中,蛋白C纯度较高,蛋白含量相对较少,在制品的冷冻过程中,溶液中不断产生冰晶,使制品盐离子浓度迅速增加,并引起制品内部pH的变化会损伤目的蛋白质的活性;在干燥过程中,制品溶液向玻璃态转变或呈玻璃态、蛋白质结合水的去除等因素也容易引起蛋白质结构的变化从而变性,导致蛋白C的活性降低。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物及其用途。
本发明人血浆蛋白C的冻干稳定组合物,它是乳糖、甘露醇、海藻糖、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸以及它们的盐中的任意一种或者任意两种以上的组合。
其中,所述组合物包括如下重量配比的成分:
乳糖 3~5份
甘露醇、海藻糖、精氨酸或天冬氨酸 2~10份。
优选地,所述组合物由如下重量配比的成分组成:
乳糖 4份
甘露醇、海藻糖、精氨酸或天冬氨酸 4份或8份。
其中,所述组合物包括如下重量配比的成分:
甘露醇 2~10份
组氨酸或精氨酸 2~10份。
优选地,它由如下重量配比的成分组成:
甘露醇 4份或8份
组氨酸或精氨酸 8份。
其中,所述组合物包括如下重量配比的成分:
甘露醇 3~5份
组氨酸 3~5份
精氨酸 3~5份。
优选地,它由如下重量配比的成分组成:
甘露醇 4份
组氨酸 4份
精氨酸 4份。
其中,所述组合物包括如下重量配比的成分:
海藻糖 3~5份
组氨酸或精氨酸 6~10份。
优选地,所述组合物由如下重量配比的成分组成:
海藻糖 4份
组氨酸或精氨酸 8份。
其中,所述组合物包括如下重量配比的成分:
精氨酸 3~5份
组氨酸 3~5份
天冬氨酸 3~5份。
优选地,所述由如下重量配比的成分:
精氨酸 4份
组氨酸 4份
天冬氨酸 4份。
本发明还提供了一种人血浆蛋白C稳定剂,以前述组合物为活性成分,加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
本发明制备权利要求前述的人血浆蛋白C稳定剂的方法,步骤如下:按照前述配比,取原料,加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分,混匀,即可。
本发明还提供了一种制备人血浆蛋白C制剂的方法,它包括如下步骤:
(1)取去冷沉淀上清,分离纯化得人血浆蛋白C溶液;
(2)在步骤(1)所得溶液中加入前述稳定剂,除菌、分装、冻干,即得。
去冷沉淀血浆(Cryoprecipitate-reduced plasma,CRP)是新鲜冰冻血浆(Fresh frozen plasma,FFP)在一定温度条件下制备冷沉淀时分离所得的上清血浆。
步骤(2)中,所述稳定剂的终浓度为0.4~1.2%(w/w)。
步骤(2)中,所述冻干是在-40℃~30℃下冷冻干燥50h。
本发明还提供了前述方法制备的人血浆蛋白C制剂。
本发明稳定剂可以有效维持冷冻干燥过程人血浆蛋白C的活性,提高制品外观和成型,制得的蛋白C制剂的外观成型好,蛋白C活性损失小,回收率高到93%以上,具有良好的临床应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是蛋白C浓缩物制品在冷冻干燥过程中温度与时间的变化曲线。横坐标代表冷冻干燥过程的时间(h),纵坐标代表冷冻干燥过程的温度(℃),曲线代表随着冷冻干燥时间的推移冷冻干燥温度的变化。
具体实施方式
实施例1本发明人血浆蛋白C制剂的制备
1、制备方法
Ⅰ、人蛋白C浓缩物制备
(1)人去冷沉淀血浆的制备
符合药典要求的人新鲜冰冻血浆约1000L(重量约为1000kg),用酒精消毒血浆袋后,注射用水在0-5℃融化血浆。离心除去冷沉淀的血浆备用。
(2)凝胶吸附、纯化
①DEAE Sephadex A50吸附:将2kg的DEAE Sephadex A50凝胶干粉充分溶胀,用平衡液(0.015M柠檬酸钠,0.08M氯化钠,pH7.3)平衡5次,每次60L,然后加入步骤(1)中得到的去冷沉淀血浆,在2-8℃搅拌吸附30分钟,上清液并入血浆罐,收集凝胶。
