CN111195256A

CN111195256A - 硫酸化岩藻寡糖作为pcsk9抑制剂的应用

Info

Publication number: CN111195256A
Application number: CN201911337422.7A
Authority: CN
Inventors: 郭守东; 杨晓倩; 夏彬; 林萍
Original assignee: Weifang Medical University
Current assignee: Weifang Medical University
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-05-26

Abstract

本发明公开了硫酸化岩藻寡糖作为PCSK9抑制剂的应用。本发明首次发现硫酸化岩藻寡糖能显著抑制PCSK9蛋白的表达，为硫酸化岩藻寡糖在制备PCSK9抑制剂药物上的应用提供了详实的实施案例。在本发明的实施例中，不同来源的硫酸化岩藻寡糖可显著下调apoE(‑/‑)小鼠，C57BL/6小鼠和细胞中PCSK9蛋白表达水平；在制备方面，本发明的实施方法简单易于大规模生产，为该发明的转化奠定了基础。

Description

硫酸化岩藻寡糖作为PCSK9抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及一种化合物的医药用途技术领域，具体为一种硫酸化岩藻寡糖作为PSCK9抑制剂的应用。

背景技术

心血管疾病是一种高发病率、高致残率、高致死率的疾病。据2019年发表的2017年全球人类死亡的致病因素中，心血管疾病以31.8%的比例遥遥领先于癌症等其他疾病。2019年发布的我国心血管情况更加瞩目，心血管疾病占据了2016年疾病的40%。因此，心血管疾病是全球，特别是发展中国家人口比较重要的公共卫生问题。

高血脂是诱发动脉粥样硬化的主要原因之一。当体内胆固醇过高，特别是低密度脂蛋白水平（LDL-C）以及甘油三酯增高时，氧化的LDL或其他变性脂蛋白则可被巨噬细胞吞噬，进而沉积在动脉内皮下，引起内皮下脂质沉积，进而在动脉内膜形成脂斑，最后，血管壁隆起、向官腔内突起形成粥样斑块。

2003年至今的研究表明：前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)在调节胆固醇体内平衡中起重要作用；其可与低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，在细胞内外促进LDLR降解，致使血液中LDL不能被有效地清除，从而导致高胆固醇血症。目前，上市的PCSK9单克隆抗体抑制剂价格高昂，且“花费-受益”极其不对称，这让绝大多数患者无法承担。

发明内容

本发明解决以上问题，采用的技术手段为：硫酸化岩藻寡糖作为PSCK9抑制剂的应用。

所述硫酸化岩藻寡糖的结构式如下：

取代基W，X，Y和Z 可以是，H, SO₃ ^2-, 硫酸化的单糖，非硫酸化的单糖，硫酸化的糖醛酸，非硫酸化的糖醛酸。

所述硫酸化岩藻寡糖类化合物的分子量分别为：200-2000 Da。

所述硫酸化岩藻寡糖提取自褐藻或棘皮动物，褐藻为泡叶藻、海带，棘皮动物为海参。

所述硫酸化岩藻寡糖的制备方法包含有如下步骤：

（1）岩藻多糖粗品提取：泡叶藻、海带或海参清洗除去泥沙，浸泡除盐，粉碎机粉碎，烘干，再次粉碎，过筛。在粉碎干燥物中加入3-10倍体积的石油醚或乙酸乙酯，90-95℃冷凝回流除去大部分色素、脂质。滤渣干燥，研磨，采用水提法或木瓜蛋白酶法提取得岩藻多糖粗品；

（2）岩藻聚糖的制备：上步制得的岩藻多糖粗品先经阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得岩藻聚糖半成品，上述岩藻聚糖半成品再经凝胶柱层析，即可分离得到岩藻聚糖成品，经液相色谱分析确定其为岩藻聚糖；

（3）硫酸化岩藻寡糖的制备：在上述步骤制得的岩藻聚糖配制成浓度为4-5mg/mL的溶液，在其中加入酸，使酸的终浓度为0.4-0.5mol/L， 50-70℃搅拌过夜；次日，加入碱中和后，加入90-100%乙醇至乙醇的终浓度达65-80%；3000-5000×g离心去除沉淀，收集上清液，旋转蒸发仪蒸干；重溶于去离子水中，上样柱层析，结合苯酚硫酸法或示差折光检测器收集各寡糖组分；所获得的寡糖组分，经液相色谱法确定单糖组成，合并收集，质谱法确证硫酸化岩藻寡糖的结构。

