CN115028750A - 泡叶藻岩藻多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学医药技术领域，具体涉及泡叶藻岩藻多糖及其制备方法和应用。本发明提供一种泡叶藻岩藻多糖，其主链结构包括：→2)‑α‑L‑Fuc‑(1→、→3)‑α‑L‑Fuc‑(1→、→6)‑β‑D‑Gal‑(1→和→3,6)‑β‑D‑Gal‑(1→。该多糖是以泡叶藻为原料，通过酶解、季铵盐沉淀和色谱分离等过程制备得到，其含有硫酸基，由多种单糖残基构成。该岩藻多糖能够抑制炎症因子、一氧化氮合酶、环氧化物酶2和Toll样受体的表达，同时能提高抗炎因子的表达量。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学医药技术领域，具体涉及泡叶藻岩藻多糖及其制备方法和应用。
背景技术
岩藻多糖是一类主要由岩藻糖构成的水溶性海洋活性多糖。目前研究发现其具有多种生物学功能，广泛地应用于医药领域和现代食品工业。泡叶藻是一种主要生长于大西洋冷水海域的褐藻。目前广泛应用于化妆品、饲料等生产。但是目前泡叶藻岩藻多糖被人们所忽略，造成生物资源的浪费。因此，开发利用泡叶藻岩藻多糖具有重要意义。
已有研究报道泡叶藻中具有活性多糖成分。文献“泡叶藻岩藻聚糖通过降脂延缓载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块形成的分子机制(杨晓倩，哈尔滨商业大学，2021)”中报道了从泡叶藻中提取分离精制得到一种硫酸多糖，通过结构分析最终确定这种结构的硫酸多糖为岩藻多糖，其对高脂饮食的apoE(-/-)小鼠具有良好的降脂和抗动脉粥样硬化效果。另外，文献“泡叶藻多糖的提取及其抗氧化活性研究(虞娟，林航，高炎，陈立根.广东化工，2016,43(14):18-20.)”报道了从泡叶藻中提取分离得到岩藻多糖，发现其具有抗氧化活性。但现有报道的不同来源褐藻的岩藻多糖结构存在重大差异，抗炎活性与其结构关系并不明确。
而炎症性肠病是一种常见不明原因的慢性肠道炎症性疾病，其发病率逐年升高并呈现出年轻化态势，已成为我国常见的消化系统疾病。目前临床用于治疗急性炎症抗炎类药物(类固醇或非类固醇)对炎症性肠病或相关疾病并不完全有效，且具有一定的副作用。
综上，有必要研究和开发对炎症改善效果好且副作用较低的生物活性物质。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种泡叶藻岩藻多糖，以泡叶藻为原料，通过酶解、季铵盐沉淀和色谱分离等过程制备得到一种岩藻多糖成分，其含有硫酸基，由多种单糖残基构成，该岩藻多糖具有抑制炎症因子、一氧化氮合酶、环氧化物酶2和Toll样受体的表达，提高抗炎因子的表达量。且本发明还提供该泡叶藻岩藻多糖的制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供泡叶藻岩藻多糖，其主链结构包括：→2)-α-L-Fuc-(1→、→3)-α-L-Fuc-(1→、→6)-β-D-Gal-(1→和→3,6)-β-D-Gal-(1→。
进一步地，所述泡叶藻岩藻多糖主链中，-SO4存在于→2)-α-L-Fuc-(1→的C-4位，→3)-α-L-Fuc-(1→的C-2和C-4位，→3,6)-β-D-Gal-(1→的C-4位。
优选地，所述多糖主链的→3,6)-β-D-Gal-(1→的C-6位和C-3分别被→2)-α-L-Fuc-(1→和→3)-β-D-Gal-(1→取代。
更优选地，所述多糖的硫酸基含量为30-50％，糖醛酸含量为1-10％。
更优选地，所述多糖的分子量为30-200kDa。进一步优选为60-130kDa。
更优选地，所述多糖的糖残基结构至少包括→2)-α-L-Fuc-(1→、→3)-α-L-Fuc-(1→、→6)-β-D-Gal-(1→、→3,6)-β-D-Gal-(1→、→3)-β-D-Gal-(1→、α-L-Fuc-(1→和β-D-Gal-(1→中的5种以上。
或更优选地，所述多糖的单糖组成包括岩藻糖(Fuc)和半乳糖(Gal)。
其中，所述单糖组成的摩尔比为岩藻糖：半乳糖＝(4.0-5.0)：1.0。
本发明第二方面提供了上述泡叶藻岩藻多糖的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：
(1)将泡叶藻去杂、风干后，于缓冲溶液中加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，加热酶解后，冷却、离心，取上清液A；
(2)向上清液A中加入无水氯化钙，然后离心，取上清液B；
(3)向上清液B中加入十六烷基三甲基溴化铵，然后离心，取沉淀；
(4)向步骤(3)中的沉淀中加入氯化钙溶液，然后离心，取上清液C；