②洗涤:分别用60L pH7.3的含0.015M柠檬酸钠,0.20M氯化钠的洗涤液洗涤凝胶3次,每次搅拌30分钟。
③洗脱:分别用60L pH7.3的含0.015M柠檬酸三钠,0.5M氯化钠的洗脱液洗脱凝胶2次,每次搅拌20分钟。将两次洗脱得到的蛋白洗脱液混合置于洁净的容器中。
(3)超滤、透析
对步骤(2)中所得蛋白洗脱液用10kD孔径超滤膜超滤、透析,使最终得到的浓缩液的电导为5mS/cm。
(4)S/D病毒灭活
将步骤(3)的浓缩液(40L,即40kg),然后按10:1(w/w)比例缓慢加入S/D溶液(3.3%的磷酸三丁酯和11%的Tween80)4kg,搅拌均匀,24-26℃连续搅拌6小时(转速:100转/分钟),每1小时记录温度一次。
(5)肝素亲和层析
用0.45μm膜过滤经S/D灭活后的蛋白溶液,然后泵入肝素亲和层析柱(柱高20cm,底面直径450mm)中进行亲和层析。经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到蛋白C原液,其中层析温度范围为2~10℃,线流速113cm/h(体积流速为180升/小时)。
①平衡:用120升平衡液(0.008M柠檬酸钠,pH5.8,电导约4mS/cm)对肝素亲和胶进行平衡;
②上样:将步骤(4)S/D病毒灭活所得蛋白溶液用0.45μm膜过滤,泵入层析柱中;
③洗涤:用160升洗涤液(0.008M柠檬酸钠,0.08M氯化钠,pH5.8,电导约为8mS/cm)对肝素亲和层析柱进行洗涤,观察在线紫外吸收线,至紫外吸收线趋于基线时停止洗涤;
④洗脱:对肝素亲和层析柱进行洗脱(0.008M柠檬酸钠,0.16M氯化钠,pH5.8电导为15mS/cm),观察在线紫外吸收图谱,并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液(40升),即为蛋白C原液。
(6)超滤、透析
对步骤(5)中所得蛋白C原液用10kD孔径超滤膜超滤,将盐浓度降至0.15M,并适当浓缩使每毫升溶液中的蛋白C活性单位大于30IU,得到蛋白C浓缩物。
Ⅱ、添加冷冻干燥稳定剂,并冷冻干燥
按表1~表3的种类和浓度加保护剂,测定pH,并用0.1mol/L-1mol/L的HCl或NaOH溶液调pH至6.8-7.5,除菌过滤、无菌分装后,-40℃至30℃条件冷冻干燥50h。
观测成品的外观,检测其复溶时间和澄清度,检测蛋白C的活性回收率。
2、检测结果
(1)冷冻干燥后人蛋白C浓缩物制品成型外观结果见表1:
表1含不同稳定剂的人蛋白C浓缩物制品成型外观
从表1可以看出,冷冻干燥后,未添加稳定剂的空白对照组,外形有轻微萎缩,成型较差,而添加本发明稳定剂的制品,萎缩程度和成型度均有改善,说明本发明的稳定剂能有效支撑其制品外形。
(2)复溶时间及澄清度
室温条件下,注射用水溶解冻干制品,观察并记录其复溶时间,室温放置20min后观察澄清度,结果见表2。
表2不同稳定剂和稳定剂的制品复溶时间及澄清度
从表2可以看出,冷冻干燥后,未添加稳定剂的空白对照组,复溶的时间小于120s,但是复溶后溶液有轻微浑浊,而添加本发明稳定剂的制品,复溶时间小于120s,甚至小于60s,并且,复溶后溶液澄清,说明稳定剂能有效保护蛋白C。
(3)活性回收率
冷冻干燥的人蛋白C浓缩物制品复溶后,发色底物法检测蛋白C活性,结果见表3。
表3不同稳定剂的制品的蛋白C活性回收率
从表3可以看出,冷冻干燥后,未添加稳定剂的空白对照制品,蛋白C的活性回收率不到88%,而添加了本发明稳定剂的制品,蛋白C活性回收率达到93%以上,说明本发明的稳定剂能有效地保护冷冻干燥过程中蛋白C的活性。