所述阴离子交换柱采用DEAE-52阴离子交换柱或Q-Sepharose F.F阴离子交换柱；所述凝胶柱采用Sephacryl S-300凝胶柱、Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱或SephadexG-200葡聚糖凝胶柱；所述柱层析采用Bio-Gel P4、 Bio-Gel P6或Sephadex G10进行柱层析。

所述的酸为盐酸、三氟乙酸、硫酸、柠檬酸和乙酸；所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾。

本发明的有益效果是：本发明首次发现硫酸化岩藻寡糖能显著抑制PCSK9蛋白的表达，为硫酸化岩藻寡糖在制备PCSK9抑制剂药物上的应用提供了详实的实施案例。在本发明的实施例中，不同来源的硫酸化岩藻寡糖可显著下调apoE(-/-)小鼠，C57BL/6小鼠和细胞中PCSK9蛋白表达水平；在制备方面，本发明的实施方法简单易于大规模生产，为该发明的转化奠定了基础。

附图说明

图1A所示为实施案例1处理后，泡叶藻岩藻聚糖采用ÄKTA pure 150结合阴离子交换柱所得洗脱曲线；图1B所示为实施案例1处理后，泡叶藻岩藻聚糖葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线。

图2A所示为标准单糖采用PMP衍生后的HPLC图谱；图2B所示为经实施案例1处理，泡叶藻岩藻聚糖经完全酸降解后，采用PMP衍生后所得HPLC图谱。

图3A所示为实施案例1处理后，寡糖的分离图谱；图3B为寡糖的单糖组成分析图谱；图3C为寡糖质谱及结构图谱。

图4A所示为实施案例1处理后，泡叶藻硫酸化岩藻寡糖下调高脂诱导的小鼠TC图谱；图4B泡叶藻硫酸化岩藻寡糖下调高脂诱导的小鼠TG图谱；图4C为泡叶藻硫酸化岩藻寡糖下调PCSK9表达图。

图5A所示为实施案例2处理后，海参岩藻聚糖采用ÄKTA pure 150结合阴离子交换柱所得洗脱曲线；图5B所示为实施案例2处理后，海参岩藻聚糖经葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线。

图6A所示为标准单糖采用PMP衍生后的HPLC图谱；图6B为经实施案例2处理，海参岩藻聚糖经完全酸降解后，采用PMP衍生后所得HPLC图谱。

图6A所示为泡叶藻岩藻聚糖A3的¹H-NMR图谱；图6B为泡叶藻岩藻聚糖A3的¹³C-NMR图谱。

图7A所示为实施案例2处理后，寡糖的分离图谱；图7B为寡糖的单糖组成分析图谱；图7C为寡糖质谱及结构图谱。

图8A所示为实施案例2处理后，海参硫酸化岩藻寡糖下调油酸诱导的HepG2细胞中TC图；图8B为海参硫酸化岩藻寡糖下调油酸诱导的HepG2细胞中TG图；图8C为海参硫酸化岩藻寡糖下调油酸诱导的HepG2细胞中PCSK9表达图。

图9A所示为实施案例3处理后，海带岩藻聚糖采用ÄKTA pure 150结合阴离子交换柱所得洗脱曲线；图9B所示为实施案例3处理后，海带岩藻聚糖经葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线。

图10A所示为标准单糖采用PMP衍生后的HPLC图谱；图10B所示为经实施案例3处理，海带岩藻聚糖经完全酸降解后，采用PMP衍生后所得HPLC图谱。

图11A所示为实施案例3处理后，寡糖的分离图谱；图11B为寡糖的单糖组成分析图谱；图11C为寡糖质谱及结构图谱。

图12A所示为实施案例3处理后，海带硫酸化岩藻寡糖下调高脂诱导的小鼠TC图谱；图12B泡叶藻硫酸化岩藻寡糖下调高脂诱导的小鼠TG图谱；图12C为泡叶藻硫酸化岩藻寡糖下调PCSK9表达图。

