CN111870998A

CN111870998A - 一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置及其使用方法

Info

Publication number: CN111870998A
Application number: CN202010717625.5A
Authority: CN
Inventors: 张真庆; 邱飘飘; 徐乃玉; 李笃信; 张明锦
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2020-11-03

Abstract

本发明提供一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置及其使用方法，包括恒流泵、第一切换阀、第一凝集素柱、第二凝集素柱、第二切换阀和馏分收集器。能够快速高效，一次性纯化两种多糖；而且专属性好，针对海参多糖的结构特点，配置专用的凝集素亲和柱可采用特定的凝集素亲和柱，制备具有一定组成的糖链，并能保持待制备物质的原有结构的优越性；相比传统方法如膜过滤、层析纯化方法，其样品纯度高。

Description

一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置及其使用方法

技术领域

本发明属于生物医药纯化装置领域，具体涉及一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置及其使用方法。

背景技术

多糖类(polysaccharide)物质是构成生命的四大基本物质之一，广泛存在于高等植物、动物、微生物、地衣和海藻等中，如植物的种子、茎和叶组织、动物粘液、昆虫及甲壳动物的壳真菌、细菌的胞内胞外等。多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫促进等方面发挥着生物活性作用，例如糖胺聚糖类物质中的肝素具有抗凝血活性、硫酸化多糖具有抗HIV活性及抗凝血活性，羧甲基化多糖具有抗肿瘤活性。因此对多糖的研究与开发已越来越引起人们的广泛关注。但是多糖类物质分子量较大，提取分离以及结构鉴定都存在着一定的困难。鉴于凝集素有这种特异性结合糖类物质的特性，在糖类物质的分离纯化和结构鉴定中一定会发挥越来越大的作用。海参多糖是海参体壁中提取的多糖，主要包括两类：一类主要由岩藻糖组成的海参岩藻聚糖，另一类主要由葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基半乳糖以及岩藻糖组成的海参糖胺聚糖。两类糖结构组成不同，但均有重要的生物活性而被广泛关注。因此。完成该类的多糖的研究和应用，制备出高纯度、高均一性的多糖是至关重要的第一步。目前，海参粗多糖的纯化方法主要有：分级醇沉、膜分离技术、离子交换色谱法，或者多种方法结合制备目标糖类化合物。分级醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。其依据是在钠盐、钡盐溶液中不同浓度的乙醇对多糖微粒水化膜的破坏能力不同和溶液介电常数降低程度的不同，从而使多糖分级沉淀。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70％左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5h，多糖的质量分数和得率均较高。但是，分级醇沉法只能依据多糖类物质的分子量对多糖进行分离纯化，不能对其结构进行选择。膜分离技术(MST)是一种高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分离介质，通过在膜两侧施加某种推动力(压力差、化学位差、电位差等)，使原料液中组分有选择性的通过膜。目前应用较多的是超滤和微滤技术，该类技术主要是利用糖的分子量和尺寸大小对不同分子量级别的多糖进行分离和纯化。依据是料液中因各种分子的分子量不同，在膜两侧压力差的驱动下选择108数量级的透过滤膜，可快速温和的将不同分子量的多精分离。超滤法优点是操作简便，分离精度高，能耗低、可以很好的保持海参多精的活性。同样，该方法依然不能对其结构进行选择，即没有结构特异性。

离子交换色谱法可以对带不同电荷的样品进行分离，由于样品中的物质对离子交换剂(作为固定相)的亲和力不同。因此，通过不同梯度浓度的洗脱液做为流动相，其具有不同的离子强度和pH值，可将样品依次洗脱出来，酸性多糖用该法分离纯化可达到较好的效果。常采用离子交换葡聚糖凝胶柱、丙烯葡聚糖凝胶柱和葡聚糖凝胶柱三者联用，即先进行DEAE-SephadexA柱层析，利用糖所带的电负性与阴离子交换色谱柱结合，用氯化钠溶液进行洗脱。洗脱组分进一步用SephacrylS柱层析，得到主要组分再用SephadexG 100柱层析，有时会有较高的得率。离子交换色谱法依据糖分子所带电荷的差异以及分子量两个特征对多糖进行分离纯化，但是一般多糖的分子量越大，多糖片段的电负性越强结合能力越强，因此，该类纯化方法也是主要依据多糖的分子量差异对多糖进行分离纯化。