(5)向上清液C中加入无水乙醇，离心后取沉淀，透析，冻干得泡叶藻岩藻多糖粗糖；
(6)将步骤(5)得到的粗糖分离纯化，即得泡叶藻岩藻多糖；所述分离纯化采用DEAE-52阴离子交换柱进行。
其中，上述提取方法步骤(1)中，泡叶藻包括叶和茎中至少一种。
其中，上述提取方法步骤(1)中，所述去杂过程包括：按1：4体积比将泡叶藻干粉于无水乙醇混合溶液中搅拌4小时，重复三次，静置过夜，除去脂溶性物质，将上层有机试剂去除并风干。
其中，上述提取方法步骤(1)中，去杂、风干后的泡叶藻样品质量与缓冲溶液的体积为1：30(g/mL)。
其中，上述提取方法步骤(1)中，所述缓冲溶液为pH＝5的柠檬酸-K2HPO4缓冲溶液。
其中，上述提取方法步骤(1)中，纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶加入量分别为风干后的泡叶藻样品质量的0.2-1.0％(m/m)、0.05-0.5％(m/m)、0.05-0.5％(m/m)。优选地，所述纤维素酶的酶活≥3000U/mg，果胶酶的酶活≥5000U/mg，木瓜蛋白酶的酶活≥1000U/mg。
其中，上述提取方法步骤(1)中，酶解温度为50℃，时间为4h。优选地，酶解后100℃水浴10min制得混合溶液。
其中，上述提取方法步骤(1)中，离心转速为4000r/min，时间为10min，温度为4℃。
其中，上述提取方法步骤(2)中，无水氯化钙的加入量相对于风干后的泡叶藻样品质量的5-10％。
其中，上述提取方法步骤(2)中，离心转速8000r/min，时间15min，温度4℃。
其中，上述提取方法步骤(3)中，十六烷基三甲基溴化铵加入量相对于风干后的泡叶藻样品质量的2-10％。
其中，上述提取方法步骤(3)中，离心转速为6000-10000r/min，时间10-30min。
其中，上述提取方法步骤(4)中，氯化钙溶液浓度为3mol/L，沉淀质量与氯化钙溶液体积为：1：5-20(g/mL)。
其中，上述提取方法步骤(4)中，离心转速8000-10000r/min，时间10-30min。
其中，上述提取方法步骤(5)中，向每mL上清液C中加入1.5-3mL无水乙醇，4℃放置24小时，在4℃条件下离心7-20min，转速8000-12000r/min脱除取沉淀。
其中，上述提取方法步骤(5)中，每g沉淀分别用2-5mL 80％和95％乙醇洗1-4次后，用水溶解。
其中，上述提取方法步骤(5)中，使用1000-10000Da透析袋蒸馏水透析24小时以上；然后冻干得到泡叶藻岩藻多糖粗糖。
其中，上述提取方法步骤(6)中，用0.1-2M NaCl作为洗脱液，洗脱1-4个柱体积，收集得到泡叶藻岩藻多糖。
本发明第三方面提供了上述泡叶藻岩藻多糖在制备抗炎药物中的应用。
优选地，所述抗炎药物抑制炎症因子、一氧化氮合酶、环氧化物酶2和Toll样受体的表达。
优选地，所述抗炎药物为治疗消化系统炎症的药物。更优选地，所述消化系统炎症包括结肠炎、直肠炎和阑尾炎。
本发明第四方面提供了一种药物组合物，其是以所述泡叶藻岩藻多糖为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
所述的制剂是口服制剂、注射剂、气雾剂或黏膜给药制剂。
有益效果：
本发明从泡叶藻中提取分离纯化得到一种泡叶藻岩藻多糖，该多糖结构目前并没有相关的文献报道。且该多糖能够抑制一氧化氮合成酶、环氧化物酶2、Toll样受体2和4、促炎因子的mRNA的表达和提高抗炎因子mRNA的表达量。相比于其他多糖，同等剂量下本发明的泡叶藻岩藻多糖抑制LPS诱导一氧化氮的生成量的抑制率更高。因此，本发明的泡叶藻岩藻多糖在抗炎药物新药研发和应用方面具有重大的前景和意义。
附图说明
图1为实施例1中ANP-1的单糖组成分析；
图2为实施例1中ANP-1的HSQC谱分析；
图3为实施例1中ANP-1的TCOSY谱分析；
图4为实施例1中ANP-1的NOESY谱分析；
图5为实施例1中ANP-1的结构示意图；
图6为实施例2中细胞活力分析；
图7为实施例2中一氧化氮含量分析；
图8为实施例2中一氧化氮合成酶mRNA表达量分析；
图9为实施例2中环氧化物酶2mRNA表达量分析；
图10为实施例2中TNF-αmRNA表达量分析；
图11为实施例2中IL-1βmRNA表达量分析；
图12为实施例2中IL-6mRNA表达量分析；
图13为实施例2中IL-10mRNA表达量分析；
图14为实施例2中TLR-2mRNA表达量分析；
图15为实施例2中TLR-4mRNA表达量分析；
图16为实施例3中ANP-2的单糖组成分析；
图17为实施例3中ANP-2的HSQC谱分析；
图18为实施例3中ANP-2的TCOSY谱分析；
图19为实施例3中ANP-2的NOESY谱分析；
图20为实施例3中ANP-2的结构示意图；
图21为实施例4中细胞活力分析；
