JP3108767B1 - ｃｈｉｂ２型キチナーゼの製造法 - Google Patents
ｃｈｉｂ２型キチナーゼの製造法Info
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- JP3108767B1 JP3108767B1 JP11298255A JP29825599A JP3108767B1 JP 3108767 B1 JP3108767 B1 JP 3108767B1 JP 11298255 A JP11298255 A JP 11298255A JP 29825599 A JP29825599 A JP 29825599A JP 3108767 B1 JP3108767 B1 JP 3108767B1
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Abstract
【要約】
【課題】 原料のダイズからＰＲ−８キチナーゼファミ
リーに属し、新規なクラスであるchib2型のキチナーゼ
を、簡便なカラム操作で、短時間に効率よく分離、精製
する方法を開発すること。 【解決手段】 脱脂大豆粉を脱イオン水又は酢酸緩衝液
で抽出し、得られた抽出液からタンパク質画分を分離し
た後、該タンパク質画分を透析処理し、次いで疎水性ク
ロマトグラフィーを行い、得られた溶出液からキチナー
ゼ活性を有する画分を分離し、再度疎水性クロマトグラ
フィーを行うことを特徴とする精製chib2型キチナーゼ
の製造法、および、得られた精製chib2型キチナーゼ
を、マンノース結合性レクチンを不溶性担体に結合させ
たカラムに通すことにより、糖鎖のあるものとないもの
とに分離することを特徴とする精製chib2型キチナーゼ
の製造法。
リーに属し、新規なクラスであるchib2型のキチナーゼ
を、簡便なカラム操作で、短時間に効率よく分離、精製
する方法を開発すること。 【解決手段】 脱脂大豆粉を脱イオン水又は酢酸緩衝液
で抽出し、得られた抽出液からタンパク質画分を分離し
た後、該タンパク質画分を透析処理し、次いで疎水性ク
ロマトグラフィーを行い、得られた溶出液からキチナー
ゼ活性を有する画分を分離し、再度疎水性クロマトグラ
フィーを行うことを特徴とする精製chib2型キチナーゼ
の製造法、および、得られた精製chib2型キチナーゼ
を、マンノース結合性レクチンを不溶性担体に結合させ
たカラムに通すことにより、糖鎖のあるものとないもの
とに分離することを特徴とする精製chib2型キチナーゼ
の製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ダイズ種子や脱脂
ダイズ粉などからＰＲ−８キチナーゼファミリーに属す
るchib2型のキチナーゼを簡便に、且つ大量に製造する
方法に関する。
ダイズ粉などからＰＲ−８キチナーゼファミリーに属す
るchib2型のキチナーゼを簡便に、且つ大量に製造する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】キチナーゼ〔ＥＣ ３．２．１．１４〕
は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのポリマーである
キチンのβ−１，４結合に作用する加水分解酵素であ
る。キチナーゼは、４つのファミリーに分類され、この
うちのクラスＩ（chia1型）、クラスII（chia2型）およ
びクラスIV（chia4型）は共通の性質を有し、ＰＲ−３
キチナーゼファミリーに属している。一方、クラスIII
は上記３クラスの酵素とは異なる性質を示し、ＰＲ−８
キチナーゼファミリーに属する。
は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのポリマーである
キチンのβ−１，４結合に作用する加水分解酵素であ
る。キチナーゼは、４つのファミリーに分類され、この
うちのクラスＩ（chia1型）、クラスII（chia2型）およ
びクラスIV（chia4型）は共通の性質を有し、ＰＲ−３
キチナーゼファミリーに属している。一方、クラスIII
は上記３クラスの酵素とは異なる性質を示し、ＰＲ−８
キチナーゼファミリーに属する。
【０００３】従来、クラスIIIには、植物においてchib1
型キチナーゼの存在のみが確認されていたが、本発明者
らの研究の結果、ダイズにおいて、chib2型のキチナー
ゼの存在が確認された（Yeboah, N. A., Arahira, M.,
Nong, V. H., Zhang, D., Kadokura, K., Watanabe, A.
and Fukazawa, C. (1998) A class III acidic endoch
itinase is specifically expressed in the developin
g seeds of soybean (Glycine max [L.] Merr.) Plant
Molecular Biology, 36, 407-415) 。
型キチナーゼの存在のみが確認されていたが、本発明者
らの研究の結果、ダイズにおいて、chib2型のキチナー
ゼの存在が確認された（Yeboah, N. A., Arahira, M.,
Nong, V. H., Zhang, D., Kadokura, K., Watanabe, A.