凝集素亲和色谱分离纯化多糖，采用含有特定凝集素亲和色谱柱，粗多糖样品上样，凝集素亲和柱与多糖样品中特定的糖单元进行结合，上样完成后，选用合适的流动相对结合的多糖组分进行洗脱和收集。该类分离纯化方法，一般一次仅能结合一类多糖，操作时间长。凝集素(Lectin)作为一类糖结合蛋白，可从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提取，因其能凝集红血球(含血型物质)，故名凝集素。在过去的20年里，超过100种凝集素已被纯化，也被测定发现，它们都有一定的糖结合专一性，

常用的为植物凝集素(Phytoagglutin，PNA)，通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A(Conconvalina，Con A)、麦胚素(Wheat germ agglutinin，WGA)、花生凝集素(Peanutagglutinin，PNA)和大豆凝集素(Soybean agglutinin，SBA)等，凝集素是它们的总称。不同凝集素都有能特异性结合的糖如下表1。

表1

注：Man：甘露糖；Glc：葡萄糖；GlcNAc：N-乙酰氨基半乳糖；Gal：半乳糖；GalNAc：N-乙酰氨基半乳糖胺。

基于凝集素这一特性，市场上已经开发出凝集素亲和色谱柱和各种特定的可用于筛选糖蛋白的试剂盒，主要用于糖蛋白类物质的分离或鉴定，但这种产品或是分析系统每次可分析的样品量和种类相对较少，大量样品的处理以及复杂样品的快速分析仍受到了限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置及其使用方法，来解决目前海参多糖不能快速纯化等问题。

为解决上述技术问题，本发明提供一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置，包括：包括：恒流泵、第一切换阀、第一凝集素柱、第二凝集素柱、第二切换阀和馏分收集器，

所述恒流泵的出口端通过第一管路连接第一切换阀的1号位，所述第一切换阀的2号位通过第二管路与所述第一凝集素柱的进口端连接，所述第一切换阀的3号位通过第五管路与所述第二凝集素柱的进口端连接，所述第一切换阀的4号位通过第七管路与所述馏分收集器的进口端连接，所述第一凝集素柱的出口端通过第三管路与所述第二切换阀的1号位连接，所述第二凝集素柱的出口端通过第六管路与所述第二切换阀的2号位连接，所述第二切换阀的3号位通过第四管路与所述馏分收集器的进口端连接。

本发明还提供一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖的使用方法，包括步骤：

(1)串联凝集素亲和柱：准备如权利要求1所述一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置；

(2)海参粗多糖处理及上样：将海参粗多糖粗品溶于缓冲液体系中，获得海参粗多糖样品，所述第一凝集素柱和第二凝集素柱处于串联状态，所述海参粗多糖样品经所述恒流泵上样后，通过第一管路进入所述第一切换阀的1号位，再从所述第一切换阀的2号位经第二管路到达第一凝集素柱，所述海参粗多糖样品中的海参岩藻聚糖组份被吸附保留于所述第一凝集素柱，所述海参粗多糖样品从第三管路流入第二切换阀的1号位，再从第二切换阀的2号位经第六管路到达第二凝集素柱，所述海参粗多糖样品中的海参糖胺聚糖组份被吸附并保留于所述第二凝集素柱，所述海参粗多糖样品通过第五管路进入所述第一切换阀的3号位，再从第一切换阀的4号位通过第七管路到达馏分收集器的废液瓶，重复本步骤，除去未能有效结合的多糖和其他物质；

