KR102528707B1 - 고순도의 히알루로니다제 정제 방법 - Google Patents

고순도의 히알루로니다제 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고순도의 히알루로니다제 정제 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에서는 2 단계 정제 공정, 즉 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 고순도 및 높은 비활성도를 나타내는 히알루로니다제를 정제할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명에 따른 정제 방법은 경제적이고 효율적으로 고순도의 히알루로니다제를 수득하는 데 이용될 수 있다.

Description

고순도의 히알루로니다제 정제 방법{Purification method of high purity hyaluronidase}
본 발명은 고순도의 히알루로니다제(hyaluronidase) 정제 방법에 관한 것으로, 구체적으로 2단계 정제 공정을 거쳐 고순도의 히알루로니다제를 정제하는 방법에 관한 것이다.
히알루로니다제(hyaluronidase, HAdase)는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)을 저분자화하는 효소의 총칭이다. 히알루로니다제는 히알루론산을 가수분해하는 기작에 따라 포유류 형 히알루로니다제(Mammalian type, EC 3.2.1.35, hyaluronoglucosaminidase), 거머리 형 히알루로니다제(Leeches type, EC 3.2.1.36, hyaluronoglucuronidase) 및 박테리아 형 히알루로니다제 (Bacterial type, EC 4.2.2.1, hyaluronate lyase)로 구분된다.
포유류 형 히알루로니다제는 인체 내의 고환, 피부, 간, 태반 체액 등에 존재하여 히알루론산의 구성성분인 글루쿠론산과 글루코사민 사이의 β-1, 4 배당체 결합을 가수분해하여 사당류(tetrasaccharide)를 생성하거나, 우리 몸의 관절에 있는 활액 및 연골의 성분인 콘드로이틴, 콘드로이틴-4-황산, 콘드로이틴-6-황산을 가수분해하는 특징이 있다. 특히, 고환에서의 히알루로니다아제(PH-20)는 정자의 첨체 부분의 글리코실포스파티딜이노시톨 고정부위(Glycosylphosphatidylinositol, GPI anchor)에 부착되어 있어, 난자 외부의 두꺼운 외벽층을 분해하여 수정을 일으키는 중요한 효소이다.
히알루로니다제는 정형외과, 안과, 성형외과, 치과, 구강외과, 부인과 및 이비인후과의 수술에서 국소 마취제 및 스테로이드의 확산을 증가시키기 위하여 침윤 및 차단 마취에 사용되고, 혈종과 같이 체액이 모인 것을 분산, 복막 유착의 방지, 결석 생성 방지 및 불임의 치료 등에도 사용되고 있다.
그러나, 종래 히알루로니다제는 불순물을 다량 포함하여 순도가 낮다. 일예로 소의 고환 히알루로니다제로서 의약 제제로 사용되던 "Neopermease"의 경우 분자량 및 비활성도 분석 결과 분자량 58 KDa 분획(fraction)에서 높은 비활성도를 나타내고, 분자량 77 및 33 kDa 분획에서 낮은 비활성도를 나타내는 것으로 확인되었다(European Journal of Pharmaceutical Sciences 18 (2003) 267?277). 이처럼 현재 판매되고 있는 히알루로니다제 제품들이 불순물이 많은 저순도의 제품이 대부분이고, 불순물에 의한 부작용 이슈가 있어 불순물을 제거하기 위한 정제 공정이 필요하다.
한편, 기존 히알루로니다제 정제 방법으로 대한민국 공개특허 제10-2002-0011138호가 있으나, 복잡하고 많은 공정에 의해 생산되어 상업적으로 이용하기에 어려움이 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제10-2014-0058721호에서는 보다 정제 공정을 간소화하기는 했으나, 여전히 5단계의 정제 공정이 필요하다는 점에서 보다 개선된 정제 방법이 요구되고 있는 실정이다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 경제적이고 간단하면서도 불순물이 제거된 고순도의 히알루로니다제를 정제할 수 있는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 2단계 정제 공정으로 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 고순도 및 높은 비활성도를 나타내는 히알루로니다제를 정제할 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명에 따른 정제 방법으로 경제적이고 효율적으로 고순도의 히알루로니다제를 수득할 수 있음을 밝힘으로써, 본 출원에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 경제적이고 간단한 방법으로 고순도의 히알루로니다제(hyaluronidase)를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히알루로니다제(hyaluronidase) 정제 방법으로서, 상기 정제 방법은 히알루로니다제-함유 원료를 하기의 순서로 정제하는 정제 방법을 제공한다:
1) 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography: AC)를 수행하는 단계; 및
2) 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography; CEX)를 수행하는 단계.