and Fukazawa, C. (1998) A class III acidic endoch
itinase is specifically expressed in the developin
g seeds of soybean (Glycine max [L.] Merr.) Plant
Molecular Biology, 36, 407-415) 。
【０００４】chib2型のキチナーゼは、chib1型キチナー
ゼと相同性が高いことから、同じクラスIIIのＰＲ−８
キチナーゼファミリーに分類されている。構造的には、
Ｃ末端部分の配列が明らかに長いことにおいて、chib1
型キチナーゼと相違している。また、この酵素には糖鎖
を有しているものと有していないものとがある。chib2
型のキチナーゼは、種子の成長初期から終期までの長期
間にわたり分泌されており、ダイズの成長期の防御のみ
ならず、休眠期の防御にも深く関係していることが分か
っている。
ゼと相同性が高いことから、同じクラスIIIのＰＲ−８
キチナーゼファミリーに分類されている。構造的には、
Ｃ末端部分の配列が明らかに長いことにおいて、chib1
型キチナーゼと相違している。また、この酵素には糖鎖
を有しているものと有していないものとがある。chib2
型のキチナーゼは、種子の成長初期から終期までの長期
間にわたり分泌されており、ダイズの成長期の防御のみ
ならず、休眠期の防御にも深く関係していることが分か
っている。
【０００５】chib2型のキチナーゼは、前記したよう
に、本発明者らによって初めて見出されたものである。
ダイズから該酵素を分離、精製するための操作は、上記
文献に記載されているように、極めて複雑で長時間を要
する上に、酵素の収率が低く、実用性に欠けるものであ
る。
に、本発明者らによって初めて見出されたものである。
ダイズから該酵素を分離、精製するための操作は、上記
文献に記載されているように、極めて複雑で長時間を要
する上に、酵素の収率が低く、実用性に欠けるものであ
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、原料のダイ
ズからＰＲ−８キチナーゼファミリーに属し、新規なク
ラスであるchib2型のキチナーゼを、簡便なカラム操作
で、短時間に効率よく分離、精製する方法を開発するこ
とを目的とするものである。
ズからＰＲ−８キチナーゼファミリーに属し、新規なク
ラスであるchib2型のキチナーゼを、簡便なカラム操作
で、短時間に効率よく分離、精製する方法を開発するこ
とを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討の結果、原料のダイズから得たタ
ンパク質画分を透析した後、疎水性クロマトグラフィー
（hydrophobic interaction chromatography) を行うこ
とにより、目的とするchib2型のキチナーゼのみを特異
的に分離、精製することができることを見出した。さら
に、精製されたキチナーゼについて、マンノースを認識
できるレクチンを用いたカラム処理を行うことにより、
キチナーゼを糖鎖の有無で識別できることを見出した。
このようにして得られる、高度に精製されたchib2型キ
チナーゼから該酵素をコードする遺伝子を取得して該酵
素の性質を解明し、さらには該酵素の工業的な大量生産
に結び付けることができる。本発明は、かかる知見に基
づいて完成されたものである。
を達成すべく鋭意検討の結果、原料のダイズから得たタ
ンパク質画分を透析した後、疎水性クロマトグラフィー
（hydrophobic interaction chromatography) を行うこ
とにより、目的とするchib2型のキチナーゼのみを特異
的に分離、精製することができることを見出した。さら
に、精製されたキチナーゼについて、マンノースを認識
できるレクチンを用いたカラム処理を行うことにより、
キチナーゼを糖鎖の有無で識別できることを見出した。
このようにして得られる、高度に精製されたchib2型キ
チナーゼから該酵素をコードする遺伝子を取得して該酵
素の性質を解明し、さらには該酵素の工業的な大量生産
に結び付けることができる。本発明は、かかる知見に基
づいて完成されたものである。
【０００８】請求項１記載の本発明は、脱脂大豆粉を脱
イオン水又は酢酸緩衝液で抽出し、得られた抽出液から
タンパク質画分を分離した後、該タンパク質画分を透析
処理し、次いで疎水性クロマトグラフィーを行い、得ら
れた溶出液からキチナーゼ活性を有する画分を分離し、
再度疎水性クロマトグラフィーを行うことを特徴とする
精製chib2型キチナーゼの製造法である。
イオン水又は酢酸緩衝液で抽出し、得られた抽出液から
タンパク質画分を分離した後、該タンパク質画分を透析
処理し、次いで疎水性クロマトグラフィーを行い、得ら
れた溶出液からキチナーゼ活性を有する画分を分離し、
再度疎水性クロマトグラフィーを行うことを特徴とする
精製chib2型キチナーゼの製造法である。
【０００９】請求項２記載の本発明は、請求項１記載の
方法によって得られた精製chib2型キチナーゼを、マン
ノース結合性レクチンを不溶性担体に結合させたカラム
に通すことにより、糖鎖のあるものとないものとに分離
することを特徴とする精製chib2型キチナーゼの製造法
である。
方法によって得られた精製chib2型キチナーゼを、マン
ノース結合性レクチンを不溶性担体に結合させたカラム
に通すことにより、糖鎖のあるものとないものとに分離
することを特徴とする精製chib2型キチナーゼの製造法
である。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の方法により、ＰＲ−８キ
チナーゼファミリーに属し、新規なクラスであるchib2
型のキチナーゼを製造するために用いる原料ダイズとし
ては、ダイズ種子の他に市販の脱脂ダイズ粉などが好ま
しい。ダイズ種子を用いる場合は、該ダイズ種子を液体
窒素中で冷却粉砕後に、ヘキサン等で脱脂を行ったもの
を原料として用いる。市販の脱脂ダイズ粉は、そのまま
使用することができる。なお、本酵素は、キュウリにも
若干含まれていることが分かっているので、これを原料
として本酵素を製造することも可能である。
チナーゼファミリーに属し、新規なクラスであるchib2