(3)海参岩藻聚糖的纯化；打开恒流泵输送NaCl，所述NaCl通过第一管路进入所述第一切换阀的1号位，再从所述第一切换阀的2号位通过第二管路进入所述第一凝集素柱，所述NaCl洗脱所述第一凝集素柱，将洗脱下来的海参岩藻聚糖通过第三管路进入第二切换阀的1号位，再从第二切换阀的3号位经第四管路到达所述馏分收集器的一号样品瓶中，即得到纯化的海参岩藻聚糖馏分；

(4)海参糖胺聚糖的纯化；打开恒流泵输送NaCl，所述NaCl通过第一管路进入所述第一切换阀的1号位，再从第一切换阀的3号位通过第五管路进入所述第二凝集素柱，所述NaCl洗脱所述第二凝集素柱，将洗脱下来的海参糖胺聚糖通过第6管路进入所述第二切换阀的2号位，再从所述第二切换阀的3号位经第四管路到达所述馏分收集器的二号样品瓶中，即得到纯化的海参糖胺聚糖馏分；

(5)脱盐：对一号样品瓶中的纯化的海参岩藻聚糖馏分、二号样品瓶中的纯化的海参糖胺聚糖馏分采用葡聚糖凝胶色谱柱G100进行脱盐；

(6)冻干：用冷冻干燥机对一号样品瓶中的纯化的海参岩藻聚糖馏分、二号样品瓶中的纯化的海参糖胺聚糖馏分进行浓缩冻干。

作为本发明所述一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法的一种优选方案，步骤(1)中所述第一凝集素柱为荆豆凝集素亲和柱、大豆凝集素亲和柱、麦胚凝集素亲和柱中的任意一种，所述第二凝集素柱为荆豆凝集素亲和柱、大豆凝集素亲和柱、麦胚凝集素亲和柱中的任意一种。

作为本发明所述一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法的一种优选方案，步骤(2)中所述缓冲液体系中的缓冲液为纯水、TRIS-HCL缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸铵缓冲液中的任意一种。

作为本发明所述一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法的一种优选方案，步骤(2)中所述海参粗多糖样品的浓度为10mg/mL，pH为5.0。

作为本发明所述一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法的一种优选方案，步骤(2)中所述上样体积为第一凝集素柱体积的0.2～10倍。

作为本发明所述一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法的一种优选方案，步骤(2)的重复次数为3-5次。

作为本发明所述一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法的一种优选方案，在步骤(3)中，所述NaCl洗脱的洗脱步骤为：在0-10min时间段，0M NaCl升至1MNaCl，在10-30min时间段，维持1MNaCl；在步骤(4)中，所述NaCl洗脱的洗脱步骤为：在0-15min时间段，0M NaCl升至1.5M NaCl，在15-45min时间段，维持1.5M NaCl。

作为本发明所述一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法的一种优选方案，步骤(6)中浓缩的温度为-48℃、时间为48h。

与现有技术相比，本发明提出的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置及其使用方法，与现有技术相比，具有明显的优势：

(1)快速高效，一次性纯化两种多糖；

(2)专属性好，针对海参多糖的结构特点，配置专用的凝集素亲和柱可采用特定的凝集素亲和柱，制备具有一定组成的糖链，并能保持待制备物质的原有结构的优越性；

(3)相比传统方法如膜过滤、层析纯化方法，其样品纯度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，

图1为本发明的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的结构示意图；

其中：1为恒流泵、2为第一切换阀、A为第一凝集素柱、B为第二凝集素柱、3为第二切换阀、D为馏分收集器、4为第四管路、5为第一管路、6为第二管路、7为第五管路、8为第七管路、9为第三管路、10为第六管路。

图2为本发明的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法的海参粗多糖处理及上样步骤流路示意图；

图3为本发明的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法的海参岩藻聚糖的纯化步骤流路示意图；

图4为本发明的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法的海参糖胺聚糖的纯化步骤流路示意图；

其中，图2-4中箭头以及实线表示该状态下为通路，叉(×)以及虚线表示该模式下不通。

图5为本发明的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法所制备的海参岩藻聚糖的单糖组成示意图；

图6为本发明的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法所制备的海参糖胺聚糖的单糖组成示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，表示一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置及其使用方法结构的示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。