본 발명에서는 2 단계 정제 공정, 구체적으로 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 고순도 및 높은 비활성도를 나타내는 히알루로니다제를 정제할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명에 따른 정제 방법은 경제적이고 효율적으로 고순도의 히알루로니다제를 수득하기 위한 방법으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 블루 세파로스 레진(Blue sepharose resin)을 이용한 친화성 크로마토그래피로 1차 정제 시 크로마토그램을 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 헤파린 세파로스 레진(Heparin sepharose resin)을 이용한 친화성 크로마토그래피로 1차 정제 시 크로마토그램을 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 pH 7.0에서 양이온 교환 크로마토그래피로 2차 정제 시 크로마토그램을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 pH 6.0에서 양이온 교환 크로마토그래피로 2차 정제 시 크로마토그램을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 pH 5.0에서 양이온 교환 크로마토그래피로 2차 정제 시 크로마토그램을 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤파린 세파로스 레진을 이용한 친화성 크로마토그래피로 1차 정제하고, pH 5.0에서 양이온 교환 크로마토그래피로 2차 정제한 히알루로니다제를 SDS-PAGE gel 분석으로 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤파린 세파로스 레진을 이용한 친화성 크로마토그래피로 1차 정제하고, pH 5.0에서 양이온 교환 크로마토그래피로 2차 정제한 히알루로니다제의 분자량을 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤파린 세파로스 레진을 이용한 친화성 크로마토그래피로 1차 정제하고, pH 5.0에서 양이온 교환 크로마토그래피로 2차 정제한 히알루로니다제의 활성을 자이모그래피(Zymography) 분석으로 확인한 도이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 히알루로니다제(hyaluronidase) 정제 방법으로서, 상기 정제 방법은 히알루로니다제-함유 원료를 하기의 순서로 정제하는 정제 방법을 제공한다:
1) 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography: AC)를 수행하는 단계; 및
2) 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography; CEX)를 수행하는 단계.
본 발명에서, 상기 히알루로니다제-함유 원료는 정제되지 않은 원료, 또는 일부 정제된 히알루로니다제-함유 원료일 수 있다.
상기 히알루로니다제는 통상 포유류 동물 유래, 예를 들면 사람, 소, 양, 돼지 등의 고환에서 유래된 효소이거나, 포유류 유래 히알루로니다제를 미생물 또는 동물세포 또는 식물세포에 도입하여 발현된 재조합 히알루로니다제일 수도 있다. 재조합 히알루로니다제의 생산방법은 통상의 포유류 유전자의 재조합 방법에 따라 미생물 또는 동물세포 또는 식물세포에서 생산하는 방법과 동일하며, 예시적인 방법은 Frost et al., 1997, BBRC, 236, 10-15; Lin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10071-10075; Reitinger et al., 2008, Protein Expression and Purification, 57, 226-233; Kordowicz et al., European patent, WO2000/077221 등에 기술되어 있다.