图22为实施例4中一氧化氮含量分析；
图23为实施例4中一氧化氮合成酶mRNA表达量分析；
图24为实施例4中环氧化物酶2mRNA表达量分析；
图25为实施例4中TNF-αmRNA表达量分析；
图26为实施例4中IL-1βmRNA表达量分析；
图27为实施例4中IL-6mRNA表达量分析；
图28为实施例4中IL-10mRNA表达量分析；
图29为实施例4中TLR-2mRNA表达量分析；
图30为实施例4中TLR-4mRNA表达量分析。
具体实施方式
本发明以泡叶藻为原料，通过酶解、季铵盐沉淀和色谱分离等过程制备得到一种岩藻多糖成分，其含有硫酸基，由多种单糖残基构成，主链结构为→2)-α-L-Fuc-(1→、→3)-α-L-Fuc-(1→、→6)-β-D-Gal-(1→和→3,6)-β-D-Gal-(1→。这种岩藻多糖具有抑制炎症因子、一氧化氮合酶、环氧化物酶2和Toll样受体的表达，提高抗炎因子的表达量。
本发明的泡叶藻岩藻多糖主链由→2)-α-L-Fuc-(1→、→3)-α-L-Fuc-(1→、→6)-β-D-Gal-(1→和→3,6)-β-D-Gal-(1→构成，-SO4存在于的→2)-α-L-Fuc-(1→的C-4位，→3)-α-L-Fuc-(1→的C-2和C-4位和→3,6)-β-D-Gal-(1→的C-4位。
优选地，所述多糖主链的→3,6)-β-D-Gal-(1→的C-6位和C-3分别被→2)-α-L-Fuc-(1→或→3)-β-D-Gal-(1→取代。
更优选地，所述多糖的硫酸基含量为30-50％，糖醛酸含量为1-10％。
更优选地，所述多糖的分子量为30-200kDa，优选为60-130kDa。
更优选地，所述多糖的糖残基结构至少包括→2)-α-L-Fuc-(1→、→3)-α-L-Fuc-(1→、→6)-β-D-Gal-(1→、→3,6)-β-D-Gal-(1→、→3)-β-D-Gal-(1→、α-L-Fuc-(1→和β-D-Gal-(1→中的5种以上。
或更优选地，所述多糖的单糖组成包括岩藻糖(Fuc)和半乳糖(Gal)。单糖组成的摩尔比具体为岩藻糖:半乳糖＝(4.0-5.0)：1.0。
本发明还提供了前述多糖的提取方法，其中，所述提取方法包括：
(1)将泡叶藻干粉于无水乙醇1：4体积比混合溶液中搅拌4小时，重复三次，静置过夜，除去脂溶性物质，将上层有机试剂去除并风干；泡叶藻岩藻多糖包括叶和茎中的一种或两种。
向风干的样品中加入pH＝5的柠檬酸-K2HPO4缓冲溶液，风干的泡叶藻样品质量与缓冲溶液的体积为1：30(g/mL)，再加入相对于风干样品质量0.2-1.0％(m/m)的纤维素酶干粉、0.05-0.5％(m/m)的果胶酶干粉和0.05-0.5％(m/m)的木瓜蛋白酶干粉。所述纤维素酶干粉的酶活≥3000U/mg，果胶酶干粉的酶活≥5000U/mg，木瓜蛋白酶干粉的酶活≥1000U/mg，50℃水浴震荡酶解4h，然后100℃水浴10min制得混合溶液。
所述混合溶液冷却到室温，离心，转速4000r/min，时间10min，温度4℃，取上清液A；
(2)向上清液A中，加入相对于风干样品质量5-10％的无水氯化钙，充分搅拌均匀，室温下放置24h后，离心，转速8000r/min，时间15min，温度4℃，取上清液B。
(3)向上清液B中加入相对于风干样品质量2-10％十六烷基三甲基溴化铵，室温放置24小时，离心，转速6000-10000r/min，时间10-30min，取沉淀。
(4)每g沉淀用5-20mL 3mol/L氯化钙溶液，室温放置24小时，离心，转速8000-10000r/min，时间10-30min，取上清液C。
(5)向每mL上清液C中加入1.5-3mL无水乙醇，4℃放置24小时，在4℃条件下离心7-20min，转速8000-12000r/min脱除，取沉淀；每g沉淀用2-5mL 80％和95％乙醇洗1-4次后，用水溶解，使用1000-10000Da透析袋蒸馏水透析24小时以上；然后冻干得到泡叶藻岩藻多糖粗糖。
(6)将粗糖采用DEAE-52阴离子交换柱进行分离纯化，用0.1-2M NaCl作为洗脱液，洗脱1-4个柱体积，收集得到泡叶藻岩藻多糖。
本发明上述提取方法中，以下步骤为本发明提取方法中的关键步骤：
1、步骤(1)中，缓冲溶液为pH＝5的柠檬酸-K2HPO4缓冲溶液，目的在于pH稳定性好，同时性价比高。
2、由于纤维素酶和果胶酶用于破坏泡叶藻组织细胞壁，有助于岩藻多糖的提取，木瓜蛋白酶用于酶解组织中存在的蛋白，因此，本发明选用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶用于岩藻多糖的酶解。