型のキチナーゼを製造するために用いる原料ダイズとし
ては、ダイズ種子の他に市販の脱脂ダイズ粉などが好ま
しい。ダイズ種子を用いる場合は、該ダイズ種子を液体
窒素中で冷却粉砕後に、ヘキサン等で脱脂を行ったもの
を原料として用いる。市販の脱脂ダイズ粉は、そのまま
使用することができる。なお、本酵素は、キュウリにも
若干含まれていることが分かっているので、これを原料
として本酵素を製造することも可能である。
【００１１】本発明の方法においては、まず上記ダイズ
種子あるいは脱脂ダイズ粉に脱イオン水またはｐＨ５．
０〜７．０程度の希酢酸緩衝液を加えて抽出を行う。こ
の抽出は、原料を抽出溶媒に懸濁し攪拌後、室温で一晩
静置することにより行う。これにより、目的とする酵素
を含むタンパク質を抽出する。ここで、希酢酸緩衝液の
具体例としては、例えば実施例で用いているβ−メルカ
プトエタノールを含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）等が挙
げられる。抽出時に溶媒のｐＨが５．０〜７．０の範囲
外となった場合には、酢酸あるいは酢酸ナトリウムなど
の適当な物質を用いてｐＨを調整することが望ましい。
種子あるいは脱脂ダイズ粉に脱イオン水またはｐＨ５．
０〜７．０程度の希酢酸緩衝液を加えて抽出を行う。こ
の抽出は、原料を抽出溶媒に懸濁し攪拌後、室温で一晩
静置することにより行う。これにより、目的とする酵素
を含むタンパク質を抽出する。ここで、希酢酸緩衝液の
具体例としては、例えば実施例で用いているβ−メルカ
プトエタノールを含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）等が挙
げられる。抽出時に溶媒のｐＨが５．０〜７．０の範囲
外となった場合には、酢酸あるいは酢酸ナトリウムなど
の適当な物質を用いてｐＨを調整することが望ましい。
【００１２】抽出物を二重にしたガーゼなどを用いて濾
過することにより、大部分の固形分を取り除いて得た粗
抽出液を遠心分離等の固−液分離を行って上清を集め、
抽出液とする。得られた抽出液に硫酸アンモニウムを添
加して塩析を行い、タンパク質を沈澱させる。具体的に
は、抽出液に硫酸アンモニウムをゆっくり加え、低温
（例えば２〜６℃）で３０〜６０分間程静置することに
より沈澱を生成させる。このとき用いる硫酸アンモニウ
ムとしては、４０％飽和となるようにパウダー状のもの
が好適である。
過することにより、大部分の固形分を取り除いて得た粗
抽出液を遠心分離等の固−液分離を行って上清を集め、
抽出液とする。得られた抽出液に硫酸アンモニウムを添
加して塩析を行い、タンパク質を沈澱させる。具体的に
は、抽出液に硫酸アンモニウムをゆっくり加え、低温
（例えば２〜６℃）で３０〜６０分間程静置することに
より沈澱を生成させる。このとき用いる硫酸アンモニウ
ムとしては、４０％飽和となるようにパウダー状のもの
が好適である。
【００１３】次いで、生成した沈澱を遠心分離等の固−
液分離を行って回収する。集めた沈澱を脱イオン水また
は希酢酸緩衝液（例えばβ−メルカプトエタノールを含
む酢酸緩衝液）に懸濁し、流水中で一晩透析を行う。透
析処理後、遠心分離等の固−液分離を行って透析中に生
じた沈澱物を除去する。次に、得られた上清に、終濃度
が０．５〜１．０Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加
え、さらに終濃度が１〜２ｍＭ程度となるようにβ−メ
ルカプトエタノールを加える。このとき沈澱が生じたな
らば、固−液分離を行って除去する。このようにして試
料溶液を得る。
液分離を行って回収する。集めた沈澱を脱イオン水また
は希酢酸緩衝液（例えばβ−メルカプトエタノールを含
む酢酸緩衝液）に懸濁し、流水中で一晩透析を行う。透
析処理後、遠心分離等の固−液分離を行って透析中に生
じた沈澱物を除去する。次に、得られた上清に、終濃度
が０．５〜１．０Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加
え、さらに終濃度が１〜２ｍＭ程度となるようにβ−メ
ルカプトエタノールを加える。このとき沈澱が生じたな
らば、固−液分離を行って除去する。このようにして試
料溶液を得る。
【００１４】上記の試料を疎水性クロマトグラフィーに
供する。この時用いるカラムや溶媒等の種類、抽出時
間、その他の条件については、通常の疎水性クロマトグ
ラフィーの場合と同様にすればよく、特に制限はない。
例えば、試料をカラムに供した後、β−メルカプトエタ
ノールを含む硫酸アンモニウム溶液から硫酸アンモニウ
ム溶液を含まないβ−メルカプトエタノール溶液に直線
的に濃度勾配をかけ、同溶液でしばらく溶出する。
供する。この時用いるカラムや溶媒等の種類、抽出時
間、その他の条件については、通常の疎水性クロマトグ
ラフィーの場合と同様にすればよく、特に制限はない。
例えば、試料をカラムに供した後、β−メルカプトエタ
ノールを含む硫酸アンモニウム溶液から硫酸アンモニウ
ム溶液を含まないβ−メルカプトエタノール溶液に直線
的に濃度勾配をかけ、同溶液でしばらく溶出する。
【００１５】この疎水性クロマトグラフィーの終了時点
で、溶出液に含まれるキチナーゼ活性を測定すると、キ
チナーゼ活性が認められるが、その活性は低く、未だ精
製度が低いことが分かる（図１参照）。そこで、本発明
においては、該溶出液中のキチナーゼ活性を有する画分
を集めて、再び疎水性クロマトグラフィーを行うことに
より、精製された活性の高いキチナーゼを取得する。
で、溶出液に含まれるキチナーゼ活性を測定すると、キ
チナーゼ活性が認められるが、その活性は低く、未だ精
製度が低いことが分かる（図１参照）。そこで、本発明
においては、該溶出液中のキチナーゼ活性を有する画分
を集めて、再び疎水性クロマトグラフィーを行うことに
より、精製された活性の高いキチナーゼを取得する。
【００１６】まず、最初の疎水性クロマトグラフィーに
より得られる溶出液中のキチナーゼ活性を測定する。キ
チナーゼ活性の測定は、可溶性のエチレングリコールキ
チンを基質として用い、酢酸緩衝液中で保温した後、ソ
モギー−ネルソン法〔Nelson, N. (1944) Photometric
adaptation of the determination of glucose. J. Bio