附图说明：

Man: 甘露糖；GluN: 葡萄糖胺；Rha: 鼠李糖；GluA : 葡萄糖醛酸；Glu: 葡萄糖；Gal :半乳糖； Xyl : 木糖；Fuc: 岩藻糖。

图4A-C与图12A-C中，与模型组相比，#P＜0.05；##P＜0.01；与阳性对照组相比，*P＜0.05, ** P＜0.01。图8A-C中，与空白组相比，##P＜0.01；与模型组相比，* P＜0.05,** P＜0.01；与阳性对照组相比，& P＜0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述：

实施例1：

提取制备泡叶藻硫酸化岩藻寡糖，采取了下述步骤：

（1）制备泡叶藻岩藻聚糖粗品：泡叶藻清洗，浸泡除盐，粉碎机粉碎，60℃烘干，再次粉碎，过100目筛。将粉碎干燥的泡叶藻，加入3倍体积的石油醚，，90℃冷凝回流除去大部分色素、脂质。滤渣干燥，研磨，采用水提法提取，90℃水浴加热3h，离心得上清液和滤渣（滤渣重复水提3次），收集上清液然后浓缩至原体积的三分之一，并根据浓缩液的体积计算需要加入氯化钙的量，使其终浓度达2%，边加边搅拌，这时会看到白色絮状沉淀出现为褐藻胶，经离心除去沉淀并收集上清，加入95%乙醇至乙醇的终浓度达60%，过夜使岩藻多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品。

（2）泡叶藻岩藻聚糖的制备：岩藻多糖粗品先经DEAE-52阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得泡叶藻岩藻聚糖半成品。上述泡叶藻岩藻聚糖半成品再经Sephacryl S-300凝胶柱层析，即可分离得到泡叶藻岩藻聚糖成品，经液相色谱分析（图谱见附图1A、1B 、2A和2B），确定其为岩藻聚糖。

（3）泡叶藻硫酸化岩藻寡糖的制备：在上述步骤制得的岩藻聚糖配制成浓度为5mg/mL的溶液，在其中加入盐酸，使盐酸的终浓度为0.5mol/L， 60℃搅拌过夜。次日，加入氢氧化钠中和后，加入95%乙醇至乙醇的终浓度达80%。4000×g离心去除沉淀，收集上清液，旋转蒸发仪蒸干。重溶于去离子水中，上样Bio-Gel P4柱层析，结合苯酚硫酸法收集各寡糖组分。所获得的寡糖组分，经液相色谱法确定单糖组成，质谱法确证硫酸化岩藻寡糖的结构（图谱见附图3A-C）。

验证其抑制PCSK9和降脂活性

（1）泡叶藻硫酸化岩藻寡糖作为PCSK9抑制剂方面的应用：SPF级载脂蛋白E敲除（apoE-/-）小鼠，雄性，体重21±3 g。动物适应性喂养1周后，将动物随机分为4组：

模型组（生理盐水）5只；

阳性药物LXRα激动剂T0901317组5只；

硫酸化岩藻寡糖低剂量组（25 mg/kg/d）5只；

硫酸化岩藻寡糖高剂量组（100 mg/kg/d）5只。

apoE-/-小鼠均给予高脂饲料（配方：胆固醇1 .0%、猪油15%、蛋黄粉10%、基础饲料74%）。各组连续灌胃给药2月后，取材。

实验期间，各组均无动物死亡。于末次给药后禁食6h，采用肝素抗凝取血管眼眶静脉采血0 .6-1 .0 mL，戊巴比妥钠麻醉处死，迅速摘取肝脏组织，分离血浆，-80 ℃下保存备用。所得血清样本检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）；所得肝脏组织检测PCSK9蛋白表达水平（图谱见附图4A-C）。

实验结果见附图1A到附图4C。

如图1A-B所示，泡叶藻岩藻聚糖分离纯化和纯度岩藻图谱。实验结果表明，经DEAE-52阴离子交换柱结合ÄKTApure 150分离纯化；再经Sephacryl S-300分子筛纯化所得图谱，显示所得泡叶藻岩藻聚糖组分为对称单一峰，硫酸根含量约为26.0%。

