CN116003645A - 一种泡叶藻岩藻多糖及其制备和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多糖制备工艺技术领域，具体涉及一种泡叶藻岩藻多糖及其制备和纯化方法。本发明通过乙醇回流、氯化钙提取工艺辅以离心、蒸发、浓缩等手段，通过泡叶藻制备得到了泡叶藻岩藻多糖，制备方法简单，原料易得，成本低廉，并进一步验证了泡叶藻岩藻多糖中的甘露糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖占、半乳糖占单糖组分。
Description
技术领域
本发明属于多糖制备工艺技术领域，具体涉及一种泡叶藻岩藻多糖及其制备和纯化方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
褐藻多糖主要有海藻酸、岩藻多糖、褐藻淀粉三种，褐藻淀粉可以在体内降解成单糖组分，海藻酸和岩藻多糖不被人体吸收利用，可较多的应用于功能食品等领域。岩藻多糖是一类主要由岩藻糖及硫酸酯基团组成的多糖类物质，广泛存在于褐藻及一些海洋无脊椎动物(如海参、海胆等)内，具有多种生理活性，如抗凝血与抗血栓、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗炎、降血脂、抗氧化、抗补体特性、胃保护作用等。近年来，以药品及保健食品开发为目的的岩藻多糖研究越来越多，因此对岩藻多糖的制备提出了新的挑战。
现有技术中生产岩藻多糖的原料主要是海带、昆布、裙带菜等褐藻，但是上述褐藻不仅要提供越来越多的日常食用需求，还需要大量进入藻酸盐生产工业中。泡叶藻是一种主要生长于大西洋冷水海域的褐藻。目前广泛应用于化妆品、饲料等生产。虽然泡叶藻中的岩藻糖含量比较高，但目前将其作为岩藻多糖提取的原料却使用较少，被人们所忽略，造成生物资源的浪费。此外，岩藻多糖的含量、结构、组成复杂，在工业化提取岩藻多糖的过程中，会得到多种分级成分，同时也加大了提取纯化的难度。因此，开发利用泡叶藻制备岩藻多糖具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种泡叶藻岩藻多糖及其制备和纯化方法。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了一种泡叶藻岩藻多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、将泡叶藻粉末利用回流装置进行脱脂脱色素处理，离心，烘干沉淀，得到脱脂后的泡叶藻粉末；
S2、将脱脂后的泡叶藻粉末溶解于水中，加入氯化钙水溶液搅拌提取，离心取上清液，浓缩，透析，使用乙醇沉淀，去除杂质得到粗泡叶藻岩藻多糖。
第二方面，本发明提供了一种泡叶藻岩藻多糖，通过上述泡叶藻岩藻多糖的制备方法获得，所述岩藻多糖的单糖组分包括甘露糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖中的一种或多种。
第三方面，本发明提供了一种泡叶藻岩藻多糖的提纯方法，其特征在于,包括以下步骤:
S1、采用阴离子交换柱分离粗泡叶藻岩藻多糖，线性梯度洗脱，洗脱液浓缩后经透析袋透析，冻干得电荷密度均匀泡叶藻岩藻多糖；
S2、采用凝胶柱纯化电荷密度均匀泡叶藻岩藻多糖，洗脱，经自动收集齐器收集洗脱液，硫酸苯酚法检测糖含量，并绘制洗脱曲线，收集曲线峰尖部分，浓缩、除氨、冻干得分子量均一的泡叶藻岩藻多糖。
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
本发明通过乙醇回流、氯化钙提取工艺辅以离心、蒸发、浓缩等手段，通过泡叶藻制备得到了泡叶藻岩藻多糖，制备方法简单，原料易得，成本低廉，并进一步验证了泡叶藻岩藻多糖中的甘露糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖占、半乳糖占单糖组分。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中单糖标准品混合物的组分表征图；
图2为实施例1中泡叶藻岩藻多糖的组分表征图。
具体实施方式
本发明的第一种典型实施方式，一种泡叶藻岩藻多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、将泡叶藻粉末利用回流装置进行脱脂脱色素处理，离心，烘干沉淀，得到脱脂后的泡叶藻粉末；