l. Chem., 153, 375-380〕、吸光度法〔Imoto, T. and
Yagishita, K. (1971)A simple activity measurement
of lysozyme. Agr. Biol. Chem., 35, 1154-1156 〕等
により行う。なお、還元糖の標準物質として、キチナー
ゼの作用するＮ−アセチルグルコサミンを用いることが
できる。
より得られる溶出液中のキチナーゼ活性を測定する。キ
チナーゼ活性の測定は、可溶性のエチレングリコールキ
チンを基質として用い、酢酸緩衝液中で保温した後、ソ
モギー−ネルソン法〔Nelson, N. (1944) Photometric
adaptation of the determination of glucose. J. Bio
l. Chem., 153, 375-380〕、吸光度法〔Imoto, T. and
Yagishita, K. (1971)A simple activity measurement
of lysozyme. Agr. Biol. Chem., 35, 1154-1156 〕等
により行う。なお、還元糖の標準物質として、キチナー
ゼの作用するＮ−アセチルグルコサミンを用いることが
できる。
【００１７】この測定により、キチナーゼ活性を有する
画分を集めて、終濃度が０．５〜１．０Ｍとなるように
硫酸アンモニウムを加え、さらに終濃度が１〜２ｍＭ程
度となるようにβ−メルカプトエタノールを加える。そ
の後、該画分を含む試料を、上記と同様に疎水性クロマ
トグラフィーカラムに供して溶出を行う。すなわち、再
び疎水性クロマトグラフィーを行う。このときのクロマ
トグラフィーの条件についても特に制限はなく、前回の
クロマトグラフィーと同様にして行えばよい。
画分を集めて、終濃度が０．５〜１．０Ｍとなるように
硫酸アンモニウムを加え、さらに終濃度が１〜２ｍＭ程
度となるようにβ−メルカプトエタノールを加える。そ
の後、該画分を含む試料を、上記と同様に疎水性クロマ
トグラフィーカラムに供して溶出を行う。すなわち、再
び疎水性クロマトグラフィーを行う。このときのクロマ
トグラフィーの条件についても特に制限はなく、前回の
クロマトグラフィーと同様にして行えばよい。
【００１８】２回目の疎水性クロマトグラフィーで得ら
れる溶出液から、緩衝液を除去することにより、高度に
精製されたchib2型キチナーゼが得られる。すなわち、
前記と同様にして、溶出液のキチナーゼ活性を測定し、
活性を有する画分を集める。この活性画分に対し、前記
と同様に硫酸アンモニウムを加えて沈澱させ、遠心分離
等の固−液分離操作により沈澱を回収する。次いで、集
めた沈澱を希酢酸緩衝液に懸濁し、同緩衝液で透析す
る。
れる溶出液から、緩衝液を除去することにより、高度に
精製されたchib2型キチナーゼが得られる。すなわち、
前記と同様にして、溶出液のキチナーゼ活性を測定し、
活性を有する画分を集める。この活性画分に対し、前記
と同様に硫酸アンモニウムを加えて沈澱させ、遠心分離
等の固−液分離操作により沈澱を回収する。次いで、集
めた沈澱を希酢酸緩衝液に懸濁し、同緩衝液で透析す
る。
【００１９】以上のようにして、目的とする精製された
chib2型のキチナーゼを簡便な操作によって得ることが
できる。本発明の方法により、chib2型のキチナーゼが
得られたことは、次のようにして確認することができ
る。すなわち、透析後の試料をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法により分析することにより行われ
る。試料をこの電気泳動にかけ、得られたバンドを確認
すると、見かけの分子量が１５ｋＤａ、２９ｋＤａおよ
び３１ｋＤａを示す３本のバンドが見られる。さらに、
chib2型酵素に対する抗体を用いてWestern blottingを
行うことによって、本酵素がchib2型のキチナーゼであ
ることを確認することができる。
chib2型のキチナーゼを簡便な操作によって得ることが
できる。本発明の方法により、chib2型のキチナーゼが
得られたことは、次のようにして確認することができ
る。すなわち、透析後の試料をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法により分析することにより行われ
る。試料をこの電気泳動にかけ、得られたバンドを確認
すると、見かけの分子量が１５ｋＤａ、２９ｋＤａおよ
び３１ｋＤａを示す３本のバンドが見られる。さらに、
chib2型酵素に対する抗体を用いてWestern blottingを
行うことによって、本酵素がchib2型のキチナーゼであ
ることを確認することができる。
【００２０】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法（ＰＡＧＥ）の結果得られる３本のバンドのうち、見
かけの分子量が２９ｋＤａおよび３１ｋＤａの２種の酵
素タンパク質は、共通のＮ−末端およびＣ−末端配列を
持っているが、前者には糖鎖がないのに対し、後者は糖
鎖を有していることがわかっている。両者の分子量は、
イオンスプレー質量分析法による分析の結果、前者、す
なわち糖鎖がない酵素タンパク質の分子量は３１，３４
８であり、糖鎖を有する酵素タンパク質の分子量は、３
２，６８４であった。糖鎖については、現在明らかにさ
れている糖鎖の基本骨格（Voet, D. and Voet, J. D.
著、田宮信雄、村松正美、八木選彦、吉田 浩 訳、ヴ
ォート生化学（上）第２版、ｐｐ２３１、東京化学同人
（１９９６））を基にして、上記イオンスプレー質量分
析法による分析および糖組成分析の結果から、マンノー
ス６個とＮ−アセチルグルコサミンが２個結合したもの
であると推測される。
法（ＰＡＧＥ）の結果得られる３本のバンドのうち、見
かけの分子量が２９ｋＤａおよび３１ｋＤａの２種の酵
素タンパク質は、共通のＮ−末端およびＣ−末端配列を
持っているが、前者には糖鎖がないのに対し、後者は糖
鎖を有していることがわかっている。両者の分子量は、
イオンスプレー質量分析法による分析の結果、前者、す
なわち糖鎖がない酵素タンパク質の分子量は３１，３４
８であり、糖鎖を有する酵素タンパク質の分子量は、３
２，６８４であった。糖鎖については、現在明らかにさ
れている糖鎖の基本骨格（Voet, D. and Voet, J. D.