본 발명에서, 상기 히알루로니다제는 통상 포유류 동물 유래, 예를 들면 사람, 소, 양, 돼지 등의 고환에서 유래된 효소일 수 있다. 통상 시판되는 히알루로니다제는 포유류의 고환을 염석처리를 하여 동결건조하거나, 염석처리 후 발열물질을 제거하고 동결건조한 형태이다. 예를 들면, 포유류 고환에서 1회 염석처리 후 동결건조한 원료, 고환에서 2회 염석처리 후 동결건조한 원료, 고환에서 2회 염석처리하고 발열물질을 제거한 후 동결건조한 원료 등을 정제공정에 원료로 사용할 수 있다. 종래 히알루로니다제는 양(ovine)의 고환에서 두 차례의 염석처리(salting out)를 진행 한 후 동결건조(lyophilization), 투석(dialysis), 발열물질제거(depyrogenation) 및 동결건조의 과정을 거쳐 추출이 되며, 추출된 것에는 히알루로니다제 외에 다량의 단백이 혼합되어 있다. 또한, 시판되는 동결건조된 조원료(crude) 상태의 히알루로니다제 또는 히알루로니다제 제제는 불순물을 다량 포함하여 순도가 낮다. 예컨대, 소 고환 히알루로니다제 제제인 "Neopermease"의 경우 이론 분자량인 58 KDa 이외에도 분자량 77 및 33 kDa 단백이 혼합되어 있다. 이에, 불순물을 제거하여 고순도의 히알루로니다제를 정제하는 것이 필요하다.
또한, 히알루로니다제는, 예를 들어 다른 제제(agent), 약물들 및 단백질들과 함께 전착제(spreading agent) 또는 분산제로서 사용되어 그의 분산성 및 전달성을 증강시킨다. 히알루로니다제는 또한 기타 치료제 및 화장품 성분으로 사용되는바, 최근 히알루로니다제의 사용 증가로 인하여, 대량의 정제된 히알루로니다제를 필요로 하는 실정이다.
본 발명에서는 이를 위해, 정제 공정 단계를 최적화 하여, 히알루로니다제 정제 수율을 향상시키고, 불순물 제거를 극대화함으로써, 정제 공정 단계를 간소화하고 공정 운용의 효율성을 증대하였다.
본 발명에서, 용어 "크로마토그래피"는, 혼합물의 성분이 상이한 속도로 매질을 통하여 통과되도록, 혼합물을 매질을 통하여 통과시켜 혼합물의 성분을 분리하는 임의의 프로세스를 지칭한다.
상기 히알루로니다제를 정제하는 방법의 각 단계에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 정제 방법에 있어서, 단계 1)은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 수행하는 단계이다.
본 발명에서 사용된 친화성 크로마토그래피는 정제하고자 하는 생리활성물질에 대한 항체를 제조하여 고형 담체에 공유 결합시킨 후 정제하고자 하는 생리활성물질을 포함하는 시료를 항체-담체 복합체에 첨가하여 생리활성 물질을 항체에 흡착시키고 적당한 방법으로 세척한 후 용출제를 첨가하여 목적물질을 용출 수득하는 방법을 의미한다.
본 발명에서, 상기 친화성 크로마토그래피는 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피, 또는 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피일 수 있고, 구체적으로 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피일 수 있다. 상기 헤파린 세파로스를 이용하여 히알루로니다제의 정제 수율을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 친화성 크로마토그래피의 컬럼 완충액으로는 인산나트륨(Na2HPO4) 완충액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 1 내지 50 mM의 인산나트륨을 포함하고 pH 4.0 내지 8.0을 갖는 평형화 완충액을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로 10 내지 50 mM의 인산나트륨을 포함하고 pH 5.0 내지 7.0을 갖는 완충액을 사용할 수 있다.
또한, 상기 완충액을 이용해 시료주입단계, 평형단계, 세척단계 및 용출단계 중 어느 하나 이상의 단계를 추가로 수행할 수 있다.
또한, 상기 완충액을 이용해 상기 단계 1) 이전에 컬럼을 평형화(equilibration)하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 평형화는 정제하고자 하는 단백질이 컬럼에 주입되기 전에, 환경의 변화에 의해 단백질이 응집되거나 활성이 소실되는 것을 방지하기 위하여 완충액으로 컬럼을 안정화하는 단계를 지칭할 수 있다.
상기 단계 1) 이전의 평형화 단계에서 완충액을 흘려주는 유속, 온도, 시간 및 전도도 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다.
본 발명에 따른 정제 방법에 있어서, 단계 2)는 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography; CEX)를 수행하는 단계이다.