S2、将脱脂后的泡叶藻粉末溶解于水中，加入氯化钙水溶液搅拌提取，离心取上清液，浓缩，透析，使用乙醇沉淀，去除杂质得到粗泡叶藻岩藻多糖。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤S1中使用95％乙醇回流，泡叶藻粉末与95％乙醇的质量体积比为1g:15-25mL，回流温度为75-85℃，回流时间为12-24h。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤S1中烘干温度为40-50℃。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤S2中脱脂后的泡叶藻粉末以1g：20-40mL的质量体积比溶解于水中。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤S2中氯化钙水溶液的浓度为0.1M，泡叶藻粉末与氯化钙水溶液的质量体积比为1g:25-35mL，搅拌提取时间为12-24h，搅拌提取温度为60-70℃。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤S2中乙醇沉淀使用95％乙醇，沉淀与95％乙醇的体积质量比为1g:3-5mL；
步骤S2所述去除杂质包括加入氯化钙溶液除掉泡叶藻中的褐藻酸和分级沉淀除去部分海带淀粉。
本发明的第二种典型实施方式，一种泡叶藻岩藻多糖，通过上述泡叶藻岩藻多糖的制备方法获得，所述岩藻多糖的单糖组分包括甘露糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖中的一种或多种。
本发明的第三种典型实施方式，一种泡叶藻岩藻多糖的提纯方法，包括以下步骤:
S1、采用阴离子交换柱分离粗泡叶藻岩藻多糖，线性梯度洗脱，洗脱液浓缩后经透析袋透析，冻干得电荷密度均匀泡叶藻岩藻多糖；
S2、采用凝胶柱纯化电荷密度均匀泡叶藻岩藻多糖，洗脱，经自动收集齐器收集洗脱液，硫酸苯酚法检测糖含量，并绘制洗脱曲线，收集曲线峰尖部分，浓缩、除氨、冻干得分子量均一的泡叶藻岩藻多糖。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤S1中线性梯度洗脱的洗脱液为0-4.0MNaCl溶液；透析具体为经14kDa和3.5kDa透析袋透析。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤S4中洗脱液为0.2M(mol/L)NH4HCO3溶液，洗脱流速为0.3mL/min。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
利用回流装置对泡叶藻粉末在80℃条件下进行脱脂脱色素处理12h，藻粉与95％乙醇的比例是1:20(W/V(g/mL))，离心弃上清，将沉淀部分在45℃条件下烘干。脱脂后的泡叶藻粉末经30倍体积(V/W)水溶解,采用0.1M氯化钙水溶液于65℃搅拌提取12h。离心取上清液，经旋转蒸发仪浓缩至一定体积，利用3500Da透析袋进行透析除盐，监测电导率不再发生变化后，根据多糖溶于水而不溶于乙醇的特性，采用4倍体积95％乙醇对泡叶藻多糖进行沉淀。加入适量氯化钙除掉泡叶藻中的褐藻酸，分级沉淀除去部分海带淀粉，获得泡叶藻岩藻多糖。
收率及组分的确定方法如下：
单糖组成分析采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色谱法，此法反应条件温和，反应产物无异构体，且检测灵敏度高，因此得到了广泛的应用，主要分为三步进行，多糖完全酸水解，PMP柱前衍生，高效液相色谱分析。
a.准确称取多糖样品2mg，加入400～600μL 2mol/L TFA溶液于安瓿瓶内，在105℃密封条件下降解6h。降解完成后，反复加甲醇除去多余三氟乙酸，将降解产物在干燥环境下保存。
b.单糖标准品：古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖分别配置为10mg/mL。
c.多糖降解产物及等单糖标准品用100μL蒸馏水充分溶解，再加入100μL的0.3mol/L NaOH以及120μL的0.5mol/L的PMP甲醇溶液，于70℃水浴反应60min。反应结束冷却至室温，加入100μL0.3mol/L HCl溶液进行中和反应，用二氯甲烷萃取三次，将未反应的PMP除去，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤备用。
d.高效液相色谱条件：色谱柱为Eclipse XDB-C18(5μm，4.6μm×25.0cm)；流动相为乙腈：磷酸盐缓冲液(pH 6.7)＝17：83(v/v体积比)；进样体积：10μL；柱温：35℃；检测器：紫外检测器(254nm)；流速：1.0mL/min。
测定得到泡叶藻岩藻多糖的收率为1.86g/L。配置单糖标准品混合物，单糖标准品为古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖。对单糖标准品混合物进行液相色谱分析，如图1所示，保留时间12-57min处，从左到右依次是古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖。利用液相色谱法对泡叶藻岩藻多糖进行分析，如图2所示，岩藻糖的含量是51.66％，其中甘露糖醛酸占16.64％，甘露糖占8.65％，鼠李糖6.58％，葡萄糖醛酸占4.40％，葡萄糖占6.04％，半乳糖占6.03％。