著、田宮信雄、村松正美、八木選彦、吉田 浩 訳、ヴ
ォート生化学（上）第２版、ｐｐ２３１、東京化学同人
（１９９６））を基にして、上記イオンスプレー質量分
析法による分析および糖組成分析の結果から、マンノー
ス６個とＮ−アセチルグルコサミンが２個結合したもの
であると推測される。
【００２１】一方、見かけの分子量が１５ｋＤａのバン
ドは、解析の結果、Ｎ−末端配列が他の２つのバンドと
共通であるが、Ｃ−末端配列が異なるものであることが
判明した。また、このものは糖鎖を有していないこと以
外は、他の２つのバンドと疏水的な相互作用を有してい
る。
ドは、解析の結果、Ｎ−末端配列が他の２つのバンドと
共通であるが、Ｃ−末端配列が異なるものであることが
判明した。また、このものは糖鎖を有していないこと以
外は、他の２つのバンドと疏水的な相互作用を有してい
る。
【００２２】本発明の方法によれば、これらの３種のタ
ンパク質を、糖鎖の付いたchib2型のキチナーゼ（分子
量：３１ｋＤａ）と糖鎖を持たないchib2型のキチナー
ゼ（分子量：１５ｋＤａおよび分子量：２９ｋＤａ）と
に分離することができる。糖鎖を有する酵素タンパク質
と糖鎖を持たない酵素タンパク質を分離するには、これ
らを含む試料をコンカナバリンＡ（Con A)などのマンノ
ース結合性レクチンを不溶性担体に結合させたカラムに
通すこと（アフィニティークロマトグラフィー）によ
り、容易に行うことができる。
ンパク質を、糖鎖の付いたchib2型のキチナーゼ（分子
量：３１ｋＤａ）と糖鎖を持たないchib2型のキチナー
ゼ（分子量：１５ｋＤａおよび分子量：２９ｋＤａ）と
に分離することができる。糖鎖を有する酵素タンパク質
と糖鎖を持たない酵素タンパク質を分離するには、これ
らを含む試料をコンカナバリンＡ（Con A)などのマンノ
ース結合性レクチンを不溶性担体に結合させたカラムに
通すこと（アフィニティークロマトグラフィー）によ
り、容易に行うことができる。
【００２３】この操作について説明すると、通常は、上
記の方法で製造したchib2型キチナーゼを希酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０〜７．０）に溶解し、これをレクチンを付
けたアフィニティー担体に供したのち、同じ緩衝液でカ
ラムを洗浄し、続いて同緩衝液で溶出することにより行
う。その結果、アフィニティー担体の非吸着画分および
洗浄画分には、糖鎖が除去された２種類のchib2型酵素
が見出され、一方、緩衝液で溶出した画分には、糖鎖が
ついたchib2型酵素が溶出される。
記の方法で製造したchib2型キチナーゼを希酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０〜７．０）に溶解し、これをレクチンを付
けたアフィニティー担体に供したのち、同じ緩衝液でカ
ラムを洗浄し、続いて同緩衝液で溶出することにより行
う。その結果、アフィニティー担体の非吸着画分および
洗浄画分には、糖鎖が除去された２種類のchib2型酵素
が見出され、一方、緩衝液で溶出した画分には、糖鎖が
ついたchib2型酵素が溶出される。
【００２４】これら酵素の性質について検討したとこ
ろ、糖鎖のないchib2型酵素と糖鎖を有するchib2型酵素
は、比活性、活性ｐＨ、耐熱性等の点で殆ど共通した性
質を有している。
ろ、糖鎖のないchib2型酵素と糖鎖を有するchib2型酵素
は、比活性、活性ｐＨ、耐熱性等の点で殆ど共通した性
質を有している。
【００２５】登熟期のダイズ種子において解析を行った
結果、登熟初期から中期前半（開花後１８日目〜２８日
目頃）までは、chib2型のキチナーゼの大部分は糖鎖が
付いているが、登熟が進むにつれて糖鎖が除去され、完
熟時には５％以下となることが明らかとなった。
結果、登熟初期から中期前半（開花後１８日目〜２８日
目頃）までは、chib2型のキチナーゼの大部分は糖鎖が
付いているが、登熟が進むにつれて糖鎖が除去され、完
熟時には５％以下となることが明らかとなった。
【００２６】
【実施例】次に、実施例により本発明を詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】実施例１ 試料として市販の脱脂ダイズ粉２ｋｇを用い、これを２
０Ｌの１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む２０ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）と混合し、よく攪拌した
後、室温で一晩静置することによりタンパク質を抽出し
た。なお、抽出時にｐＨ値が上記範囲よりずれた場合に
は、２０ｍＭの酢酸溶液を用いてｐＨを５．０に調整し
た。
０Ｌの１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む２０ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）と混合し、よく攪拌した
後、室温で一晩静置することによりタンパク質を抽出し
た。なお、抽出時にｐＨ値が上記範囲よりずれた場合に
は、２０ｍＭの酢酸溶液を用いてｐＨを５．０に調整し
た。
【００２８】次いで、抽出物を２重にしたガーゼで濾過
して大部分の残渣を取り除いた。その後に、この粗抽出
液を８０００×ｇ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、
上清を集めて抽出液とした。この抽出液に４０％飽和と
なるようにパウダー状にした硫酸アンモニウムをゆっく
り加えて４℃、３０分で沈澱させた。生じた沈殿を８０
００×ｇ、４℃、１５分の条件で遠心分離を行って集め
た。得られた沈澱を２００ｍＬの１ｍＭ β−メルカプ
トエタノールを含む２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．
０）に懸濁し、流水中で一晩透析を行った。
して大部分の残渣を取り除いた。その後に、この粗抽出
液を８０００×ｇ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、
上清を集めて抽出液とした。この抽出液に４０％飽和と
なるようにパウダー状にした硫酸アンモニウムをゆっく
り加えて４℃、３０分で沈澱させた。生じた沈殿を８０
００×ｇ、４℃、１５分の条件で遠心分離を行って集め
た。得られた沈澱を２００ｍＬの１ｍＭ β−メルカプ
トエタノールを含む２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．
０）に懸濁し、流水中で一晩透析を行った。
【００２９】透析後の試料を、８０００×ｇ、４℃、１
５分の条件で遠心分離を行い、透析中に沈澱したものを
除去した。このようにして得た上清に対して終濃度が
０．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加え、さらに