이온 교환 크로마토그래피는 매질과 단백질 표면의 순전하의 가역적인 상호 작용 즉, 이온 결합 강도의 차이를 이용한 교환 수지를 말한다. 본 발명에서 사용된 양이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 수지를 충진한 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 의미하며, 상기 단계에서는 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물을 추가로 제거할 수 있고 목적하는 등전점을 갖는 동형체를 선택적으로 분리할 수 있다.
상기 양이온 교환 수지는 다른 수용액에 첨가되어 수용액 속의 특정 양이온과 자신의 양이온을 교환하는 역할을 하는 합성수지를 의미하며, 양이온 교환 컬럼은 등전점 이상에서 양이온을 띠는 단백질을 흡착시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기는 메틸설포네이트(S), 설포프로필(SP), 카르복시메틸(CM), 폴리아스파르트산(Poly aspartic acid), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S)일 수 있다.
또한, 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 사용할 수 있는 컬럼은 캡토 설포프로필(Capto SP), 모노메틸설포네이트(Mono S), 설포프로필 세파로스(SP sepharose), 설포프로필 하이 퍼포먼스(SP HP; SP High performance) 또는 카르복시메틸 세파로스(CM sepharose)일 수 있고, 구체적으로 설포프로필 세파로스(SP sepharose)일 수 있으나, 목적하는 히알루로니다제를 분리할 수 있는 것이면 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피의 컬럼 완충액으로는 시트르산삼나트륨(Na3C6H5O7) 또는 인산나트륨(Na2HPO4) 완충액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 1 내지 50 mM의 시트르산삼나트륨 또는 인산나트륨을 포함하고 pH 4.0 내지 8.0을 갖는 완충액을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로 10 내지 50 mM의 시트르산삼나트륨 또는 인산나트륨을 포함하고 pH 5.0 내지 7.0을 갖는 완충액을 사용할 수 있으며, 보다 더 구체적으로 10 내지 50 mM의 시트르산삼나트륨 또는 인산나트륨을 포함하고 pH 5.0을 갖는 완충액을 사용할 수 있다. 상기 pH 범위를 벗어날 경우 히알루로니다제의 순도 및 비활성도가 저하될 수 있다.
또한, 상기 완충액을 이용해 시료주입단계, 평형단계, 세척단계 및 용출단계 중 어느 하나 이상의 단계를 추가로 수행할 수 있다.
또한, 상기 완충액을 이용해 상기 단계 2) 이전에 컬럼을 평형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 2) 이전의 평형화 단계에서 완충액을 흘려주는 유속, 온도, 시간 및 전도도 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 1) 및/또는 단계 2)는 농도구배(concentration gradient)를 이용할 수 있다. 예를 들어 단계식 염 구배(stepwise salt gradient) 또는 연속식 염 구배 (continuous salt gradient)로 히알루로니다제를 용출시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 단계 1) 및/또는 단계 2)의 용출 단계에서는 완충제의 증가하는 농도 구배(상향 구배, ascending gradient)를 이용할 수 있다. 그 예로 약 0.0 mM 내지 700 mM, 0.0 mM 내지 650 mM, 0.0 mM 내지 600 mM, 0.0 mM 내지 550 mM, 0.0 mM 내지 500 mM, 10 mM 내지 700 mM, 10 mM 내지 650 mM, 10 mM 내지 600 mM, 10 mM 내지 550 mM, 10 mM 내지 500 mM, 20 mM 내지 700 mM, 20 mM 내지 650 mM, 20 mM 내지 600 mM, 20 mM 내지 550 mM, 20 mM 내지 500 mM, 30 mM 내지 700 mM, 30 mM 내지 650 mM, 30 mM 내지 600 mM, 30 mM 내지 550 mM, 30 mM 내지 500 mM, 35 mM 내지 700 mM, 35 mM 내지 650 mM, 35 mM 내지 600 mM, 35 mM 내지 550 mM, 35 mM 내지 500 mM, 37 mM 내지 700 mM, 37 mM 내지 650 mM, 37 mM 내지 600 mM, 37 mM 내지 550 mM, 37 mM 내지 500 mM, 37.5 mM 내지 700 mM, 37.5 mM 내지 650 mM, 37.5 mM 내지 600 mM, 37.5 mM 내지 550 mM 또는 37.5 mM 내지 500 mM의 범위를 가지는 농도구배의 완충제를 사용할 수 있다. 상기 완충제는 예를 들어 황산나트륨(Na2S04), 염화나트륨 (NaCl), 염화칼륨 (KCl), 암모늄 아세테이트 (NH4OAc) 등을 사용할 수 있고, 구체적으로 염화나트륨 (NaCl)일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 범위에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 1) 및 단계 2)는 1회 수행하고, 추가로 동일하거나 다른 크로마토그래피를 수행하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 정제 방법은 상기 단계 1) 및 단계 2)를 1회만 수행하더라도 히알루로니디나제의 불순물을 완전히 제거하여 정제 수율 및 순도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 상기 단계 1) 및 단계 2)의 히알루로니다제 정제 방법, 즉 2 단계 컬럼 공정을 거치면 최종적으로 불순물이 효율적으로 제거된 고순도 및 고수율의 히알루로니다제를 정제할 수 있다.