实施例2
利用回流装置对泡叶藻粉末在80℃条件下进行脱脂脱色素处理18h，藻粉与95％乙醇的比例是1:25(W/V(g/mL))，离心弃上清，将沉淀部分在45℃条件下烘干。脱脂后的泡叶藻粉末经25倍体积(V/W)水溶解,采用0.1M氯化钙水溶液于65℃搅拌提取12h。离心取上清液，经旋转蒸发仪浓缩至一定体积，利用3500Da透析袋进行透析除盐，监测电导率不再发生变化后，根据多糖溶于水而不溶于乙醇的特性，采用4倍体积95％乙醇对泡叶藻多糖进行沉淀。加入适量氯化钙除掉泡叶藻中的褐藻酸，分级沉淀除去部分海带淀粉，获得泡叶藻岩藻多糖。
实施例3
利用回流装置对泡叶藻粉末在85℃条件下进行脱脂脱色素处理12h，藻粉与95％乙醇的比例是1:18(W/V(g/mL))，离心弃上清，将沉淀部分在45℃条件下烘干。脱脂后的泡叶藻粉末经30倍体积(V/W)水溶解,采用0.1M氯化钙水溶液于60℃搅拌提取18h。离心取上清液，经旋转蒸发仪浓缩至一定体积，利用3500Da透析袋进行透析除盐，监测电导率不再发生变化后，根据多糖溶于水而不溶于乙醇的特性，采用4倍体积95％乙醇对泡叶藻多糖进行沉淀。加入适量氯化钙除掉泡叶藻中的褐藻酸，分级沉淀除去部分海带淀粉，获得泡叶藻岩藻多糖。
实施例4
采用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离泡叶藻岩藻多糖，以0-4.0M NaCl为线性梯度洗脱液。洗脱液浓缩后经14kDa和3.5kDa透析袋透析，冻干得电荷密度均匀泡叶藻岩藻多糖。将电荷密度均一的多糖用Sephacryl S-400/300凝胶柱进一步纯化，以0.2M(mol/L)NH4HCO3为洗脱液，流速为0.3mL/min经自动收集齐器收集洗脱液，硫酸苯酚法检测糖含量，并绘制洗脱曲线，收集曲线峰尖部分，浓缩、除氨、冻干得分子量均一泡叶藻岩藻多糖，分子量不均一的组分需进行二次纯化。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种泡叶藻岩藻多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将泡叶藻粉末利用回流装置进行脱脂脱色素处理，离心，烘干沉淀，得到脱脂后的泡叶藻粉末；
S2、将脱脂后的泡叶藻粉末溶解于水中，加入氯化钙水溶液搅拌提取，离心取上清液，浓缩，透析，使用乙醇沉淀，去除杂质得到粗泡叶藻岩藻多糖。
2.如权利要求1所述的泡叶藻岩藻多糖的制备方法，其特征在于，步骤S1中使用95％乙醇回流，泡叶藻粉末与95％乙醇的质量体积比为1g:15-25mL，回流温度为75-85℃，回流时间为12-24h。
3.如权利要求1所述的泡叶藻岩藻多糖的制备方法，其特征在于，步骤S1中烘干温度为40-50℃。
4.如权利要求1所述的泡叶藻岩藻多糖的制备方法，其特征在于，步骤S2中脱脂后的泡叶藻粉末以1g:20-40mL的质量体积比溶解于水中。
5.如权利要求1所述的泡叶藻岩藻多糖的制备方法，其特征在于，步骤S2中氯化钙水溶液的浓度为0.1M，泡叶藻粉末与氯化钙水溶液的质量体积比为1g:25-35mL，搅拌提取时间为12-24h，搅拌提取温度为60-70℃。
6.如权利要求1所述的泡叶藻岩藻多糖的制备方法，其特征在于，步骤S2中乙醇沉淀使用95％乙醇，沉淀与95％乙醇的体积质量比为1g:3-5mL；
步骤S2所述去除杂质包括加入氯化钙溶液除掉泡叶藻中的褐藻酸和分级沉淀除去部分海带淀粉。
7.一种泡叶藻岩藻多糖，其特征在于，通过权利要求1-6所述的泡叶藻岩藻多糖的制备方法获得，所述岩藻多糖的单糖组分包括甘露糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖中的一种或多种。
8.一种泡叶藻岩藻多糖的提纯方法，其特征在于,包括以下步骤:
S1、采用阴离子交换柱分离粗泡叶藻岩藻多糖，线性梯度洗脱，洗脱液浓缩后经透析袋透析，冻干得电荷密度均匀泡叶藻岩藻多糖；
S2、采用凝胶柱纯化电荷密度均匀泡叶藻岩藻多糖，洗脱，经自动收集齐器收集洗脱液，硫酸苯酚法检测糖含量，并绘制洗脱曲线，收集曲线峰尖部分，浓缩、除氨、冻干得分子量均一的泡叶藻岩藻多糖。
9.如权利要求8所述的泡叶藻岩藻多糖的提纯方法，其特征在于，步骤S1中线性梯度洗脱的洗脱液为0-4.0M NaCl溶液；透析具体为经14kDa和3.5kDa透析袋透析。
10.如权利要求9所述的泡叶藻岩藻多糖的提纯方法，其特征在于，步骤S2中洗脱液为0.2M(mol/L)NH4HCO3溶液，洗脱流速为0.3mL/min。
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