如图2A-B所示，泡叶藻岩藻聚糖的单糖组分分析图谱。其中，图2A为单糖标准品的图谱。实验结果表明：泡叶藻岩藻聚糖的单糖比例为Man : GluA : Gal : Xyl : Fuc=1 :0.41 : 0.3 : 2.5: 4.2。该结果说明，泡叶藻岩藻聚糖中，岩藻糖的含量约为50%。

如图3A-C所示，泡叶藻硫酸化岩藻寡糖的分离，单糖组成和结构确证。实验结果表明：泡叶藻岩藻聚糖经酸水解后，结合苯酚硫酸法收集各寡糖组分，硫酸化岩藻寡糖主要存在于图3A中标记的位置。收集该寡糖组分后，采用高效液相色谱法检测其单糖组成为半乳糖和岩藻糖，摩尔比例接近1：2。采用高分辨质谱法最终确定其结构如图3C所示。

动物实验结果如图4所示，泡叶藻硫酸化岩藻寡糖对apoE(-/-)小鼠血浆TC、TG、PCSK9的影响。实验结果显示，硫酸化岩藻寡糖给药组可显著下调血浆TC和TG，与模型组相比具有显著性差异（p＜0.05或p＜0.01）。实验结果表明：泡叶藻硫酸化岩藻寡糖在25mg/kg即可起到显著降低高脂诱导的apoE-/-小鼠血浆脂质的能力，而且其降脂效果在apoE(-/-)小鼠中效果优于LXRα激动剂T0901317（p＜0.05或p＜0.01）。值得关注的是，如图4C所示，硫酸化岩藻寡糖可显著下调PCSK9蛋白表达，且呈剂量依赖性（p＜0.05或p＜0.01）；而LXRα激动剂T0901317对PCSK9无显著下调作用。

实施例2：

提取制备海参硫酸化岩藻寡糖并验证其抑制PCSK9和降脂活性时，采取了下述步骤：

（1）制备海参岩藻聚糖粗品：海参清洗除去泥沙，浸泡除盐，粉碎机粉碎，50℃烘干，再次粉碎，过200目筛。将粉碎干燥的海参，加入5倍体积的乙酸乙酯，95℃冷凝回流除去大部分色素、脂质。滤渣干燥，研磨，采用木瓜蛋白酶法提取（海参与提取液的质量比为1：5-1：10）：每升提取液中，加入木瓜蛋白酶100 mg，采用醋酸钠和盐酸调节溶液的pH值到5.6，60℃水浴加热过夜，离心得上清液。收集上清液然后浓缩至原体积的三分之一，加入95%乙醇至乙醇的终浓度达70%，过夜使多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品。

（2）海参岩藻聚糖的制备：海参岩藻多糖粗品先经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得海参岩藻聚糖半成品。上述海参岩藻聚糖半成品再经Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析，即可分离得到海参岩藻聚糖成品，经液相色谱分析（图谱见附图5A、5B、6A和6B），确定其为岩藻聚糖。

（3）海参硫酸化岩藻寡糖的制备：在上述步骤制得的岩藻聚糖配制成浓度为5mg/mL的溶液，在其中加入乙酸，使乙酸的终浓度为0.5mol/L， 50℃搅拌过夜。次日，加入氢氧化钾中和后，加入100%乙醇至乙醇的终浓度达70%。5000×g离心去除沉淀，收集上清液，旋转蒸发仪蒸干。重溶于去离子水中，上样Bio-Gel P6柱层析，结合示差折光检测器收集各寡糖组分。所获得的寡糖组分，经液相色谱和质谱法验证寡糖的单糖组成，确定结构（图谱见附图7A-C）。

海参硫酸化岩藻寡糖在抑制PCSK9和降脂方面的应用：

将HepG2细胞以每孔2×10⁵个细胞的最终密度接种到6孔板中。12小时后，吸掉培养基，用PBS洗涤细胞3次。HepG2细胞每孔中加入1.5mL含有1％FBS和油酸（0.5mM）的培养基，并继续孵育24小时。孵育结束后，用PBS轻轻洗涤细胞3次。设置空白组（DMEM培养基）、对照组非诺贝特（10 μg/mL）、实验组海洋硫酸化岩藻寡糖组（10 μg/mL）处理细胞。每孔加入2.0 mL含有上述药物的DMEM培养基（含10％FBS）处理细胞24小时。吸弃培养基，并用PBS洗掉残余的培养基，加入4%的多聚甲醛固定30min。采用蛋白定量试剂盒检测细胞中的蛋白含量，TC和TG试剂盒检测细胞中脂质含量（图谱见附图8A-C）。