而将纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶加入量分别限定为风干后的泡叶藻样品质量的0.2-1.0％(m/m)、0.05-0.5％(m/m)、0.05-0.5％(m/m)。同时限定所述纤维素酶的酶活≥3000U/mg，果胶酶的酶活≥5000U/mg，木瓜蛋白酶的酶活≥1000U/mg的好处在于：申请人经过大量研究和筛选实验发现，这样可以保证提取出来的岩藻多糖的结构特性。若是三者酶的加入量和酶活不在上述范围内，可能会造成岩藻多糖提取不完全；同时泡叶藻岩藻多糖提取结构也会存在差异，无法保证其多糖结构为本发明保护的结构，而且其抗炎功效也会被降低。
3、本发明将酶解温度限定为50℃，时间为4h。优选地，酶解后100℃水浴10min制得混合溶液。目的在于依据上述酶活限定的温度和时间。升高沸水浴10分钟是灭酶处理，保证提取的岩藻多糖结构特性。
4、本发明步骤(3)中，十六烷基三甲基溴化铵加入量相对于泡叶藻干粉质量2-10％。是由于加入十六烷基三甲基溴化铵的目的是分离提取的岩藻多糖，避免中性糖的干扰，保证纯度。限定其加入量目的在于：充分保证泡叶藻岩藻多糖的络合成功率。过少会导致泡叶藻岩藻多糖提取不完全。过多会造成：1.资源浪费2.干扰岩藻多糖的纯度3.增加后续无水氯化钙的使用量。
5、将冻干得到泡叶藻岩藻多糖粗糖样品采用DEAE-52阴离子交换柱进行分离纯化，用0.1-2M NaCl作为洗脱液，洗脱1-4个柱体积，收集得到泡叶藻岩藻多糖。本发明采用DEAE柱分离是由于其依据不同离子强度的氯化钠与吸附在DEAE柱上的泡叶藻岩藻多糖进行交换，从而能够分离电荷不同的泡叶藻岩藻多糖。
本发明还提供了上述泡叶藻岩藻多糖在制备抗炎药物中的应用。
优选地，所述抗炎药物抑制炎症因子、一氧化氮合酶、环氧化物酶2和Toll样受体的表达。
优选地，所述抗炎药物为治疗消化系统炎症的药物。更优选地，所述消化系统炎症包括结肠炎、直肠炎和阑尾炎等。
本发明还提供了一种药物组合物，其是以所述泡叶藻岩藻多糖为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
所述的制剂是口服制剂、注射剂、气雾剂或黏膜给药制剂。
本发明所述的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。本发明所述的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。
本发明通过检测抑制LPS诱导巨噬细胞一氧化氮的产生的作用、一氧化氮合成酶(iNOS)、环氧化物酶2(COX-2)、Toll样受体2和4、促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6和抗炎因子IL-10mRNA表达量评估了本发明泡叶藻岩藻多糖的抗炎效果。
浓度小于100μg/mL的泡叶藻岩藻多糖对巨噬细胞无显著抑制生长的作用，而泡叶藻岩藻多糖会对脂多糖LPS诱导巨噬细胞一氧化氮的生成量具有明显的抑制作用，且抑制率与剂量正相关。
泡叶藻岩藻多糖，在浓度为100μg/mL时可以抑制一氧化氮合成酶的mRNA的表达量，其抑制率为50-70％。在浓度为100μg/mL时可以抑制环氧化物酶-2的mRNA的表达量，其抑制率为47-75％。在浓度为100μg/mL泡叶藻岩藻多糖对促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达量，其抑制率大于50％，说明泡叶藻岩藻多糖抑制炎症相关酶促炎因子的mRNA的表达。在浓度为100μg/mL时，泡叶藻岩藻多糖显著提升有抗炎因子IL-10mRNA的表达量。以上结果说明泡叶藻岩藻多糖抗炎的机制是抑制一氧化氮合成酶、环氧化物酶2、Toll样受体2和4和促炎因子的mRNA的表达和提高抗炎因子mRNA的表达量。
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
将泡叶藻干粉于无水乙醇1：4体积比混合溶液中搅拌4小时，重复三次，静置过夜，除去脂溶性物质，将去除上层有机试剂并风干。向每1000g风干的样品中加入30L浓度为pH＝5的柠檬酸-K2HPO4缓冲溶液，再加入相对于样品质量0.5％(m/m)的纤维素酶干粉、0.1％(m/m)的果胶酶干粉和0.1％(m/m)的木瓜蛋白酶干粉，所述纤维素酶干粉的酶活为5000U/mg，果胶酶干粉的酶活为10000U/mg，木瓜蛋白酶干粉的酶活为2000U/mg，50℃水浴震荡酶解4h，然后100℃水浴10min制得混合溶液。混合溶液冷却到室温，离心，转速4000r/min,时间10min，温度4℃，取上清液。
向上清液中，加入相对于样品质量8％的无水氯化钙，充分搅拌均匀，室温下放置24h后，离心，转速8000r/min，时间15min，温度4℃，取上清液。
向上清液中加入相对于样品质量5％十六烷基三甲基溴化铵，搅拌均匀，室温放置24小时，离心，转速8000r/min，时间10-30min，取沉淀。