終濃度１ｍＭとなるようにβ−メルカプトエタノールを
加えた。この時点で沈澱を生じた場合には、８０００×
ｇ、４℃、１５分の条件で遠心分離し、沈澱したものを
除去した。
５分の条件で遠心分離を行い、透析中に沈澱したものを
除去した。このようにして得た上清に対して終濃度が
０．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加え、さらに
終濃度１ｍＭとなるようにβ−メルカプトエタノールを
加えた。この時点で沈澱を生じた場合には、８０００×
ｇ、４℃、１５分の条件で遠心分離し、沈澱したものを
除去した。
【００３０】このようにして調製した試料を疎水性クロ
マトグラフィーのカラム（東ソー社製、ブチルトーヨー
パール６５０Ｍ：カラムサイズφ５．０ｃｍ×９０ｃ
ｍ）に供した。試料をカラムに供した後に、１ｍＭ β
−メルカプトエタノールを含む０．５Ｍの硫酸アンモニ
ウム溶液から硫酸アンモニウム溶液を含まない１ｍＭβ
−メルカプトエタノール溶液に直線的に濃度勾配（６．
４Ｌ）をかけて溶出した後に、１ｍＭ β−メルカプト
エタノール溶液２Ｌで溶出を行った（第１回目の疎水性
クロマトグラフィー）。この溶出は、ポンプとして、フ
ァルマシア社製のＦＰＬＣに付属のポンプ（Ｐ−５０
０）を用いて流速８ｍＬ／ｍｉｎの条件で行った。溶出
液は３０ｍＬずつ集めた（図１）。
マトグラフィーのカラム（東ソー社製、ブチルトーヨー
パール６５０Ｍ：カラムサイズφ５．０ｃｍ×９０ｃ
ｍ）に供した。試料をカラムに供した後に、１ｍＭ β
−メルカプトエタノールを含む０．５Ｍの硫酸アンモニ
ウム溶液から硫酸アンモニウム溶液を含まない１ｍＭβ
−メルカプトエタノール溶液に直線的に濃度勾配（６．
４Ｌ）をかけて溶出した後に、１ｍＭ β−メルカプト
エタノール溶液２Ｌで溶出を行った（第１回目の疎水性
クロマトグラフィー）。この溶出は、ポンプとして、フ
ァルマシア社製のＦＰＬＣに付属のポンプ（Ｐ−５０
０）を用いて流速８ｍＬ／ｍｉｎの条件で行った。溶出
液は３０ｍＬずつ集めた（図１）。
【００３１】溶出液５０μＬ中に含まれるキチナーゼ活
性は、以下の方法で測定した。２％（ｗ／ｖ）の可溶性
エチレングリコールキチンを基質として用い、１００ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中で４０℃にて１５分間
保温した。その後に、前述のソモギー・ネルソン法また
は吸光度法を用いて、生じた還元糖の量を測定すること
により酵素活性を求めた。還元糖の標準物質は、Ｎ−ア
セチルグルコサミンを用いた。
性は、以下の方法で測定した。２％（ｗ／ｖ）の可溶性
エチレングリコールキチンを基質として用い、１００ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中で４０℃にて１５分間
保温した。その後に、前述のソモギー・ネルソン法また
は吸光度法を用いて、生じた還元糖の量を測定すること
により酵素活性を求めた。還元糖の標準物質は、Ｎ−ア
セチルグルコサミンを用いた。
【００３２】次に、強いキチナーゼ活性を有する画分を
集めて、終濃度が０．５Ｍとなるように硫酸アンモニウ
ムを加え、さらに終濃度が１ｍＭとなるようにβ−メル
カプトエタノールを加えた。その後に、上記の疎水性ク
ロマトグラフィーと同様の条件で、試料をカラムに再度
供して溶出した（第２回目の疎水性クロマトグラフィ
ー）。
集めて、終濃度が０．５Ｍとなるように硫酸アンモニウ
ムを加え、さらに終濃度が１ｍＭとなるようにβ−メル
カプトエタノールを加えた。その後に、上記の疎水性ク
ロマトグラフィーと同様の条件で、試料をカラムに再度
供して溶出した（第２回目の疎水性クロマトグラフィ
ー）。
【００３３】第２回目の疎水性クロマトグラフィーの溶
出液を、第１回目の溶出液と同様の方法でキチナーゼ活
性を測定した。結果を図２に示す。図２から明らかなよ
うに、第１回目の疎水性クロマトグラフィーの溶出液の
測定結果と比較して、約３倍も強い酵素活性を示した。
溶出液のうち、高いキチナーゼ活性を示す画分に、４０
％飽和になるようにパウダー状にした硫酸アンモニウム
をゆっくり加え、４℃で３０分間かけて沈澱させ、生じ
た沈殿を８０００×ｇ、４℃、１５分の条件で遠心分離
を行うことにより回収した。集めた沈澱を１０ｍＬの１
ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０）に懸濁し、同緩衝液で一晩透析し
た。
出液を、第１回目の溶出液と同様の方法でキチナーゼ活
性を測定した。結果を図２に示す。図２から明らかなよ
うに、第１回目の疎水性クロマトグラフィーの溶出液の
測定結果と比較して、約３倍も強い酵素活性を示した。
溶出液のうち、高いキチナーゼ活性を示す画分に、４０
％飽和になるようにパウダー状にした硫酸アンモニウム
をゆっくり加え、４℃で３０分間かけて沈澱させ、生じ
た沈殿を８０００×ｇ、４℃、１５分の条件で遠心分離
を行うことにより回収した。集めた沈澱を１０ｍＬの１
ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０）に懸濁し、同緩衝液で一晩透析し
た。
【００３４】透析後の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ、バンドを確認したところ、見か
けの分子量１５ｋＤａ、２９ｋＤａおよび３１ｋＤａを
示す３本のバンドが得られた（図３）。さらに、chib2
型酵素に対する抗体を用いてWestern blottingを行った
結果、これらはchib2型酵素であることが確認された。
また、精製したchib2型キチナーゼの比活性は、１３３
ｕｎｉｔｓ／ｍｇ（１ｕｎｉｔ＝１分間に１μｍｏｌの
Ｎ−アセチルグルコサミンを生じる活性）であった。
ドゲル電気泳動にかけ、バンドを確認したところ、見か
けの分子量１５ｋＤａ、２９ｋＤａおよび３１ｋＤａを
示す３本のバンドが得られた（図３）。さらに、chib2
型酵素に対する抗体を用いてWestern blottingを行った
結果、これらはchib2型酵素であることが確認された。
また、精製したchib2型キチナーゼの比活性は、１３３
ｕｎｉｔｓ／ｍｇ（１ｕｎｉｔ＝１分間に１μｍｏｌの
Ｎ−アセチルグルコサミンを生じる活性）であった。
【００３５】２９ｋＤａおよび３１ｋＤａの２種の酵素
タンパク質は、Ｎ−末端およびＣ−末端解析の結果、い
ずれも同じＮ−末端およびＣ−末端配列を持つことが明
らかとなった。易動度が遅い分子種は、糖鎖の付いたも
のであると考えられた。また、３つのバンドを示す酵素
タンパク質について、イオンスプレーマススペクトロメ
トリーを行った結果、糖鎖が除去されているバンドの分
子量は、３１，３４８であり、糖鎖が付いているバンド
の分子量は、３２，６８４であった。なお、糖鎖はマン
ノース６個とＮ−アセチルグルコサミンが２個結合した
ものであると考えられた。さらに、１５ｋＤａのバンド