实施例1

一种海参多糖的纯化工艺及其装置，包括以下步骤：

1)串联凝集素亲和柱：如图1所示，恒流泵1通过第一管路5与第一切换阀2的1号位相连；第一切换阀2的2号位通过第二管路6与第一凝集素柱A相连，第一凝集素柱A通过第三管路9与第二切换阀3的1号位相连；第一切换阀2的3号位通过第五管路7与第二凝集素柱B相连，第二凝集素柱B通过第六管路10与第二切换阀3的2号位相连，第二切换阀3的3号位通过第四管路4与馏分收集器D相连。第一凝集素柱A选择荆豆凝集素亲和柱，第二凝集素柱B选择麦胚凝集素亲和柱。

2)海参粗多糖处理及上样：如图2所示，将样品溶于50mM的醋酸铵缓冲液体系，pH5.0，配置成10mg/mL，用恒流泵1抽取上样，上样体积为5mL；此时，第一凝集素柱A和第二凝集素柱B处于串联状态，海参粗多糖样品经恒流泵1上样后，过第一切换阀2后到达第一凝集素柱A，其中的海参岩藻聚糖被特异性的吸附而保留，海参糖胺聚糖组份经第二切换阀2到达第二凝集素柱B，被特异性的吸附而保留，海参粗多糖样品中的其他非此两类的海参多糖，到达馏分收集器D的废液瓶。并且用醋酸铵缓冲溶液对第一凝集素柱A、第二凝集素柱B进行反复多次冲洗，除去未能有效结合的多糖和其他物质。

3)海参岩藻聚糖的纯化：如图3所示，切换第二切换阀3，使第一凝集素柱A与馏分收集器D相连，切换馏分收集器D，使收集流路位于一号样品瓶上方。打开恒流泵1，输送1MNaCl，洗脱第一凝集素柱A，洗脱下来的海参岩藻聚糖馏分被收集到一号样品瓶中，即得到纯化的海参岩藻聚糖馏分。

4)海参糖胺聚糖的纯化：如图4所示，切换第一切换阀2，使恒流泵1与第二凝集素柱B连接，切换第二切换阀3，使第二凝集素柱B与馏分收集器相连，切换馏分收集器D，使收集流路位于二号样品瓶上方。打开恒流泵1，输送1.5M NaCl，洗脱第二凝集素柱B，洗脱下来的海参糖胺聚糖馏分被收集到二号样品瓶中，即得到纯化的海参糖胺聚糖馏分。

5)脱盐：将纯化的海参岩藻聚糖馏分、纯化的海参糖胺聚糖馏分采用葡聚糖凝胶色谱柱G100对多糖进行脱盐。

6)冻干：冷冻干燥机对制备的样品进行浓缩冻干。

7)分析表征：依据海参岩藻聚糖中主要含有岩藻糖，海参糖胺聚糖主要由葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基半乳糖、岩藻糖组成的特点，对制备的多糖样品进行单糖组分的测定。分别称取制备得到的冻干后的两类多糖5mg，溶于2M的三氟乙酸(TFA)溶液中，在100℃中降解24h。降解完成后，将样品中的TFA进行旋蒸除去，配置成100ppm，过滤后，在万通IC850离子色谱仪上对单糖组分分别进行测定。测定结果如图5和6，对制备纯化的海参岩藻聚糖进行单糖组成测定，结果显示该样品中只含有岩藻糖不含有海参糖胺聚糖组分；对制备纯化的海参糖胺聚糖样品进行单糖组成测定，结果显示该样品中含有岩藻糖、N-乙酰氨基半乳糖以及葡萄糖醛酸(图6出峰顺序)，且该样品中的单糖组成比文献中报道一致，则表示该样品样品纯度相对较高且不含有海参岩藻聚糖。