每g沉淀用15mL 3mol/L无水氯化钙溶液，搅拌均匀，室温放置24小时，离心，转速8000r/min，时间10-30min，取上清液。向每mL上清液中加入1.5mL无水乙醇，4℃放置24小时，在4℃条件下离心15min，转速8000r/min取沉淀。每g沉淀用4mL80％和95％乙醇洗3次后，用去离子水溶解，使用3500Da透析袋蒸馏水透析24小时以上；然后冻干得到泡叶藻岩藻多糖粗糖。
称取0.2g粗糖溶于1mL去离子水中，吸附到用500mL的0.8M NaCl平衡过的DEAE-52纤维素柱。依次用0.8和1.0M NaCl溶液各洗脱四个柱体积，收集1.0M NaCl溶液洗脱部分，冻干后得到泡叶藻岩藻多糖ANP-1。
采用明胶比浊法测定ANP-1的硫酸基含量为39.5±2.5％；采用间羟基联苯法测定其糖醛酸含量为3.4±0.3％；采用TSK凝胶色谱法检测ANP-1分子量为63.2kDa。
采用液相色谱法分析了ANP-1的单糖组成，结果如图1所示，ANP-1的单糖组成为岩藻糖和半乳糖，其摩尔比为4.3：1.0。
通过甲基化-GC-MS分析脱硫产物(dS-ANP-1)的糖残基，结果如由表1所示。dS-ANP-1具有7种糖残基结构，其中主要的糖残基结构包括→2)-α-L-Fuc-(1→，→3)-α-L-Fuc-(1→，→6)-β-D-Gal-(1→，→3)-β-D-Gal-(1→和→3,6)-β-D-Gal-(1→等。
表1 dS-ANP-1甲基化结果分析
通过核磁共振光谱分析得知ANP-1中含有5种糖残基，结果如表2所示，分别为→2)-α-L-Fuc-(1→、→3)-α-L-Fuc-(1→、→6)-β-D-Gal-(1→、→3)-β-D-Gal-(1→和→3,6)-β-D-Gal-(1→，-SO4存在于→2)-α-L-Fuc-(1→的C-4位，→3)-α-L-Fuc-(1→的C-2和C-4位和→3,6)-β-D-Gal-(1→的C-4位。
表2 ANP-1NMR化学位移
进一步根据dS-ANP-1甲基化分析结果(表1)和核磁分析结果可以推断ANP-1的结构如图5所示。
实施例2
本实施例用于评估实施例1制备的泡叶藻岩藻多糖ANP-1的抗炎效果。
具体实验方法如下：
1.细胞活性测定(MTT)
在96孔细胞培养板中接种已经培养至对数生长期的RAW 264.7细胞，其中每孔的细胞密度为1.0×105cells/mL，在37℃、5％CO2条件下培养24h。然后，弃孔板中的培养基，分别加入不同浓度的ANP-1培养液，每组6个平行，以RPMI1640培养基作为空白对照。37℃和5％CO2条件下培养24h后，每孔中分别加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后去除培养板中上清，加入150μL DMSO，混匀后，在490nm下进行吸光值测定吸光度值。
2.一氧化氮(NO)测定
将RAW 264.7细胞接种到96孔细胞培养板中(1.0×105cells/mL)，37℃和5％CO2下培养24h。然后弃掉孔板中的培养基，分别加入不同浓度的ANP-1培养液，每组6个平行，以RPMI1640培养基作为空白对照。37℃和5％CO2条件下培养2h后，在ANP-1和模型组组中加入脂多糖(LPS)(1μg/mL)。培养22h后，收集细胞培养液上清，根据NO试剂盒说明书测定培养液上清中NO含量。
3.荧光实时定量PCR(RT-PCR)分析
(1)细胞培养
将RAW 264.7细胞接种到12孔细胞培养板中(5.0×105cells/mL)，在37℃和5％CO2条件下培养24h。然后培养液上清，分别加入不同浓度(0.05和0.1mg/mL)的ANP-1培养液，培养2h后加入LPS(1μg/mL)，以RPMI1640培养基作为空白对照，以加入LPS(1μg/mL)的RPMI1640培养基作为阳性对照，37℃和5％CO2条件下继续培养22h。
(2)实时荧光定量PCR
采用商用Trozal试剂进行细胞中RNA含量提取，采用商用的逆转录试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司，RR047A)进行反转录得到mRNA，然后采用商用的荧光实时定量PCR试剂盒进行检测，以此定量分析细胞中iNOS、COX-2、TLR-2、TLR-4、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10细胞因子的含量。其中iNOS、COX-2、TLR-2、TLR-4、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的基因序列如下表3所示。
表3实时荧光定量PCR的基因序列