본 발명은 단계 1) 및 단계 2) 이후에 농축 및 투석 공정, 여과(filtration) 공정 중 어느 하나의 공정을 추가로 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 여과 공정은 종래의 공지된 미세여과, 한외여과, 정밀여과, 심층여과 등의 공정으로 진행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제 방법에 따라 분리된 히알루로니다제는 높은 순도를 가질 수 있다. 구체적으로, 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상 또는 100%의 순도를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 2 단계 정제 공정으로 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 고순도 및 높은 비활성도를 나타내는 히알루로니다제를 정제할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명에 따른 정제 방법을 통해 정제 공정 단계를 간소화하고 공정 운용의 효율성을 증대할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 정제 방법을 경제적이고 효율적으로 고순도의 히알루로니다제를 수득하는 데 이용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 히알루로니다제(Hyaluronidase, HAdase) 1차 정제
1-1. 블루 세파로스 또는 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피
짧은 공정으로 고순도 및 높은 비활성도를 갖는 히알루로니다제를 정제하기 위하여, 1차 정제 공정으로 블루 세파로스 또는 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피를 수행하였다.
구체적으로, 블루 세파로스 레진(Blue sepharose resin, cytiva)을 이용하여 1차 정제를 하기 위하여 소 고환 히알루로니다제가 포함되어 있는 로딩시료를 준비하였다. 로딩시료를 1차 컬럼 평형 완충액에 녹인 후, 0.2 ~ 0.45 um 마이크로필터(Microfilter)를 이용하여 여과하였다. 1차 컬럼 평형 완충액에 용해되어 있는 블루 세파로스 레진이 충진된 컬럼에 상기 여과한 로딩시료를 주입한 후, 약 10 컬럼 부피의 평형 완축액에 염을 추가한 세척액으로 세척한 다음, 평형 완충액에 염을 추가한 용출 완충액을 이용하여 증가되는 염 단계 변화를 통해 컬럼으로부터 히알루로니다제를 용리하였다.
또한, 헤파린 세파로스 레진(Heparin sepharose resin, cytiva)을 이용하여 1차 정제를 하기 위하여 상기와 동일한 방법으로 히알루로니다제가 포함되어 있는 로딩시료를 여과하고, 여과한 로딩시료를 1차 컬럼 평형 완충액에 용해되어 있는 헤파린 세파로스 레진이 충진된 컬럼에 주입하였다. 그 다음, 약 10 컬럼 부피의 평형 완충액으로 세척하고, 평형 완충액에 염을 추가한 용출 완충액을 이용하여 증가되는 염 단계 변화를 통해 컬럼으로부터 히알루로니다제를 용리하였다.
상기 블루 세파로스 크로마토그래피 및 헤파린 세파로스 크로마토그래피에 이용한 평형 완충액 조성은 10 ~ 50 mM 인산나트륨(Sodium phosphate), pH 5 ~ 7로 하였고, 세척액 조성은 10 ~ 50mM 인산나트륨, 37.5 mM NaCl, pH 5 ~ 7로 하였으며, 용출 완충액 조성은 10 ~ 50mM 인산나트륨, 37.5 mM ~ 500 mM NaCl, pH 5 ~ 7로 하였다.