は、Ｎ−末端配列は、他の２つのバンドと同じものであ
ったが、Ｃ−末端配列は異なっていた。
タンパク質は、Ｎ−末端およびＣ−末端解析の結果、い
ずれも同じＮ−末端およびＣ−末端配列を持つことが明
らかとなった。易動度が遅い分子種は、糖鎖の付いたも
のであると考えられた。また、３つのバンドを示す酵素
タンパク質について、イオンスプレーマススペクトロメ
トリーを行った結果、糖鎖が除去されているバンドの分
子量は、３１，３４８であり、糖鎖が付いているバンド
の分子量は、３２，６８４であった。なお、糖鎖はマン
ノース６個とＮ−アセチルグルコサミンが２個結合した
ものであると考えられた。さらに、１５ｋＤａのバンド
は、Ｎ−末端配列は、他の２つのバンドと同じものであ
ったが、Ｃ−末端配列は異なっていた。
【００３６】実施例２ 実施例１で得られた３種類のキチナーゼを、糖鎖の有無
により分離すべく、以下の操作を行った。試料を２０ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、糖鎖に対する
アフィニティー担体（ファルマシア社製、Con A セファ
ロース：カラムサイズφ１．０ｃｍ×５ｃｍ）に供し
た。その後、同緩衝液でカラムを洗浄した。洗浄後に
０．５Ｍのα−メチルマンノピラノシドを含む２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）で溶出した。
により分離すべく、以下の操作を行った。試料を２０ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、糖鎖に対する
アフィニティー担体（ファルマシア社製、Con A セファ
ロース：カラムサイズφ１．０ｃｍ×５ｃｍ）に供し
た。その後、同緩衝液でカラムを洗浄した。洗浄後に
０．５Ｍのα−メチルマンノピラノシドを含む２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）で溶出した。
【００３７】Con A セファロースの非吸着画分および洗
浄画分並びに上記の酢酸緩衝液で溶出した画分につい
て、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。そ
の結果、酢酸緩衝液で溶出した画分である易動度が遅い
分子種（３１ｋＤａ）は、糖鎖のついたものであった。
また、非吸着画分および洗浄画分に含まれていた１５ｋ
Ｄａおよび２９ｋＤａのバンドには糖鎖がなかった（図
４）。さらに、１５ｋＤａのバンドは、Ｎａｔｉｖｅ−
ＰＡＧＥの結果、他の２つのバンドと疎水的な相互作用
があることが明らかとなった（図５）。
浄画分並びに上記の酢酸緩衝液で溶出した画分につい
て、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。そ
の結果、酢酸緩衝液で溶出した画分である易動度が遅い
分子種（３１ｋＤａ）は、糖鎖のついたものであった。
また、非吸着画分および洗浄画分に含まれていた１５ｋ
Ｄａおよび２９ｋＤａのバンドには糖鎖がなかった（図
４）。さらに、１５ｋＤａのバンドは、Ｎａｔｉｖｅ−
ＰＡＧＥの結果、他の２つのバンドと疎水的な相互作用
があることが明らかとなった（図５）。
【００３８】chib2型のキチナーゼにおける糖鎖の有無
が酵素活性に与える影響について検討した。その結果、
比活性はいずれも１３３ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。ま
た、活性ｐＨ曲線を作製したところ、図６に示すよう
に、ｐＨが３．０と８．１５の２点で活性が最大となっ
た。また、耐熱性についても、両者共に７０℃まで安定
であった。このことから、糖鎖の有無は、酵素活性には
影響しないことが明らかとなった。
が酵素活性に与える影響について検討した。その結果、
比活性はいずれも１３３ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。ま
た、活性ｐＨ曲線を作製したところ、図６に示すよう
に、ｐＨが３．０と８．１５の２点で活性が最大となっ
た。また、耐熱性についても、両者共に７０℃まで安定
であった。このことから、糖鎖の有無は、酵素活性には
影響しないことが明らかとなった。
【００３９】実施例３ 登熟期の各段階におけるダイズ種子が有するchib2型の
キチナーゼの糖鎖の有無について、本発明の方法により
検討した。登熟初期から中期前半の各期のダイズ種子か
ら、実施例１と同様の条件で精製chib2型のキチナーゼ
を得た。さらに、得られたchib2型のキチナーゼを、実
施例２と同様の条件で糖鎖の有無を確認した。その結
果、登熟初期から中期前半（開花後１８日目〜２８日目
頃）までのダイズ種子に含まれるchib2型のキチナーゼ
の大部分は糖鎖が付いているが、登熟が進むにつれて糖
鎖が除去され、完熟時には、糖鎖の付いているchib2型
のキチナーゼは全体の５％以下となった。この結果よ
り、糖鎖の有無は、何らかの形で種子の成長に係わって
いるものと推測される。
キチナーゼの糖鎖の有無について、本発明の方法により
検討した。登熟初期から中期前半の各期のダイズ種子か
ら、実施例１と同様の条件で精製chib2型のキチナーゼ
を得た。さらに、得られたchib2型のキチナーゼを、実
施例２と同様の条件で糖鎖の有無を確認した。その結
果、登熟初期から中期前半（開花後１８日目〜２８日目
頃）までのダイズ種子に含まれるchib2型のキチナーゼ
の大部分は糖鎖が付いているが、登熟が進むにつれて糖
鎖が除去され、完熟時には、糖鎖の付いているchib2型
のキチナーゼは全体の５％以下となった。この結果よ
り、糖鎖の有無は、何らかの形で種子の成長に係わって
いるものと推測される。
【００４０】
【発明の効果】本発明の方法によれば、ダイズの種子お
よび脱脂ダイズ粉から、簡便にＰＲ−８ファミリーの新
規なキチナーゼクラスであるchib2型のキチナーゼを分
離、精製することができる。
よび脱脂ダイズ粉から、簡便にＰＲ−８ファミリーの新
規なキチナーゼクラスであるchib2型のキチナーゼを分
離、精製することができる。
【００４１】すなわち、請求項１記載の本発明の製造法
によれば、疎水性クロマトグラフィーを２回使用するだ
けの簡便な操作によってchib2型のキチナーゼを得るこ
とができる。
によれば、疎水性クロマトグラフィーを２回使用するだ
けの簡便な操作によってchib2型のキチナーゼを得るこ
とができる。
【００４２】さらに、請求項２記載の本発明の方法によ
り、Con A セファロースなどのアフィニティーカラムを
通すことで、糖鎖の付いた酵素と糖鎖を持たない酵素を
容易に分離することができる。
り、Con A セファロースなどのアフィニティーカラムを
通すことで、糖鎖の付いた酵素と糖鎖を持たない酵素を
容易に分離することができる。
【００４３】本発明は、他の植物由来のchib2型のキチ
ナーゼを分離、精製するときや、将来微生物や植物、動