通过检测抑制LPS诱导巨噬细胞一氧化氮生成量的作用、一氧化氮合成酶、环氧化物酶2、Toll样受体2和4、促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6和抗炎因子IL-10评估了ANP-1的抗炎效果。
如图6-7所示，浓度小于100μg/mL的ANP-1对巨噬细胞生产无显著的影响，但是会显著抑制LPS诱导的巨噬细胞一氧化氮的生成量，且抑制率与剂量正相关，浓度为100μg/mL时，其抑制率为72.11％(通过与LPS组对比计算得到该值)。
如图8-15所示，在浓度为100μg/mL时，ANP-1可以抑制一氧化氮合成酶的mRNA的表达量，其抑制率为67.69％(图8)。在浓度为100μg/mL时可以抑制环氧化物酶-2的mRNA的表达量，其抑制率为59.22％(图9)。在浓度为100μg/mL泡叶藻岩藻多糖对促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达量(图10-12)，其抑制率大于50％，说明ANP-1抑制炎症相关酶促炎因子的mRNA的表达。
在浓度为100μg/mL时，ANP-1显著提升有抗炎因子IL-10mRNA的表达量(图13)，同时ANP-1可以抑制TLR-2和TLR-4mRNA的表达量(图14和15)。以上结果也说明ANP-1抗炎的机制是抑制一氧化氮合成酶、环氧化物酶2、Toll样受体2和4和促炎因子mRNA的表达和提升抗炎因子mRNA的表达量。
实施例3
将泡叶藻干粉于无水乙醇1：4体积比混合溶液中搅拌4小时，重复三次，静置过夜，除去脂溶性物质，将上层有机试剂去除并风干。向每1000g风干的样品中加入30L浓度为pH＝5的柠檬酸-K2HPO4缓冲溶液，再加入相对于样品质量0.5％(m/m)的纤维素酶干粉、0.1％(m/m)的果胶酶干粉和0.1％(m/m)的木瓜蛋白酶干粉，所述纤维素酶干粉的酶活为5000U/mg，果胶酶干粉的酶活为10000U/mg，木瓜蛋白酶干粉的酶活为2000U/mg，50℃水浴震荡酶解4h，然后100℃水浴10min制得混合溶液。混合溶液冷却到室温，离心，转速4000r/min，时间10min，温度4℃，取上清液。
向上清液中，加入相对于风干样品质量8％的无水氯化钙，充分搅拌均匀，室温下放置24h后，离心，转速8000r/min，时间15min，温度4℃，取上清液。
向上清液中加入相对于样品质量5％十六烷基三甲基溴化铵，室温放置24小时，离心，转速8000r/min，时间10-30min，取沉淀。
每g沉淀用15mL 3mol/L氯化钙溶液，室温放置24小时，离心，转速8000r/min，时间10-30min，取上清液。
向每mL上清液中加入1.5mL无水乙醇，4℃放置24小时，在4℃条件下离心15min，转速8000r/min取沉淀。每g沉淀用4mL 80％和95％乙醇洗3次后，用去离子水水溶解，使用3500Da透析袋蒸馏水透析24小时以上；然后冻干得到泡叶藻岩藻多糖粗糖。
称取0.2g粗糖溶于1mL去离子水中，吸附到用500mL的1.0M NaCl平衡过的DEAE-52纤维素柱。依次用1.0和1.2M NaCl溶液各洗脱四个柱体积，收集1.2M NaCl溶液洗脱部分，透析冻干后得到泡叶藻岩藻多糖ANP-2。
采用明胶比浊法测定ANP-2的硫酸基含量为42.1±3.3％；采用间羟基联苯法测定其糖醛酸含量为2.70±0.3％；采用TSK凝胶色谱法检测ANP-2分子量为124.5kDa。
采用液相色谱法分析了ANP-2的单糖组成，结果如图16所示，ANP-2的单糖组成为岩藻糖和半乳糖，其摩尔比结果为4.2：1.0。
通过甲基化-GC-MS分析脱硫产物(dS-ANP-2)的糖残基，结果如表4所示。dS-ANP-2具有7种糖残基结构，其中主要的糖残基结构包括→2)-α-L-Fuc-(1→，→3)-α-L-Fuc-(1→，→6)-β-D-Gal-(1→，→3)-β-D-Gal-(1→和→3,6)-β-D-Gal-(1→等。
表4 dS-ANP-2甲基化分析
通过核磁共振光谱分析的以得知ANP-2中含有5种糖残基，结果如表5所示，分别为→2)-α-L-Fuc-(1→、→3)-α-L-Fuc-(1→、→6)-β-D-Gal-(1→、→3)-β-D-Gal-(1→和→3,6)-β-D-Gal-(1→，-SO4存在于→2)-α-L-Fuc-(1→的C-4位，→3)-α-L-Fuc-(1→的C-2和C-4位和→3,6)-β-D-Gal-(1→的C-4位。
表5 ANP-2NMR化学位移
进一步根据dS-ANP-2甲基化分析结果(表4)和核磁分析结果可以推断ANP-2的结构如图20所示。由于ANP-1和ANP-2是使用不同氯化钠强度洗脱下来的多糖，其带电荷并不相同，经过测定其硫酸基存在差异。
实施例4
本实施例用于评估实施例3制备的泡叶藻岩藻多糖ANP-2的抗炎效果。
具体实验方法如下：
1.细胞活性测定(MTT)