其中,单独使用甘露醇、精氨酸和组氨酸时,蛋白C的活性回收率为98.7%、98.4%和98.7%,而相同剂量下,将甘露醇、精氨酸与组氨酸组合使用时,蛋白C的活性回收率高达101.7%,比三者单独使用高了2.7~3.4%。实验结果说明,相同剂量下,将甘露醇、精氨酸与组氨酸组合使用时,蛋白C的活性回收率显著优于三者单独使用,三者组合使用发挥了协同增效的作用。
血浆资源非常有限,具有稀缺和不可替代的特性,人血浆蛋白C制品的分离纯化又较难,国内暂无上市的人血浆蛋白C制品,国外有相关产品,但是价格非常昂贵,如英国在售的baxter公司的人血浆蛋白C制品每500IU/瓶的价格高达1000英镑。
通常,每1吨血浆(约含1×106IU人血蛋白C)可以制备得到约1×105IU人血浆蛋白C。
因此,若活性回收率提高2.7~3.4%,则每1吨血浆可以多得到2.7~3.4×103IU人血浆蛋白C,也就是说,每1吨血浆的经济效益就可以提高5400~6800英镑(即人民币55334~69680元),取得了商业上的成功。
综上,在人血浆蛋白C制品的冷冻干燥的制备过程中,添加本发明稳定剂可以有效维持人血浆蛋白C的活性,提高制品外观和成型,其中,将甘露醇、精氨酸与组氨酸组合使用时,三者可以发挥协同增效的作用。
Claims (10)
1.一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物,其特征在于:它是乳糖、甘露醇、海藻糖、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸以及它们的盐中的任意一种或者任意两种以上的组合。
2.根据权利要求1所述的稳定剂组合物,其特征在于:它包括如下重量配比的成分:
乳糖 3~5份
甘露醇、海藻糖、精氨酸或天冬氨酸 2~10份;
优选地:它由如下重量配比的成分组成:
乳糖 4份
甘露醇、海藻糖、精氨酸或天冬氨酸 4份或8份。
3.根据权利要求1所述的稳定剂组合物,其特征在于:它包括如下重量配比的成分:
甘露醇 2~10份
组氨酸或精氨酸 2~10份;
优选地:它由如下重量配比的成分组成:
甘露醇 4份或8份
组氨酸或精氨酸 8份。
4.根据权利要求3所述的稳定剂组合物,其特征在于:它包括如下重量配比的成分:
甘露醇 3~5份
组氨酸 3~5份
精氨酸 3~5份;
优选地:它由如下重量配比的成分组成:
甘露醇 4份
组氨酸 4份
精氨酸 4份。
5.根据权利要求1所述的稳定剂组合物,其特征在于:它包括如下重量配比的成分:
海藻糖 3~5份
组氨酸或精氨酸 6~10份;
优选地:它由如下重量配比的成分组成:
海藻糖 4份
组氨酸或精氨酸 8份。
6.根据权利要求1所述的稳定剂组合物,其特征在于:它包括如下重量配比的成分:
精氨酸 3~5份
组氨酸 3~5份
天冬氨酸 3~5份;
优选地:它由如下重量配比的成分:
精氨酸 4份
组氨酸 4份
天冬氨酸 4份。
7.一种人血浆蛋白C是冻干稳定剂,其特征在于:它是以权利要求1~6任意一项所述组合物为活性成分,加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
8.一种制备权利要求7所述的人血浆蛋白C稳定剂的方法,其特征在于:步骤如下:按照权利要求1~6任意一项所述配比,取原料,加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分,混匀,即可。
9.一种制备人血浆蛋白C制剂的方法,其特征在于:它包括如下步骤:
(1)取去冷沉淀血浆,分离纯化得人血浆蛋白C溶液;
(2)在步骤(1)所得溶液中加入权利要求7所述的稳定剂,除菌、分装、冻干,即得;
优选地:步骤(2)中,所述稳定剂的终浓度为0.4~1.2%(w/w);
优选地:步骤(2)中,所述冻干是在-40℃~30℃下冷冻干燥50h。
10.权利要求9所述方法制备的人血浆蛋白C制剂。
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