1-2. 1차 정제에 따른 히알루로니다제 활성 및 정제 수율 분석
블루 세파로스 또는 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피를 수행한 후 정제시료의 활성 및 정제 수율을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-1.에서 블루 세파로스 크로마토그래피(도 1) 및 헤파린 세파로스 크로마토그래피(도 2)를 이용한 1차 정제하는 동안 크로마토그램의 피크를 확인하였다.
또한, 상기 블루 세파로스 크로마토그래피(표 1) 및 헤파린 세파로스 크로마토그래피(표 2)를 이용하여 1차 정제 전 로딩시료(Input) 및 정제 후 용리액(Elution)의 총 활성(Total activity)을 평가하였다. 활성 측정은 United States Pharmacopoeia "USP assay for Hyaluronidase"의 Assay에 따라 시험하였다. 총 활성은 다음의 수학식을 이용하여 계산하였다: 활성(IU/mL) × 용출 부피(mL). 또한, 상기 Input/Elution의 총 활성을 비교하여 정제 수율을 확인하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 블루 세파로스 크로마토그래피 및 헤파린 세파로스 크로마토그래피를 이용하여 1차 정제한 정제시료 모두 히알루로니다제 타겟 분획(target fraction)이 확인되었으나, 블루 세파로스 크로마토그래피를 이용하는 경우에 비해 헤파린 세파로스 크로마토그래피를 이용하는 경우 크로마토그래피의 피크 분리가 잘 이루어지는 것으로 나타났다.
또한, 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 블루 세파로스 크로마토그래피 및 헤파린 세파로스 크로마토그래피를 이용하여 1차 정제한 히알루로니다제의 정제 수율은 각각 39%, 95%로, 헤파린 세파로스 크로마토그래피를 이용하는 경우 히알루로니다제의 정제 수율이 현저히 우수함을 확인하였다.
블루 세파로스 크로마토그래피
시료 Total activity (IU) 정제 수율 (%)
Input 144,970 39%
Elution 57,064
헤파린 세파로스 크로마토그래피
시료 Total activity (IU) 정제 수율 (%)
Input 192,570 95%
Elution 182,895
상기의 결과를 통해 헤파린 세파로스를 이용하여 히알루로니다제를 고순도 및 고수율로 정제할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 히알루로니다제 정제를 위한 1차 정제 공정으로 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피가 적합함을 알 수 있다.
실시예 2. 히알루로니다제 2차 정제
2-1. 양이온 교환 크로마토그래피
상기 실시예 1-1.에서 획득한 히알루로니다제가 포함되어 있는 정제시료를 SP 세파로스(Sepharose) 컬럼이 연결된 FPLC(고속 단백질 액체 크로마토그래피, Fast Protein Liquid Chromatography, Cytiva)에 이용하여 2차 정제를 수행하였다. 이 때 2차 정제 공정으로 평형 완충액의 pH 조건을 달리하여 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-1.에서 고순도 및 고수율로 히알루로니다제를 정제할 수 있는 1차 정제 공정인 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피를 수행하여 획득한 히알루로니다제가 포함되어 있는 정제시료를 컬럼 평형화 pH와 동일한 pH의 평형 완충액을 이용하여 희석하였다. 희석한 정제시료의 주입 전 평형 완충액을 SP 세파로스 수지가 충진된 컬럼에 흘려주어 평형화하고, 상기 희석한 정제시료를 컬럼을 통하여 흘려 주었다. 히알루로니다제가 양이온 교환 컬럼 물질에 결합되는 동안, 흐름 통과(flow through, FT)액은 멸균된 용기에 수집하였다. 이후평형 완충액에 염을 추가한 용출 완충액을 이용하여 증가되는 염 단계 변화를 통해 컬럼으로부터 히알루로니다제를 용리하였다.
상기 평형 완충액 조성은 10 ~ 50 mM 시트르산삼나트륨(Sodium Citrate) 또는 인산나트륨(Sodium phosphate)으로 하되 pH 5, 6 또는 7 각각 달리하였고, 용출 완충액 조성은 10 ~ 50 mM 인산나트륨, 0.0 mM ~ 500 mM NaCl로 하되 pH 5, 6 또는 7로 각각 달리하였다.