在96孔细胞培养板中接种已经培养至对数生长期的RAW 264.7细胞，其中每孔的细胞密度为1.0×105cells/mL，在37℃、5％CO2条件下培养24h。然后，弃孔板中的培养基，分别加入不同浓度(25、50、100、200、400和800μg/mL)的ANP-2培养液，每组6个平行，以RPMI1640培养基作为空白对照。37℃和5％CO2条件下培养24h后，每孔中分别加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后去掉培养板中上清，加入150μL DMSO，混匀后，在490nm下进行吸光值测定吸光度值。
2.一氧化氮(NO)测定
将RAW 264.7细胞接种到96孔细胞培养板中(1.0×105cells/mL)，在37℃和5％CO2条件下培养24h。然后弃掉孔板中的培养基，分别加入不同浓度的ANP-2培养液，每组6个平行，以RPMI1640培养基作为空白对照。37℃和5％CO2条件下培养2h后，在ANP-2组和模型组中加入脂多糖(LPS)(1μg/mL)，培养22h后，收集细胞培养液上清，根据一氧化氮试剂盒说明书测定培养液上清中NO含量。
3.荧光实时定量PCR(RT-PCR)分析
(1)细胞培养
将RAW 264.7细胞接种到12孔细胞培养板中(5.0×105cells/mL)，在37℃和5％CO2条件下培养24h。然后弃掉培养液上清，分别加入不同浓度(0.1和0.2mg/mL)的ANP-2培养液，培养2h后加入LPS(1μg/mL)，以RPMI1640培养基作为空白对照，以加入LPS(1μg/mL)的RPMI1640培养基作为阳性对照，37℃和5％CO2条件下继续培养22h。
(2)实时荧光定量PCR
采用商用Trozal试剂进行细胞中RNA含量提取，采用商用的逆转录试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司，RR047A)进行反转录得到mRNA，然后采用商用的荧光实时定量PCR试剂盒进行检测，以此定量分析细胞中iNOS、COX-2、TLR-2、TLR-4、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10细胞因子的含量。其中iNOS、COX-2、TLR-2、TLR-4、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的基因序列如下表所示。
表6荧光实时定量PCR分析的基因序列
通过检测抑制LPS诱导巨噬细胞一氧化氮生成量的作用、一氧化氮合成酶、环氧化物酶2、Toll样受体2和4、促炎因子TNF-α、IL-1β、和IL-6和抗炎因子IL-10评估了ANP-2的抗炎效果。
如图21-22所示，浓度小于200μg/mL的ANP-2对巨噬细胞生长无影响，但是会显著抑制LPS诱导的巨噬细胞一氧化氮生成量，且抑制率与剂量正相关，浓度为200μg/mL时，其抑制率为73.64％。
如图23-30所示，在浓度为200μg/mL时，ANP-2可以抑制一氧化氮合成酶的mRNA的表达量，其抑制率为62.61％(图23)。在浓度为200μg/mL时可以抑制环氧化物酶-2的mRNA的表达量，其抑制率为72.3％(图24)。在浓度为200μg/mL泡叶藻岩藻多糖对促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达量，其抑制率大于50.0％(图25-27)，说明ANP-2抑制炎症相关酶促炎因子的mRNA的表达。在浓度为200μg/mL时，ANP-2显著提升有抗炎因子IL-10mRNA的表达量(图28)，同时ANP-1可以抑制TLR-2和TLR-4mRNA的表达量(图29和30)。以上结果说明ANP-2抗炎的机制是抑制一氧化氮合成酶、环氧化物酶2、Toll样受体2和4表达和提升抗炎因子mRNA的表达量。
尽管ANP-1和ANP-2都具有显著的抗炎的活性，但是在同等剂量下，其抗炎活性并不一致。在浓度为100μg/mL时，ANP-1抑制LPS诱导一氧化氮生成量的抑制率是72.1％，而ANP-2对其的抑制率为65.1％。ANP-1对LPS诱导一氧化氮合成酶和环氧化物酶的mRNA表达的抑制率分别是67.6％和59.2％，而ANP-2对其的抑制率分别为50.7％和46.9％。ANP-1对LPS诱导促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达的抑制率分别是51.5％、51.8％和74.1％，而ANP-2对其的抑制率分别为54.5％、45.56％和58.9％。ANP-1对LPS诱导TLR-4的mRNA表达抑制展现出类似的效果，ANP-1对其抑制率为79.7％，而ANP-2对其抑制率为19.1％。综上所述，在相同的剂量条件下，分子量较低的ANP-1显示出更加显著的抗炎效果。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。