实施例2

1)本实施例，第一凝集素柱A选择为大豆凝集素亲和柱，第二凝集素柱B为荆豆凝集素亲和柱。

2)海参粗多糖处理及上样：如图2所示，将样品溶于纯水中，配置成10mg/mL，用恒流泵1抽取上样，上样体积为5mL；此时，第一凝集素柱A和第二凝集素柱B处于串联状态，海参粗多糖样品经恒流泵1上样后，过第一切换阀2后到达第一凝集素柱A，其中的海参糖胺聚糖组份被特异性的吸附而保留，海参岩藻聚糖组份经第二切换阀3到达第二凝集素柱B，被特异性的吸附而保留，海参粗多糖样品中其他非此两类的海参多糖，到达馏分收集器D的废液瓶。

3)海参糖胺聚糖的纯化：如图3所示，切换第二切换阀3，使第一凝集素柱A与馏分收集器D相连，切换馏分收集器D，使收集流路位于一号样品瓶上方。打开恒流泵1，输送1.5MNaCl，洗脱第一凝集素柱A，洗脱下来的海参糖胺聚糖馏分被收集到一号样品瓶中，即得到纯化的糖胺聚糖馏分。

4)海参岩藻聚糖的纯化：如图4所示，切换第一切换阀2，使恒流泵1与第二凝集素柱B连接，切换第二切换阀3，使第二凝集素柱B与馏分收集器相连，切换馏分收集器D，使收集流路位于二号样品瓶上方。打开恒流泵1，输送1M NaCl，洗脱第二凝集素柱B，洗脱下来的海参岩藻聚糖馏分被收集到二号样品瓶中，即得到纯化的海参岩藻聚糖馏分。

上述实施例1和2的纯化结果如下表2所示：

表2

由此可知，上述两种串联模式下，当能结合海参糖胺聚糖的凝集素亲和柱为A柱，能结合海参岩藻聚糖的凝集素亲和柱为B时，制备的岩藻聚糖以及海参糖胺聚糖的多糖含量都较高，产率也相对提升。

所属领域内的普通技术人员应该能够理解的是，本发明的特点或目的之一在于：本发明提出的串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置及其使用方法，快速高效，一次性能纯化两种多糖样品纯度高。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置，其特征是，包括：恒流泵、第一切换阀、第一凝集素柱、第二凝集素柱、第二切换阀和馏分收集器，

2.一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法，包括步骤：

3.如权利要求2所述的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法，其特征是：步骤(1)中所述第一凝集素柱为荆豆凝集素亲和柱、大豆凝集素亲和柱、麦胚凝集素亲和柱中的任意一种，所述第二凝集素柱为荆豆凝集素亲和柱、大豆凝集素亲和柱、麦胚凝集素亲和柱中的任意一种。

4.如权利要求2所述的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法，其特征是：步骤(2)中所述缓冲液体系中的缓冲液为纯水、TRIS-HCL缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸铵缓冲液中的任意一种。

5.如权利要求2所述的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法，其特征是：步骤(2)中所述海参粗多糖样品的浓度为10mg/mL，pH为5.0。

6.如权利要求2所述的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法，其特征是：步骤(2)中所述上样体积为第一凝集素柱体积的0.2～10倍。

7.如权利要求2所述的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法，其特征是：步骤(2)的重复次数为3-5次。

8.如权利要求2所述的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法，其特征是：在步骤(3)中，所述NaCl洗脱的洗脱步骤为：在0-10min时间段，0M NaCl升至1M NaCl，在10-30min时间段，维持1M NaCl；在步骤(4)中，所述NaCl洗脱的洗脱步骤为：在0-15min时间段，0M NaCl升至1.5M NaCl，在15-45min时间段，维持1.5M NaCl_。。

9.如权利要求2所述的一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置的使用方法，其特征是：步骤(6)中冻干的温度为-48℃、时间为48h。