物等で本酵素を発現させたときにも応用することが可能
であると考えられることから、利用範囲は広い。
ナーゼを分離、精製するときや、将来微生物や植物、動
物等で本酵素を発現させたときにも応用することが可能
であると考えられることから、利用範囲は広い。
【図１】 疎水性クロマトグラフィーを１回行った後の
chib2型のキチナーゼの吸光度および酵素活性を示すグ
ラフである。
chib2型のキチナーゼの吸光度および酵素活性を示すグ
ラフである。
【図２】 疎水性クロマトグラフィーを２回行った後の
chib2型のキチナーゼの吸光度および酵素活性を示すグ
ラフである。
chib2型のキチナーゼの吸光度および酵素活性を示すグ
ラフである。
実線は吸光度（Ａ２８０）、破線はキチナーゼ活性
（ｕｎｉｔ／ｍＬ）を示す。一点破線は硫酸アンモニウ
ム濃度（Ｍ）を示す。
（ｕｎｉｔ／ｍＬ）を示す。一点破線は硫酸アンモニウ
ム濃度（Ｍ）を示す。
【図３】 疎水性クロマトグラフィーを２回行った後の
抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動写真である。
抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動写真である。
写真上部のＭはマーカーを、１は精製したchib2型の
キチナーゼであることを示し、左部の数字は、分子量
（ｋＤａ）を示す。
キチナーゼであることを示し、左部の数字は、分子量
（ｋＤａ）を示す。
【図４】 Con A セファロースカラムによる分離を行っ
た後の抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動写真である。
た後の抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動写真である。
写真上部のＭはマーカーを、１は精製したchib2型の
キチナーゼであることを、２は吸着画分を、３は非吸着
画分を示す。左部の数字は、分子量（ｋＤａ）を示す。
キチナーゼであることを、２は吸着画分を、３は非吸着
画分を示す。左部の数字は、分子量（ｋＤａ）を示す。
【図５】 Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによるchib2型のキ
チナーゼの解析結果を示す。
チナーゼの解析結果を示す。
レーン１は糖鎖のあるchib2型酵素および糖鎖のないc
hib2型酵素全体の合計量を（１５＋２９＋３１ｋＤ
ａ）、レーン２は、糖鎖のあるchib2型のキチナーゼ
（３１ｋＤａ）を、レーン３は、糖鎖のないchib2型の
キチナーゼ（１５＋２９ｋＤａ）を示す。
hib2型酵素全体の合計量を（１５＋２９＋３１ｋＤ
ａ）、レーン２は、糖鎖のあるchib2型のキチナーゼ
（３１ｋＤａ）を、レーン３は、糖鎖のないchib2型の
キチナーゼ（１５＋２９ｋＤａ）を示す。
【図６】 キチナーゼ活性とｐＨとの関係を示すグラフ
である。
である。
●は糖鎖のあるchib2型のキチナーゼ、×は糖鎖のな
いchib2型のキチナーゼの活性を示す。
いchib2型のキチナーゼの活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭50−121484（ＪＰ，Ａ) Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．36，Ｎｏ．３, （1998），ｐ．407−415 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．86，（1989）, Ｐ．896−900 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 脱脂大豆粉を脱イオン水又は酢酸緩衝液
で抽出し、得られた抽出液からタンパク質画分を分離し
た後、該タンパク質画分を透析処理し、次いで疎水性ク
ロマトグラフィーを行い、得られた溶出液からキチナー
ゼ活性を有する画分を分離し、再度疎水性クロマトグラ
フィーを行うことを特徴とする精製chib2型キチナーゼ
の製造法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法によって得られた精
製chib2型キチナーゼを、マンノース結合性レクチンを
不溶性担体に結合させたカラムに通すことにより、糖鎖
のあるものとないものとに分離することを特徴とする精
製chib2型キチナーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11298255A JP3108767B1 (ja) | 1999-10-20 | 1999-10-20 | ｃｈｉｂ２型キチナーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11298255A JP3108767B1 (ja) | 1999-10-20 | 1999-10-20 | ｃｈｉｂ２型キチナーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3108767B1 true JP3108767B1 (ja) | 2000-11-13 |
| JP2001112469A JP2001112469A (ja) | 2001-04-24 |
Family
ID=17857263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11298255A Expired - Lifetime JP3108767B1 (ja) | 1999-10-20 | 1999-10-20 | ｃｈｉｂ２型キチナーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3108767B1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3731872B1 (en) * | 2017-12-29 | 2021-11-24 | F. Hoffmann-La Roche AG | Process for providing pegylated protein composition |
-
1999
- 1999-10-20 JP JP11298255A patent/JP3108767B1/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．３，（１９９８），ｐ．４０７−４１５ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，（１９８９），Ｐ．８９６−９００ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001112469A (ja) | 2001-04-24 |
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