序列表
<110> 泸州品创科技有限公司
大连工业大学
<120> 泡叶藻岩藻多糖及其制备方法和应用
<130> A220336K（序）
<141> 2022-06-09
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagctggaga actctgaccc 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> DNA
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacgcagctc agtaacagtc c 21
Claims (10)
1.泡叶藻岩藻多糖，其特征在于：其主链结构包括：→2)-α-L-Fuc-(1→、→3)-α-L-Fuc-(1→、→6)-β-D-Gal-(1→和→3,6)-β-D-Gal-(1→；其中，-SO4存在于→2)-α-L-Fuc-(1→的C-4位，→3)-α-L-Fuc-(1→的C-2和C-4位，→3,6)-β-D-Gal-(1→的C-4位。
2.根据权利要求1所述的泡叶藻岩藻多糖，其特征在于：所述多糖主链的→3,6)-β-D-Gal-(1→的C-6位和C-3分别被→2)-α-L-Fuc-(1→和→3)-β-D-Gal-(1→取代。
3.根据权利要求1或2所述的泡叶藻岩藻多糖，其特征在于：所述多糖的硫酸基含量为30-50％，糖醛酸含量为1-10％。
4.根据权利要求1或2所述的泡叶藻岩藻多糖，其特征在于：所述多糖的分子量为30-200kDa；优选为60-130kDa。
5.根据权利要求1或2所述的泡叶藻岩藻多糖，其特征在于：所述多糖的糖残基结构至少包括→2)-α-L-Fuc-(1→、→3)-α-L-Fuc-(1→、→6)-β-D-Gal-(1→、→3,6)-β-D-Gal-(1→、→3)-β-D-Gal-(1→、α-L-Fuc-(1→和β-D-Gal-(1→中的5种以上。
6.根据权利要求1或2所述的泡叶藻岩藻多糖，其特征在于：所述多糖的单糖组成包括岩藻糖(Fuc)和半乳糖(Gal)；优选地，所述单糖组成的摩尔比为岩藻糖：半乳糖＝(4.0-5.0)：1.0。
7.权利要求1-6任意一项泡叶藻岩藻多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将泡叶藻去杂、风干后，于缓冲溶液中加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，加热酶解后，冷却、离心，取上清液A；
(2)向上清液A中加入无水氯化钙，然后离心，取上清液B；
(3)向上清液B中加入十六烷基三甲基溴化铵，然后离心，取沉淀；
(4)向步骤(3)中的沉淀中加入氯化钙溶液，然后离心，取上清液C；
(5)向上清液C中加入无水乙醇，离心后取沉淀，透析，冻干得泡叶藻岩藻多糖粗糖；
(6)将步骤(5)得到的粗糖分离纯化，即得泡叶藻岩藻多糖；所述分离纯化为采用DEAE-52阴离子交换柱进行。
8.根据权利要求7所述的泡叶藻岩藻多糖的提取方法，其特征在于：所述提取方法满足以下至少一项：
步骤(1)中，所述缓冲溶液为pH＝5的柠檬酸-K2HPO4缓冲溶液；
步骤(1)中，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶加入量分别为风干后的泡叶藻样品质量的0.2-1.0％(m/m)、0.05-0.5％(m/m)、0.05-0.5％(m/m)；优选地，所述纤维素酶的酶活≥3000U/mg，果胶酶的酶活≥5000U/mg，木瓜蛋白酶的酶活≥1000U/mg；
步骤(1)中，酶解温度为50℃，时间为4h；优选地，酶解后100℃水浴10min制得混合溶液；
步骤(2)中，无水氯化钙的加入量相对于风干后的泡叶藻样品质量的5-10％；
步骤(3)中，十六烷基三甲基溴化铵加入量相对于风干后的泡叶藻样品质量的2-10％；
步骤(4)中，氯化钙溶液浓度为3mol/L，沉淀质量与氯化钙溶液体积为：1：5-20(g/mL)；
步骤(5)中，使用1000-10000Da透析袋蒸馏水透析24小时以上；
步骤(6)中，用0.1-2M NaCl作为洗脱液，洗脱1-4个柱体积。
9.权利要求1-6任意一项泡叶藻岩藻多糖在制备抗炎药物中的应用。
10.药物组合物，其特征在于：以权利要求1-6任意一项泡叶藻岩藻多糖为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115028750B (zh) | 2023-08-22 |
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