2-2. 2차 정제에 따른 히알루로니다제 순도 및 비활성도 분석
양이온 교환 크로마토그래피를 수행한 후 정제시료의 순도 및 비활성도를 분석하였다.
구체적으로, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 시 pH 조건을 pH 7(도 3), pH 6(도 4) 및 pH 5(도 5)로 각각 달리하여 2차 정제하는 동안 크로마토그램의 피크를 확인하였다.
또한, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 시 pH 조건을 pH 7(표 3), pH 6(표 4) 및 pH 5(표 5)로 각각 달리하여 2차 정제하기 전 시료(Input) 및 2차 정제한 후 시료(Elution)에서 히알루로니다제의 비활성도를 평가하였다. 활성 측정은 United States Pharmacopoeia "USP assay for Hyaluronidase"의 Assay에 따라 시험하였다.
그 결과, 도 3 내지 도 5에 나타낸 바와 같이, pH 5, pH 6 및 pH 7의 pH 조건에서 양이온 교환 크로마토그래피 수행한 경우 모두 크로마토그램에서 하나의 히알루로니다제 타겟 분획(target fraction)이 확인되었다. 특히, pH 5 조건에서 양이온 교환 크로마토그래피 수행한 경우 크로마토그래피의 피크 분리가 보다 잘 이루어져, 보다 고순도의 히알루로니다제가 정제됨을 확인하였다.
또한, 표 3 내지 표 5에 나타낸 바와 같이, pH 5, pH 6 및 pH 7의 pH 조건에서 양이온 교환 크로마토그래피 수행한 경우 모두 2차 정제를 통해 히알루로니다제의 비활성도가 증가하고, pH 5 조건에서 양이온 교환 크로마토그래피 수행한 경우 비활성도가 가장 높게 나타남을 확인하였다.
양이온 교환수지 크로마토그래피 (pH 7)
시료 Specific activity (IU/mg)
Input 46,150
Elution 54,183
양이온 교환수지 크로마토그래피 (pH 6)
시료 Specific activity (IU/mg)
Input 46,150
Elution 64,425
양이온 교환수지 크로마토그래피 (pH 5)
시료 Specific activity (IU/mg)
Input 46,150
Elution 86,177
상기의 결과를 통해 pH 5 ~ 7 조건에서 양이온 교환 크로마토그래피로 2차 정제를 수행하여 고순도 및 높은 비활성도를 나타내는 히알루로니다제를 정제할 수 있음을 알 수 있다. 또한, pH 5 조건에서 양이온 교환수지 크로마토그래피를 수행할 경우 가장 우수한 순도 및 비활성도를 나타내는 히알루로니다제를 정제할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. 본 발명의 정제 방법에 따라 정제된 히알루로니다제 분석
상기 실시예 1. 및 실시예 2.에서 최적화한 정제 방법으로 히알루로니다제를 정제한 후 순도 및 비활성도를 분석하였다.
구체적으로, 소 고환 히알루로니다제 함유 원료를 이용하여 1차 정제 공정으로 실시예 1-1.에 기재된 방법과 동일한 방법으로 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피를 수행하고, 2차 정제 공정으로 실시예 2-1.에 기재된 방법과 동일한 방법으로 pH 5 조건에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 히알루로니다제를 정제하였다.
상기 정제한 히알루로니다제(Lane 2) 및 소 고환 히알루로니다제 함유 원료(Lane 1)를 SDS-PAGE gel 분석하여 정제한 히알루로니다제의 순도를 확인하였다. SDS-PAGE gel 분석은 Invitrogen, 4 ~ 12% Bis-Tris 겔을 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 수행하였다(도 6).
또한, 상기 정제한 히알루로니다제의 분자량을 확인하였다. 분자량 확인을 위하여 AB SCIEX사의 MALDI-TOF/TOF 5800 system을 이용하여 제조사의 절차에 따라 분자량 분석을 수행하였다(도 7). 이때 BSA(Bovine serum albumin)를 단백질 분자량을 위한 표준으로 사용하였다.