实验结果见附图5A到附图8C。

如图5A-B所示，海参岩藻聚糖分离纯化和纯度验证图谱。实验结果表明：经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱结合ÄKTApure 150分离纯化，再经Sephacryl S-200分子筛纯化所得图谱，显示所得海参岩藻聚糖为对称单一峰，硫酸根含量约为21%。

如图6A-B所示，海参岩藻聚糖的单糖组成分析图谱。实其中，图6A为单糖标准品的图谱。验结果表明：海参岩藻聚糖的单糖比例为Man: GlcN: GlcA: GalN: Gal : Xyl :Ara: Fuc= 1.0: 0.2: 0.18: 0.3: 0.1: 0.15:0.2: 19.0。该实验结果表明，海参岩藻聚糖中，岩藻糖的含量在89.9%。

如图7 A-C所示，海参硫酸化岩藻寡糖的分离，单糖组成和结构确证。实验结果表明：海参岩藻聚糖经酸水解后，结合示差折光检测器收集，硫酸化岩藻寡糖主要存在于图7A中标记的位置。收集该寡糖组分后，采用高效液相色谱法检测其单糖组成为岩藻糖。采用高分辨质谱法最终确定其结构如图7C所示。

如图8 A-C所示，海参硫酸化岩藻寡糖对油酸诱导的HepG2细胞中TC，TG和PCSK9的影响。实验结果表明：加入油酸（0.5mM）处理组的HepG2细胞脂质沉积明显高于空白组细胞，说明建模型是成功的。海参硫酸化岩藻寡糖可显著下调油酸诱导的HepG2细胞中TC，TG含量（p＜0.01）；且与阳性对照药物非诺贝特相比具有显著性差异（p＜0.05）。此外，硫酸化岩藻寡糖组可显著下调HepG2细胞中PCSK9的蛋白表达（p＜0.05）；硫酸化岩藻寡糖组与非诺贝特组相比也表现出显著性差异（p＜0.05）。

实施例3：

提取制备海带硫酸化岩藻寡糖，采取了下述步骤：

（1）制备海带岩藻聚糖粗品：海带清洗除去泥沙，浸泡除盐，粉碎机粉碎，40℃烘干，再次粉碎，过100目筛。将粉碎干燥的海带，加入10倍体积的石油醚，93℃冷凝回流除去大部分色素、脂质。滤渣干燥，研磨，采用水提法提取，100℃水浴加热2h，离心得上清液和滤渣（滤渣重复水提3次），收集上清液然后浓缩至原体积的三分之一，并根据浓缩液的体积计算需要加入氯化钙的量，使其终浓度达2%，边加边搅拌，这时会看到白色絮状沉淀出现即为褐藻胶，经离心除去沉淀并收集上清，加入95%乙醇至乙醇的终浓度达75%，过夜使岩藻多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品。

（2）海带岩藻聚糖的纯化：岩藻多糖粗品先经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得海带岩藻聚糖半成品。上述海带岩藻聚糖半成品再经Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱层析，即可分离得到海带岩藻聚糖成品，经液相色谱分析（图谱见附图9A、9B、10A、和10B），确定其为岩藻聚糖。

（3）海带硫酸化岩藻寡糖的制备：在上述步骤制得的岩藻聚糖配制成浓度为4mg/mL的溶液，在其中加入三氟乙酸，使三氟乙酸的终浓度为0.4mol/L， 70℃搅拌过夜。次日，加入氢氧化钠中和后，加入90%乙醇至乙醇的终浓度达65%。3000×g离心去除沉淀，收集上清液，旋转蒸发仪蒸干。重溶于去离子水中，上样Sephadex G10柱层析，结合苯酚硫酸法收集各寡糖组分。所获得的寡糖组分，经液相色谱法验证单糖组成，确定为硫酸化岩藻寡糖的组分，并合并收集，并采用质谱法确证寡糖结果（图谱见附图11A-C）。

