JP2826807B2 - 海藻レクチン及びその製造方法 - Google Patents
海藻レクチン及びその製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、紅藻類のテングサ属か
ら抽出するレクチン及びその製造方法に関する。本発明
に係るレクチンは、臨床診断試薬、生化学試薬等として
用いられる。
ら抽出するレクチン及びその製造方法に関する。本発明
に係るレクチンは、臨床診断試薬、生化学試薬等として
用いられる。
【０００２】
【従来の技術】レクチンは、動植物又は細菌に見出さ
れ、特定の構造を持った糖又は糖鎖に結合し、動植物細
胞又は複合糖質を凝集又は沈降させる免疫学的産物以外
の糖蛋白質又は蛋白質である。
れ、特定の構造を持った糖又は糖鎖に結合し、動植物細
胞又は複合糖質を凝集又は沈降させる免疫学的産物以外
の糖蛋白質又は蛋白質である。
【０００３】近年、生化学、細胞生物学の発展に伴い種
々の細胞間相互作用や分化、癌化等において糖鎖の構造
が重要な役割を担っていることが明らかとなるに連れ、
レクチンが持つそれぞれ特有の糖構造を認識するという
生物学的性質が注目され、広く研究されている。
々の細胞間相互作用や分化、癌化等において糖鎖の構造
が重要な役割を担っていることが明らかとなるに連れ、
レクチンが持つそれぞれ特有の糖構造を認識するという
生物学的性質が注目され、広く研究されている。
【０００４】そして、陸上植物のレクチンについてはマ
メ科植物を中心にその存在が認められて多種のレクチン
が市販され、医療分野や生化学分野において極めて重要
な物質となっている。一方、海洋生物由来のレクチン
は、陸上生物由来のものに比べると研究例が少ないが、
海藻にも広く分布し、３２６種の海藻から２０５種の存
在が明らかとなってきている。しかしながら、海藻レク
チンの殆どが単糖やオリゴ糖でその活性が阻止されない
ため、陸上植物レクチンのように阻害単糖をリガンドや
溶出剤とするアフィニティークロマトグラフィーでの精
製が困難であり、これまでに緑藻１０種と紅藻１３種か
らレクチンが単離され、紅藻５種のものが部分精製され
ているが、これらは何れも通常の蛋白質精製法が用いら
れている［化学と生物 第３５巻、９号５８６頁（１９
９４）］。しかしながら、このような精製方法は工程が
長く、しかも長時間を要するために大量生産に適してい
ない。この事が多くの海藻レクチンの存在を認めながら
単離、精製に至ったものが少ない原因となっている。
メ科植物を中心にその存在が認められて多種のレクチン
が市販され、医療分野や生化学分野において極めて重要
な物質となっている。一方、海洋生物由来のレクチン
は、陸上生物由来のものに比べると研究例が少ないが、
海藻にも広く分布し、３２６種の海藻から２０５種の存
在が明らかとなってきている。しかしながら、海藻レク
チンの殆どが単糖やオリゴ糖でその活性が阻止されない
ため、陸上植物レクチンのように阻害単糖をリガンドや
溶出剤とするアフィニティークロマトグラフィーでの精
製が困難であり、これまでに緑藻１０種と紅藻１３種か
らレクチンが単離され、紅藻５種のものが部分精製され
ているが、これらは何れも通常の蛋白質精製法が用いら
れている［化学と生物 第３５巻、９号５８６頁（１９
９４）］。しかしながら、このような精製方法は工程が
長く、しかも長時間を要するために大量生産に適してい
ない。この事が多くの海藻レクチンの存在を認めながら
単離、精製に至ったものが少ない原因となっている。
【０００５】海藻からの抽出は、何れも乾燥粉末又はホ
モジネートを用いて４℃で２４時間から４８時間の攪拌
抽出が行なわれている。しかしながら、海藻を粉末化又
はホモジナイズして抽出した場合、色素蛋白質等の大量
の夾雑蛋白質が同時に抽出され、レクチンの単離及び精
製を困難なものとしている。また４℃での抽出について
は、レクチンが糖蛋白質又は蛋白質であるためより安全
な温度条件で抽出するための手段である。しかしなが
ら、このような抽出条件は実生産を考えると設備的にも
不利な手法と言わざるを得ず、海藻を粉末化又はホモジ
ナイズしない無処理の原藻を用いて室温での短時間抽出
が望ましい。
モジネートを用いて４℃で２４時間から４８時間の攪拌
抽出が行なわれている。しかしながら、海藻を粉末化又
はホモジナイズして抽出した場合、色素蛋白質等の大量
の夾雑蛋白質が同時に抽出され、レクチンの単離及び精
製を困難なものとしている。また４℃での抽出について
は、レクチンが糖蛋白質又は蛋白質であるためより安全
な温度条件で抽出するための手段である。しかしなが
ら、このような抽出条件は実生産を考えると設備的にも
不利な手法と言わざるを得ず、海藻を粉末化又はホモジ
ナイズしない無処理の原藻を用いて室温での短時間抽出
が望ましい。
【０００６】海藻のレクチンとして、オゴノリ属又はオ
ゴノリ種から得られたものが幾つか報告されている。以
下にそれらを列記する。
ゴノリ種から得られたものが幾つか報告されている。以
下にそれらを列記する。
【０００７】オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓ
ｐ．）からウサギ赤血球に対して強い活性を示すが、他
の動物赤血球に対しては実質上活性を示さない分子量５
２，０００のレクチン。（特開平３−２７９３９６号公
報）
ｐ．）からウサギ赤血球に対して強い活性を示すが、他
の動物赤血球に対しては実質上活性を示さない分子量５
２，０００のレクチン。（特開平３−２７９３９６号公
報）
【０００８】オゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅ
ｒｒｕｃｏｓａ）からウマ赤血球に対して強い活性を示
すレクチン。このレクチンは、４０℃以下では安定であ
るが６０℃以上で失活する。［日本食品衛生学会４６回
学会講演要旨集、２頁（１９８３）］
ｒｒｕｃｏｓａ）からウマ赤血球に対して強い活性を示
すレクチン。このレクチンは、４０℃以下では安定であ
るが６０℃以上で失活する。［日本食品衛生学会４６回
学会講演要旨集、２頁（１９８３）］
【０００９】オゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅ
ｒｒｕｃｏｓａ）から分子量３００，０００〜４００，
０００、１００，０００及び４５，０００のウマ赤血球
に対して活性を持つ３種のレクチン。［Ｎｉｐｐｏｎ
Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ．５３巻、２１３３
頁（１９８７）］
ｒｒｕｃｏｓａ）から分子量３００，０００〜４００，
０００、１００，０００及び４５，０００のウマ赤血球
に対して活性を持つ３種のレクチン。［Ｎｉｐｐｏｎ
Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ．５３巻、２１３３
頁（１９８７）］
【００１０】オゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅ
ｒｒｕｃｏｓａ）からウマ赤血球に対して最も強い活性
を示すが、ウサギ、モルモット及びヒツジ赤血球に対し
てもかなり強い活性を持つ分子４１，０００のレクチ
ン。［Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓ
ｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆ
ｉｓｈｅｒｉｅｓ．４７巻、１０７９頁（１９８１）］
ｒｒｕｃｏｓａ）からウマ赤血球に対して最も強い活性
を示すが、ウサギ、モルモット及びヒツジ赤血球に対し
てもかなり強い活性を持つ分子４１，０００のレクチ
ン。［Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓ
ｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆ
ｉｓｈｅｒｉｅｓ．４７巻、１０７９頁（１９８１）］
【００１１】オゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅ
ｒｒｕｃｏｓａ）から分子量２６，０００のレクチン。
（平成４年日本水産学会春季大会講演要旨集、３１４
頁）
ｒｒｕｃｏｓａ）から分子量２６，０００のレクチン。
（平成４年日本水産学会春季大会講演要旨集、３１４
頁）
【００１２】シラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｂｕｒ
ｓａ−ｐａｓｔｏｒｉｓ）から加熱に対して４０℃まで
安定、ｐＨは８で安定であるが、それより酸性及びアル
カリ性で活性が低下するレクチン。［Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ．５
２巻、３２３頁、（１９８６）］
ｓａ−ｐａｓｔｏｒｉｓ）から加熱に対して４０℃まで
安定、ｐＨは８で安定であるが、それより酸性及びアル
カリ性で活性が低下するレクチン。［Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ．５
２巻、３２３頁、（１９８６）］
【００１３】シラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｂｕｒ
ｓａ−ｐａｓｔｏｒｉｓ）から分子量１５，５００、中
性糖含量２０％のレクチン。［Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉ
ａ． ４６巻、９７５頁（１９９０）］
ｓａ−ｐａｓｔｏｒｉｓ）から分子量１５，５００、中
性糖含量２０％のレクチン。［Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉ
ａ． ４６巻、９７５頁（１９９０）］
【００１４】オゴノリ種（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｔ
ｉｋｖａｈｉａｅ）から分子量１５０，０００のレクチ
ン。［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．
２０７巻、３１９頁（１９９０）］
ｉｋｖａｈｉａｅ）から分子量１５０，０００のレクチ
ン。［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．
２０７巻、３１９頁（１９９０）］
【００１５】上記したように、陸上生物レクチンは、医
療、生化学分野において利用されているが、今までにな
い新しいタイプの糖結合特異性を持ったレクチンの検索
及び開発が望まれている。陸上植物レクチンの多くは、
簡単な単糖やオリゴ糖でその活性が阻止されるが、海藻
レクチンは単糖やオリゴ糖で活性が阻止されるものが少
なく、両者は明らかに糖結合特異性が異なることが知ら
れている。
療、生化学分野において利用されているが、今までにな
い新しいタイプの糖結合特異性を持ったレクチンの検索
及び開発が望まれている。陸上植物レクチンの多くは、
簡単な単糖やオリゴ糖でその活性が阻止されるが、海藻
レクチンは単糖やオリゴ糖で活性が阻止されるものが少
なく、両者は明らかに糖結合特異性が異なることが知ら
れている。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、海藻のうち
資源的に豊富なテングサ属（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ ｓ
ｐ．）を対象として、既知の海藻レクチンとは異なる糖
結合特異性を持った新規なレクチン及びその製造方法を
提供することを目的としてなされたものである。
資源的に豊富なテングサ属（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ ｓ
ｐ．）を対象として、既知の海藻レクチンとは異なる糖
結合特異性を持った新規なレクチン及びその製造方法を
提供することを目的としてなされたものである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、海藻由来
の新規なレクチンを開発すべく鋭意研究を重ねた結果、
上記した既報のものと明らかに異なる新規なレクチンを
見い出した。更に、このレクチンを工業生産を行なう場
合を想定した効率の良い抽出法と単離、精製法を発明
し、本発明を完成するに至ったものである。
の新規なレクチンを開発すべく鋭意研究を重ねた結果、
上記した既報のものと明らかに異なる新規なレクチンを
見い出した。更に、このレクチンを工業生産を行なう場
合を想定した効率の良い抽出法と単離、精製法を発明
し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１８】すなわち、本発明の請求項１による海藻レ
クチンは、紅藻テングサ属（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ ｓ
ｐ．）藻類からの抽出物質であって、ヒトＯ型、ウサギ
及びラット赤血球に対して強い凝集活性を示し、ヒトＡ
型、Ｂ型及びヒツジ赤血球に対して凝集活性を示さず、
Ｎ−アセチルキトテトラオース、フェツイン、アシアロ
フェツイン、ＢＳＭ（ウシ顎下腺ムチン）、チログロブ
リン及びラクトフェリンを強く認識する糖結合特異性を
持ち、分子量２６，０００の単量体であることを特徴と
するものである。
クチンは、紅藻テングサ属（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ ｓ
ｐ．）藻類からの抽出物質であって、ヒトＯ型、ウサギ
及びラット赤血球に対して強い凝集活性を示し、ヒトＡ
型、Ｂ型及びヒツジ赤血球に対して凝集活性を示さず、
Ｎ−アセチルキトテトラオース、フェツイン、アシアロ
フェツイン、ＢＳＭ（ウシ顎下腺ムチン）、チログロブ
リン及びラクトフェリンを強く認識する糖結合特異性を
持ち、分子量２６，０００の単量体であることを特徴と
するものである。
【００１９】 更に本発明の請求項２による海藻レクチン
の製造方法は、請求項１に記載した海藻レクチンの製造
方法であって、粉末化又はホモジナイズ処理を行なわな
い原藻から水系媒体を用いて室温で１２〜２４時間抽出
し、抽出液からキチンカラムによるアフィニティークロ
マトグラフィー及びゲル濾過により単離、精製すること
を特徴とするものである。
の製造方法は、請求項１に記載した海藻レクチンの製造
方法であって、粉末化又はホモジナイズ処理を行なわな
い原藻から水系媒体を用いて室温で１２〜２４時間抽出
し、抽出液からキチンカラムによるアフィニティークロ
マトグラフィー及びゲル濾過により単離、精製すること
を特徴とするものである。
【００２０】
【作用】以下、本発明を詳細に説明する。本発明のレク
チンは、紅藻のテングサ属（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ ｓ
ｐ．）藻類より得られる。
チンは、紅藻のテングサ属（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ ｓ
ｐ．）藻類より得られる。
【００２１】 テングサ属藻類より得られるレクチンは、
以下のような糖結合特異性を有する。 （１）ヒトＯ型、ウサギ及びラット赤血球に対して強い
凝集活性を示すが、赤血球のプロナーゼ処理によってヒ
トＯ型赤血球の凝集が消失し、ウサギ及びラット赤血球
の凝集が減弱する。またヒトＡ型、Ｂ型及びヒツジ赤血
球に対しては無処理及びプロナーゼ処理赤血球とも凝集
活性を示さない。 （２）各種単糖、オリゴ糖及び糖蛋白質を用いた赤血球
凝集阻害試験からＮ−アセチルキトテトラオース、フェ
ツイン、アシアロフェツイン、ＢＳＭ（ウシ顎下腺ムチ
ン）、チログロブリン及びラクトフェリンを強く認識す
る。また、テングサ属藻類より得られるレクチンは、以
下のような物理化学的性質を有する。 （１）分子量約２６，０００の中性糖６７．６％を含む
糖蛋白質である。 （２）溶液の安定性は、３０分間の加熱で９０℃まで、
またｐＨ４．０から１０．５の間に３時間の保持で、何
れも赤血球凝集活性は変化せず安定である。 以上のような糖結合特異性ならびに分子量及び安定性か
らみてテングサ属藻類由来のレクチンは、既知の海藻レ
クチンとは異なる新規なレクチンである。
以下のような糖結合特異性を有する。 （１）ヒトＯ型、ウサギ及びラット赤血球に対して強い
凝集活性を示すが、赤血球のプロナーゼ処理によってヒ
トＯ型赤血球の凝集が消失し、ウサギ及びラット赤血球
の凝集が減弱する。またヒトＡ型、Ｂ型及びヒツジ赤血
球に対しては無処理及びプロナーゼ処理赤血球とも凝集
活性を示さない。 （２）各種単糖、オリゴ糖及び糖蛋白質を用いた赤血球
凝集阻害試験からＮ−アセチルキトテトラオース、フェ
ツイン、アシアロフェツイン、ＢＳＭ（ウシ顎下腺ムチ
ン）、チログロブリン及びラクトフェリンを強く認識す
る。また、テングサ属藻類より得られるレクチンは、以
下のような物理化学的性質を有する。 （１）分子量約２６，０００の中性糖６７．６％を含む
糖蛋白質である。 （２）溶液の安定性は、３０分間の加熱で９０℃まで、
またｐＨ４．０から１０．５の間に３時間の保持で、何
れも赤血球凝集活性は変化せず安定である。 以上のような糖結合特異性ならびに分子量及び安定性か
らみてテングサ属藻類由来のレクチンは、既知の海藻レ
クチンとは異なる新規なレクチンである。
【００２２】 本発明の レクチンは、以下のようにして得
ることができる。従来、海藻からのレクチンの抽出は、
乾燥粉末又はホモジネートを用いて４℃で２４〜２８時
間の撹拌抽出で行なわれている。また単離、精製法は、
アフィニティークロマトグラフィーが困難なため通常の
蛋白質精製法が用いられており、精製の工程が長く、長
時間を要するため実生産を考えると設備的にも不利な手
法である。
ることができる。従来、海藻からのレクチンの抽出は、
乾燥粉末又はホモジネートを用いて４℃で２４〜２８時
間の撹拌抽出で行なわれている。また単離、精製法は、
アフィニティークロマトグラフィーが困難なため通常の
蛋白質精製法が用いられており、精製の工程が長く、長
時間を要するため実生産を考えると設備的にも不利な手
法である。
【００２３】 以下に述べる本発明のレクチンの抽出及び
単離、精製方法は、この問題を解決するために本願発明
者によって開発されたものであり、海藻からのレクチン
の製造方法として画期的なものである。
単離、精製方法は、この問題を解決するために本願発明
者によって開発されたものであり、海藻からのレクチン
の製造方法として画期的なものである。
【００２４】 抽出は、無処理の原藻を用いることによ
り、粉末化又はホモジナイズした時に同時に抽出される
大量の色素蛋白質が抽出されず、次工程のクロマトグラ
フィーによる単離、精製を非常に容易なものとした。ま
た、このようにして得られた精製レクチンは、３０分間
の加熱で７０℃においても赤血球凝集活性は変化せず、
非常に安定であるため以下のような室温での抽出、単離
及び精製が可能となった。
り、粉末化又はホモジナイズした時に同時に抽出される
大量の色素蛋白質が抽出されず、次工程のクロマトグラ
フィーによる単離、精製を非常に容易なものとした。ま
た、このようにして得られた精製レクチンは、３０分間
の加熱で７０℃においても赤血球凝集活性は変化せず、
非常に安定であるため以下のような室温での抽出、単離
及び精製が可能となった。
【００２５】 まず、海藻は無処理の原藻を用い、水系媒
体で抽出する。水系媒体としては、生理食塩水にリン酸
緩衝液やトリス−塩酸緩衝液のような緩衝液を加えたも
のが好ましい。抽出は、好ましくは、４〜２５℃の室温
で１２〜２４時間浸漬又は撹拌によって行なわれる。
体で抽出する。水系媒体としては、生理食塩水にリン酸
緩衝液やトリス−塩酸緩衝液のような緩衝液を加えたも
のが好ましい。抽出は、好ましくは、４〜２５℃の室温
で１２〜２４時間浸漬又は撹拌によって行なわれる。
【００２６】 一方、キチンを充填したカラム（キチンカ
ラム）を用意する。キチンは、市販の粉末キチンや多孔
質粒状キチン（例えばマリンカイト：富士紡績製）を用
いることができる。キチンカラムは、キチンを適当なク
ロマトグラフィー用カラムに充填し１００ｍＭの濃度の
ＮＨ４ＯＨで洗浄した後、上記の抽出に用いる溶液で洗
浄、平衡化することによって調製する。
ラム）を用意する。キチンは、市販の粉末キチンや多孔
質粒状キチン（例えばマリンカイト：富士紡績製）を用
いることができる。キチンカラムは、キチンを適当なク
ロマトグラフィー用カラムに充填し１００ｍＭの濃度の
ＮＨ４ＯＨで洗浄した後、上記の抽出に用いる溶液で洗
浄、平衡化することによって調製する。
【００２７】 本発明のレクチンは、上記抽出液をキチン
カラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行
い、吸着画分を例えば５０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のＮ
Ｈ４ＯＨで溶離することによって単離し、次に、ゲル濾
過クロマトグラフィーで精製することによって単離、精
製することができる。
カラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行
い、吸着画分を例えば５０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のＮ
Ｈ４ＯＨで溶離することによって単離し、次に、ゲル濾
過クロマトグラフィーで精製することによって単離、精
製することができる。
【００２８】
【発明の効果】本発明の海藻由来のレクチンは、新規な
ものであって、ヒトＯ型、ウサギ及びラット赤血球に対
して強い凝集活性を示し、ヒトＡ型、Ｂ型及びヒツジ赤
血球に対しては活性を示さない。またプロナーゼ処理に
よりヒトＯ型、ウサギ及びラット赤血球に対しては、そ
の凝集活性が消失又は減弱するという糖特異性を有し、
熱及び広いｐＨ範囲で安定である。したがって、この特
性を利用して医療分野や生化学分野において広く利用し
得る用途を持っている。また本発明の製造方法は、既報
の方法と比べて工程が大幅に短縮され、かつ室温で製造
できるために設備的にも多大な利点をもたらすものであ
る。
ものであって、ヒトＯ型、ウサギ及びラット赤血球に対
して強い凝集活性を示し、ヒトＡ型、Ｂ型及びヒツジ赤
血球に対しては活性を示さない。またプロナーゼ処理に
よりヒトＯ型、ウサギ及びラット赤血球に対しては、そ
の凝集活性が消失又は減弱するという糖特異性を有し、
熱及び広いｐＨ範囲で安定である。したがって、この特
性を利用して医療分野や生化学分野において広く利用し
得る用途を持っている。また本発明の製造方法は、既報
の方法と比べて工程が大幅に短縮され、かつ室温で製造
できるために設備的にも多大な利点をもたらすものであ
る。
【００２９】
【実施例】以下、紅藻類テングサ属のマクサ（Ｇｅｌｉ
ｄｉｕｍ ａｍａｎｓｉｉ）を用いて行なった実施例及
び試験例により、本発明を更に詳細に説明するが、これ
らは本発明の範囲を何ら制限するものではない。また以
下には、本発明と併せて研究した紅藻類オゴノリ属のオ
ゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）
を用いた試験例を併記する。
ｄｉｕｍ ａｍａｎｓｉｉ）を用いて行なった実施例及
び試験例により、本発明を更に詳細に説明するが、これ
らは本発明の範囲を何ら制限するものではない。また以
下には、本発明と併せて研究した紅藻類オゴノリ属のオ
ゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）
を用いた試験例を併記する。
【００３０】 実施例・・・ （１）抽出、天日乾燥した原藻１００ｇに１００ｍＭリ
ン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４（以下、ＰＢＳと称
する）２Ｌを加え、２０〜２５℃の室温で２４時間撹拌
抽出した。次いで藻体を除去し、抽出液を濾過した。
ン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４（以下、ＰＢＳと称
する）２Ｌを加え、２０〜２５℃の室温で２４時間撹拌
抽出した。次いで藻体を除去し、抽出液を濾過した。
【００３１】 （２）アフィニティークロマトグラフィ
ー、キチンカラムは、キチンをＰＢＳで平衡化後、クロ
マトグラフィー用カラムに充填し、１００ｍＭ ＮＨ４
ＯＨで溶出洗浄した後、ＰＢＳで溶出洗浄することによ
って調製した。このキチンカラムに上記抽出液を通し、
蛋白質成分の溶出がみられなくなるまでＰＢＳで溶出洗
浄した。キチンカラムへの吸着画分は、１００ｍＭ Ｎ
Ｈ４ＯＨ溶離し、純水に対して透析後、凍結乾燥した。
ー、キチンカラムは、キチンをＰＢＳで平衡化後、クロ
マトグラフィー用カラムに充填し、１００ｍＭ ＮＨ４
ＯＨで溶出洗浄した後、ＰＢＳで溶出洗浄することによ
って調製した。このキチンカラムに上記抽出液を通し、
蛋白質成分の溶出がみられなくなるまでＰＢＳで溶出洗
浄した。キチンカラムへの吸着画分は、１００ｍＭ Ｎ
Ｈ４ＯＨ溶離し、純水に対して透析後、凍結乾燥した。
【００３２】 （３）ゲル濾過クロマトグラフィー、上記
凍結乾燥物をＰＢＳに溶解し、予めＰＢＳで平衡化した
トヨパールＨＷ６５Ｆによって精製した。活性画分を純
水に対して透析し、凍結乾燥によってレクチンを得た。
凍結乾燥物をＰＢＳに溶解し、予めＰＢＳで平衡化した
トヨパールＨＷ６５Ｆによって精製した。活性画分を純
水に対して透析し、凍結乾燥によってレクチンを得た。
【００３３】 試験例・・・ 分子量の測定、還元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、Ｌａｅｍ
ｍｌｉの方法で行なった。またゲル濾過法による分子量
の測定は、トヨパールＨＷ５５Ｆを用いて行なった。マ
クサ由来のレクチンは、還元及び非還元条件下でのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで何れも分子量２６，０００の単一バンド
が検出されたことから、分子量２６，０００の単量体で
あることを示している。オゴノリ由来のレクチンは、還
元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで何れも分子
量２９，０００及び１６，０００の二つのバンドが検出
され、ゲル濾過方法で分子量４５，０００と算定された
ことから、オゴノリ由来のレクチンは、分子量２９，０
００及び１６，０００のジスルフィド結合を持たない二
つのサブユニットからなる分子量４５，０００の二量体
であることを示している。
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、Ｌａｅｍ
ｍｌｉの方法で行なった。またゲル濾過法による分子量
の測定は、トヨパールＨＷ５５Ｆを用いて行なった。マ
クサ由来のレクチンは、還元及び非還元条件下でのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで何れも分子量２６，０００の単一バンド
が検出されたことから、分子量２６，０００の単量体で
あることを示している。オゴノリ由来のレクチンは、還
元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで何れも分子
量２９，０００及び１６，０００の二つのバンドが検出
され、ゲル濾過方法で分子量４５，０００と算定された
ことから、オゴノリ由来のレクチンは、分子量２９，０
００及び１６，０００のジスルフィド結合を持たない二
つのサブユニットからなる分子量４５，０００の二量体
であることを示している。
【００３４】 中性糖含量の測定 中性糖含量の測定は、
オルシノール−硫酸法で行なった。マクサ及びオゴノリ
由来のレクチンの中性糖含量は、それぞれ６７．６％及
び４３．８％であった。
オルシノール−硫酸法で行なった。マクサ及びオゴノリ
由来のレクチンの中性糖含量は、それぞれ６７．６％及
び４３．８％であった。
【００３５】 糖結合特異性 糖結合特異性は、血液特異
性ならびに各種単糖、オリゴ糖及び糖蛋白質を用いた赤
血球凝集阻害試験により調べた。
性ならびに各種単糖、オリゴ糖及び糖蛋白質を用いた赤
血球凝集阻害試験により調べた。
【００３６】 マクサ及びオゴノリ由来のレクチンの血液
特異性を表１に示した。
特異性を表１に示した。
【表１】
【００３７】マクサ由来のレクチンは、ヒト赤血球にお
いてはＯ型赤血球のみに強い凝集活性を示し、この活性
は赤血球のプロナーゼ処理により消失した。動物赤血球
に対しては、ウサギ及びラット赤血球に対して強い、ウ
マ赤血球に対しては弱い凝集活性を示し、この活性は赤
血球のプロナーゼ処理によりウサギ及びラット赤血球は
減弱され、ウマ赤血球は増強された。またヒツジ赤血球
に対しては凝集活性を示さなかった。
いてはＯ型赤血球のみに強い凝集活性を示し、この活性
は赤血球のプロナーゼ処理により消失した。動物赤血球
に対しては、ウサギ及びラット赤血球に対して強い、ウ
マ赤血球に対しては弱い凝集活性を示し、この活性は赤
血球のプロナーゼ処理によりウサギ及びラット赤血球は
減弱され、ウマ赤血球は増強された。またヒツジ赤血球
に対しては凝集活性を示さなかった。
【００３８】 オゴノリ由来のレクチンは、ウサギ赤血球
のみに強い凝集活性を示し、ヒトＡ型、Ｂ型、Ｏ型、ウ
マ、ヒツジ及びラット赤血球に対しては実質上凝集活性
を示さなかった。しかし本レクチンは、プロナーゼ処理
した赤血球に対しては、何れも凝集活性を示した。
のみに強い凝集活性を示し、ヒトＡ型、Ｂ型、Ｏ型、ウ
マ、ヒツジ及びラット赤血球に対しては実質上凝集活性
を示さなかった。しかし本レクチンは、プロナーゼ処理
した赤血球に対しては、何れも凝集活性を示した。
【００３９】 マクサ及びオゴノリ由来のレクチンの赤血
球凝集阻害試験の結果を表２に示した。
球凝集阻害試験の結果を表２に示した。
【表２】
【００４０】マクサ由来のレクチンの赤血球凝集活性
は、単糖及びオリゴ糖のうちＤ−グルコース、Ｄ−ガラ
クトース、Ｄ−マンノース及びＤ−フコース等の中性
糖、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−
Ｄ−ガラクトサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミ
ン等のＮ−アセチルアミノ糖、Ｎ−アセチルノイラミン
酸、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｎ−アセチルキトビオ
ース及びＮ−アセチルキトトリオースによって阻害され
ず、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン及びＤ−マ
ンノサミン等のアミノ糖ならびにＮ−アセチルキトテト
ラオースによって阻害された。また糖蛋白質では、フェ
ツイン、アシアロフェツイン、ＢＳＭ（ウシ顎下腺ムチ
ン）、チログロブリン及びラクトフェリンによって阻害
された。これらの結果から、本発明のマクサ由来のレク
チンはＤ−フコースとは結合しないが、Ｎ−アセチルキ
トテトラオースと結合すること、また上記したようにヒ
トＯ型赤血球を特異的に凝集させることから、シチサス
型抗Ｈレクチンであることが伺われる。
は、単糖及びオリゴ糖のうちＤ−グルコース、Ｄ−ガラ
クトース、Ｄ−マンノース及びＤ−フコース等の中性
糖、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−
Ｄ−ガラクトサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミ
ン等のＮ−アセチルアミノ糖、Ｎ−アセチルノイラミン
酸、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｎ−アセチルキトビオ
ース及びＮ−アセチルキトトリオースによって阻害され
ず、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン及びＤ−マ
ンノサミン等のアミノ糖ならびにＮ−アセチルキトテト
ラオースによって阻害された。また糖蛋白質では、フェ
ツイン、アシアロフェツイン、ＢＳＭ（ウシ顎下腺ムチ
ン）、チログロブリン及びラクトフェリンによって阻害
された。これらの結果から、本発明のマクサ由来のレク
チンはＤ−フコースとは結合しないが、Ｎ−アセチルキ
トテトラオースと結合すること、また上記したようにヒ
トＯ型赤血球を特異的に凝集させることから、シチサス
型抗Ｈレクチンであることが伺われる。
【００４１】 オゴノリ由来のレクチンの赤血球凝集活性
は、検査した全ての単糖及びオリゴ糖によって阻害され
なかった。糖蛋白質では、フェツイン、アシアロフェツ
イン、ＢＳＭ（ウシ顎下腺ムチン）、アシアロＢＳＭ、
チログロブリン、ラクトフェリンによって強く阻害さ
れ、α１−酸性糖蛋白質、グリコフォリン及びアシアロ
グリコフォリンによって弱く阻害された。
は、検査した全ての単糖及びオリゴ糖によって阻害され
なかった。糖蛋白質では、フェツイン、アシアロフェツ
イン、ＢＳＭ（ウシ顎下腺ムチン）、アシアロＢＳＭ、
チログロブリン、ラクトフェリンによって強く阻害さ
れ、α１−酸性糖蛋白質、グリコフォリン及びアシアロ
グリコフォリンによって弱く阻害された。
【００４２】 溶液での安定性、マクサ及びオゴノリ由来
のレクチンの溶液での安定性は、３０℃〜９０℃までの
加温及びｐＨ４．０〜１０．５での保持で行なった。
のレクチンの溶液での安定性は、３０℃〜９０℃までの
加温及びｐＨ４．０〜１０．５での保持で行なった。
【００４３】 温度安定性はマクサ及びオゴノリ由来のレ
クチンとも１００ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水に溶解
し、それぞれ３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０
℃、８０℃及び９０℃で３０分間加温し、冷却後、赤血
球凝集活性を測定した。
クチンとも１００ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水に溶解
し、それぞれ３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０
℃、８０℃及び９０℃で３０分間加温し、冷却後、赤血
球凝集活性を測定した。
【００４４】 マクサ及びオゴノリ由来のレクチンの温度
安定性試験結果を図１に示した。
安定性試験結果を図１に示した。
【００４５】 マクサ由来のレクチンは９０℃まで、オゴ
ノリ由来のレクチンは７０℃まで赤血球を凝集活性に変
化はなく、安定であった。
ノリ由来のレクチンは７０℃まで赤血球を凝集活性に変
化はなく、安定であった。
【００４６】 ｐＨ安定剤は、マクサ及びオゴノリ由来の
レクチンとも、０．１５ＭＮａＣ１に溶解し、ｐＨ４．
０から１０．５まで７種類の緩衝液（ｐＨ４．０及び
５．０；２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０及び７．０；
２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０；トリス−塩酸緩衝
液、ｐＨ９．０及び１０．５；グリシン−ＮａＯＨ緩衝
液）の等量と混合し、３時間静置した後、赤血球凝集活
性を測定した。
レクチンとも、０．１５ＭＮａＣ１に溶解し、ｐＨ４．
０から１０．５まで７種類の緩衝液（ｐＨ４．０及び
５．０；２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０及び７．０；
２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０；トリス−塩酸緩衝
液、ｐＨ９．０及び１０．５；グリシン−ＮａＯＨ緩衝
液）の等量と混合し、３時間静置した後、赤血球凝集活
性を測定した。
【００４７】 マクサ及びオゴノリ由来のレクチンのｐＨ
安定性試験結果を図２に示した。
安定性試験結果を図２に示した。
【００４８】 マクサ及びオゴノリ由来のレクチンともｐ
Ｈ４．０から１０．５の広い範囲で赤血球凝集活性に変
化はなく、安定であった。
Ｈ４．０から１０．５の広い範囲で赤血球凝集活性に変
化はなく、安定であった。
【００４９】 本発明のマクサ由来のレクチンは、オゴノ
リ由来のレクチンとともに、熱及び広いｐＨ範囲でその
赤血球凝集活性が変化せず、非常に安定なものであっ
た。
リ由来のレクチンとともに、熱及び広いｐＨ範囲でその
赤血球凝集活性が変化せず、非常に安定なものであっ
た。
【図１】マクサ及びオゴノリ由来のレクチンの温度安定
性試験結果を示すグラフ図
性試験結果を示すグラフ図
【図２】マクサ及びオゴノリ由来のレクチンのｐＨ安定
性試験結果を示すグラフ図
性試験結果を示すグラフ図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｇ０１Ｎ 33/80 Ｇ０１Ｎ 33/80 (56)参考文献 Ｄａｌｔｏｎ，Ｓｈａｎａ Ｒ ｅｔ ａｌ，”Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｍｉｔｏｇｅ ｎｓ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｎｅ ａｌｇ ａｅ．”，Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌ．（1995），Ｖｏｌ．２（３）, ｐ149−155 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 1/16 C07K 1/22 C07K 14/42 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 紅藻テングサ属（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ ｓ
ｐ．）藻類からの抽出物質であって、ヒトＯ型、ウサギ
及びラット赤血球に対して強い凝集活性を示し、ヒトＡ
型、Ｂ型及びヒツジ赤血球に対して凝集活性を示さず、
Ｎ−アセチルキトテトラオース、フェツイン、アシアロ
フェツイン、ＢＳＭ（ウシ顎下腺ムチン）、チログロブ
リン及びラクトフェリンを強く認識する糖結合特異性を
持ち、分子量２６，０００の単量体である海藻レクチ
ン。 - 【請求項２】 請求項１に記載した海藻レクチンの製造
方法であって、粉末化又はホモジナイズ処理を行なわな
い原藻から水系媒体を用いて室温で１２〜２４時間抽出
し、抽出液からキチンカラムによるアフィニティークロ
マトグラフィー及びゲル濾過により単離、精製すること
を特徴とする海藻レクチンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7146902A JP2826807B2 (ja) | 1995-05-23 | 1995-05-23 | 海藻レクチン及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7146902A JP2826807B2 (ja) | 1995-05-23 | 1995-05-23 | 海藻レクチン及びその製造方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10123012A Division JP3041598B2 (ja) | 1998-05-06 | 1998-05-06 | 海藻レクチン及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08313531A JPH08313531A (ja) | 1996-11-29 |
| JP2826807B2 true JP2826807B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
ID=15418159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7146902A Expired - Lifetime JP2826807B2 (ja) | 1995-05-23 | 1995-05-23 | 海藻レクチン及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2826807B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100397531B1 (ko) * | 2000-07-26 | 2003-09-13 | 주식회사 선진애드 | 한국산 갈조류 유래의 면역증강용 추출물 및 그 제조방법 |
-
1995
- 1995-05-23 JP JP7146902A patent/JP2826807B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｄａｌｔｏｎ，Ｓｈａｎａ Ｒ ｅｔ ａｌ，"Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｍｉｔｏｇｅｎｓ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｎｅ ａｌｇａｅ．"，Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５），Ｖｏｌ．２（３），ｐ１４９−１５５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08313531A (ja) | 1996-11-29 |
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