또한, 상기 정제한 히알루로니다제(Lane 2) 및 소 고환 히알루로니다제 함유 원료(Lane 1)를 자이모그래피(Zymography) 분석하여 히알루로니다제를 확인하였다. 자이모그래피는 기질이 포함된 폴리아크릴아마이드겔에서 기질을 분해하는 효소를 검출하는데 사용되는 분석법이다. 이에 폴리아크릴아마이드에 0.17 mg/mL의 히알루론산을 첨가하여 겔을 제조한다. 전기 영동 후, 3% Triton X-100을 이용하여 4℃에서 1시간 동안 SDS를 제거하였다. 그 다음, 활성 반응 완충용액에 겔을 침적하고 37℃ 배양기에서 1 ~ 4시간 동안 효소 반응을 한 후, 알시안블루(Alcian blue)로 염색 및 탈염색하였다(도 8).
또한, 상기 정제한 히알루로니다제(Final product) 및 소 고환 히알루로니다제 함유 원료(Lyophilized powder)의 비활성도를 평가하였다. 활성 측정은 United States Pharmacopoeia "USP assay for Hyaluronidase"의 Assay에 따라 시험하였다(표 6).
그 결과, 도 6 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, 정제한 히알루로니다제는 히알루로니다제 함유 원료와 동일한 위치(50 ~ 60 kDa 사이)에서 단일 밴드(1 band)로 나타나고(도 6), 정제한 히알루로니다제는 히알루로니다제 함유 원료와 동일한 위치(50 ~ 60 kDa 사이)에서 활성이 나타남을 확인하였다(도 8). 또한, BSA 분자량 확인을 통해 분자량 분석법의 시스템 적합성을 확인하였고, 정제 시료 분석 결과 정제한 히알루로니다제의 분자량이 소 고환 히알루로니다아제 이론 분자량인 58 kDa임을 확인하였다(도 7). 이를 통해 정제된 히알루로니다제가 순도 100%임을 확인하였다.
또한, 표 6에 나타낸 바와 같이, 정제된 고순도 히알루로니다제의 비활성도가 320,000 ~ 380,000 unit/mg을 나타냄을 확인하였다.
로딩시료 Specific activity (IU/mg)
Lyophilized powder 2,000~3,000
Final product 320,000~380,000
상기 결과를 통해 본 발명에 따라 2 단계 정제 공정, 구체적으로 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 고순도 및 높은 비활성도를 나타내는 히알루로니다제를 정제할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명에 따른 정제 방법은 시간적, 비용적인 부분을 포함한 경제적인 측면에서 우수한 방법임을 알 수 있다.

Claims (10)

  1. 히알루로니다제(hyaluronidase) 정제 방법으로서, 상기 정제 방법은 히알루로니다제-함유 원료를 하기의 순서로 정제하는 정제 방법으로, 하기 단계 1) 및 2)는 1회 수행하고, 추가로 동일하거나 다른 크로마토그래피를 수행하지 않는 것인 정제 방법:
    1) 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography: AC)를 수행하는 단계; 및
    2) 설포프로필 세파로스(SP sepharose)를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography; CEX)를 수행하는 단계.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 각 단계의 크로마토그래피는 시료주입단계, 평형단계, 세척단계 및 용출단계 중 어느 하나 이상의 단계를 추가로 수행하는 것인, 정제 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 1)은 1 내지 50 mM의 인산나트륨(Na2HPO4)을 포함하고 pH 4.0 내지 8.0을 갖는 완충액을 사용하여 수행되는 것인, 정제 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 2)는 1 내지 50 mM의 시트르산삼나트륨(Na3C6H5O7) 또는 인산나트륨(Na2HPO4)을 포함하고 pH 4.0 내지 8.0을 갖는 완충액을 사용하여 수행되는 것인, 정제 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단계 2)는 1 내지 50 mM의 시트르산삼나트륨(Na3C6H5O7) 또는 인산나트륨(Na2HPO4)을 포함하고 pH 5.0 내지 7.0을 갖는 완충액을 사용하여 수행되는 것인, 정제 방법.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 방법에 의해 정제된 히알루로니다제는 순도 98% 이상인 것인, 정제 방법.
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