海带硫酸化岩藻寡糖抑制PCSK9和降脂方面的应用：、

SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体重20±2 g。在实验条件下给予普通饲料适应性喂养1周，将实验动物随机分为4组：

模型组5只；

非诺贝特组（50 mg/kg/d）；

硫酸化岩藻寡糖低剂量组（20 mg/kg/d）5只；

硫酸化岩藻寡糖高剂量组（50 mg/kg/d）5只。

实验动物给予高脂饲料（配方：胆固醇1.5%、猪油12%、蛋黄粉10%、基础饲料76.5%）。

实验期间，各组均无动物死亡。于末次给药后禁食12h，采用肝素抗凝取血管眼眶静脉采血0 .7-1 .0 mL，戊巴比妥钠麻醉处死，迅速摘取肝脏组织，分离血浆，-80 ℃下保存备用。所得血清样本检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）；所得肝脏组织检测PCSK9蛋白表达水平（图谱见附图12A-C）。

实验结果见附图9A到附图12C。

如图9A-B所示，海带岩藻聚糖分离纯化和纯度验证图谱。实验结果表明：经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱结合ÄKTApure 150分离纯化，再经Sephadex G-200分子筛纯化，所得海带岩藻聚糖组分为对称单一峰，硫酸根含量约为22.8%。

如图10A-B所示，海带岩藻聚糖单糖组成分析图谱。其中，图10A为单糖标准品的图谱。实验结果显示：比例为Man : GluA : Gal : Xyl : Fuc=1.05 : 1.1 : 0.37 :0.3 :3.9。该实验结果说明，海带岩藻聚糖中，岩藻糖含量约为58%。

如图11 A-C所示，海带硫酸化岩藻寡糖的分离，单糖组成和结构确证。实验结果表明：海带岩藻聚糖经酸水解后，经Sephadex G10柱层析，结合苯酚硫酸法检测，硫酸化岩藻寡糖主要存在于图11A中标记的位置。收集该寡糖组分后，采用高效液相色谱法检测其单糖组成为半乳糖和岩藻糖，比例为1：3。采用高分辨质谱法最终确定其结构如图11C所示。

动物实验结果如图12 A-C所示，海带硫酸化岩藻寡糖对C57BL/6小鼠血浆TC，TG和PCSK9表达的影响。实验结果表明：海带岩藻寡在20 mg/kg即可起到显著降低高脂诱导的C57BL/6小鼠血浆TC和TG的作用（p＜0.05），效果与剂量为50 mg/kg的非诺贝特效果相当；值得关注的是，剂量为50 mg/kg时，其降脂效果显著优于阳性对照药物非诺贝特（p＜0.05或p＜0.01）。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.硫酸化岩藻寡糖作为PCSK9抑制剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述硫酸化岩藻寡糖的结构式如下：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述硫酸化岩藻寡糖类化合物的分子量分别为：200-2000 Da。

4.根据权利要求1-3所述的应用，其特征在于：所述硫酸化岩藻寡糖提取自褐藻或棘皮动物，褐藻为泡叶藻、海带，棘皮动物为海参。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述硫酸化岩藻寡糖的制备方法包含有如下步骤：

（1）岩藻多糖粗品提取：将原材料清洗除去泥沙，浸泡除盐，粉碎机粉碎，烘干，再次粉碎，过筛；. 在粉碎干燥物中加入3-10倍体积的石油醚或乙酸乙酯，90-95℃冷凝回流除去大部分色素、脂质；滤渣干燥，研磨，采用水提法或木瓜蛋白酶法提取得岩藻多糖粗品；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述阴离子交换柱采用DEAE-52阴离子交换柱或Q-Sepharose F.F阴离子交换柱；所述凝胶柱采用Sephacryl S-300凝胶柱、Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱或Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱；所述柱层析采用Bio-Gel P4、 Bio-Gel P6或Sephadex G10进行柱层析。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的酸为盐酸、三氟乙酸、硫酸、柠檬酸和乙酸；所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾。