CN117510663A - 一种ace抑制低分子量岩藻多糖及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ACE抑制低分子量岩藻多糖及其制备方法、应用，以褐藻为原料，采用CaCl2溶液提取醇沉的方式获得岩藻多糖，通过前期试验发现上述获得的岩藻多糖几乎没有ACE抑制活性，因而以此为母糖，在酸性条件下进行加热降解获得低分子量岩藻多糖。经过实验发现，该低分子量岩藻多糖分子量显著降低，ACE抑制活性远高于母糖且存在极显著性差异。表明本发明制备的低分子量岩藻多糖可用于辅助降血压功能性食品和医药品的开发。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物多糖技术领域，尤其涉及一种ACE抑制低分子量岩藻多糖及其制备方法、应用。
背景技术
高血压是一种以体循环动脉收缩压和/或舒张压持续升高为主要特点的全身性疾病，长期的高血压会引起身体组织器官发生病变，进而导致急慢性并发症，如中风、冠心病、糖尿病等。高血压病因复杂，已知体内许多系统与血压调节密切相关，其中最重要的是升压系统-肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)和降压系统-激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-Kinin System,KKS)。研究表明，血管紧张素转换酶(Angiotensinconverting enzyme，ACE)与体内血压有密切关系。ACE广泛存在于哺乳动物的各组织中，在RAS系统和KKS系统中同时存在。在RAS中，ACE水解无升压活性的血管紧张素Ⅰ，生成具有收缩血管作用的血管紧张素Ⅱ，同时在KKS中，ACE可以使具有血管舒张作用的舒缓激肽失活，导致血压升高。目前，用来预防和治疗高血压的ACE抑制剂类药物，效果虽好但仍存在多种不良反应。因此，寻找和开发新型ACE抑制天然活性物质仍是目前降血压功能性食品及医药领域的研究热点之一。
多糖是海藻最重要的功效成分之一。文献报道显示，海藻多糖具有多种优良的生物活性，如抗氧化、降血脂、降血糖等，但在降血压活性方面的研究较少，尤其是岩藻多糖。岩藻多糖是一种安全的生物原料，其衍生产品已被用作膳食补充剂、保健品、营养化妆品等，用于维持机体健康和对抗疾病。但是岩藻多糖也存在多糖共有的作用靶点不明确、分子量大、粘度高、生物利用度低等缺点，极大限制了其进一步的开发应用。与多糖相比，低分子量多糖结构清晰、水溶性高、生物利用度好，部分低分子量糖甚至显示出与母糖相似或高于母糖的生物活性，相对于母糖，应用前景更高。
目前，关于ACE抑制低分子量岩藻多糖的相关报道几乎没有，因此，寻找ACE抑制低分子量岩藻多糖对于基于岩藻多糖的辅助降血压功能性食品和医药品的开发具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种ACE抑制低分子量岩藻多糖及其制备方法、应用。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：、一种ACE抑制低分子量岩藻多糖，ACE抑制低分子量岩藻多糖分子量为6.7kDa，远低于母糖岩藻多糖，硫酸基含量为17.12％；
单糖组成包括岩藻糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖，摩尔比例mol％为33.93％，19.40％，26.14％，8.24％，3.78％，1.24％，7.27％。
作为优选地，岩藻糖由非硫酸化岩藻糖，4-硫酸化及2,3-硫酸化岩藻糖构成，半乳糖由非硫酸化-半乳糖及3-硫酸化半乳糖组成，甘露糖由非硫酸化甘露糖及4-硫酸化甘露糖组成。
一种ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备方法：以褐藻为原料，采用CaCl2溶液提取、阴离子交换色谱分离纯化的方式获得母糖岩藻多糖，将母糖岩藻多糖在酸性条件下进行加热降解，获得改性的ACE抑制低分子量岩藻多糖。
作为优选地，ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备包括如下步骤：
S1、将褐藻制成粉末状，将褐藻粉末脱脂，收集沉淀部分，再做干燥处理；
S2、向脱脂后的褐藻粉末中加入CaCl2溶液以提取，搅拌设定时间后，固液分离，收集上清液，将上清液浓缩、醇沉，收集沉淀部分，得混合岩藻多糖；
S3、将得到的混合岩藻多糖通过离子交换色谱分离纯化，一次用0-3mol/L的氯化钠水溶液洗脱，收集洗脱液，将其浓缩、脱盐、再浓缩、冷冻干燥，得到冻干样品；
S4、取冻干样品酸性条件下加热降解，得到ACE抑制低分子量岩藻多糖的6种低分子量单糖组分。
作为优选地，褐藻为铜藻。
作为优选地，S1中，采用20-30倍体积的乙醇溶液对褐藻粉末进行脱脂；乙醇溶液的浓度为95％；脱脂时间为20-30h，重复2-3次。
作为优选地，S2中，CaCl2溶液的浓度为1.5-2.5％，％表示质量百分数；
每克褐藻粉末采用20-30ml的CaCl2溶液进行浸渍处理，浸渍温度为60-70℃，时间为2-4h。
作为优选地，S2中，醇沉溶液为95％的乙醇溶液，醇沉体系在3-5℃静置设定时间；
S3中，脱盐采用透析脱盐，截留分子量为10000Da。
作为优选地，S4中，酸性条件下的加热降解过程为：将冻干样品配制成溶液，调节pH至0.3，水浴加热设定时间后，再调节至中性，冻干获得ACE抑制低分子量岩藻多糖；
其中，水浴加热的温度为40-80℃，水浴加热时间为1-23h。
一种ACE抑制低分子量岩藻多糖在制备降血压保健食品和/或药物中的应用。
本发明公开了一种ACE抑制低分子量岩藻多糖及其制备方法、应用，该ACE抑制低分子量岩藻多糖为本领域首次公开，由母糖岩藻多糖经过酸性条件下的加热降解，调节了其硫酸基含量、单糖组成比例，并显著降低了其分子量，从而使得制备的低分子量岩藻多糖具有远高于母糖岩藻多糖的ACE抑制活性，且存在极显著性差异。使得本发明制备的低分子量岩藻多糖可用于辅助降血压功能性食品和医药品的开发。
附图说明
图1为本发明实施例中岩藻多糖降解后分子量的变化趋势图。
图2为本发明实施例的ACE抑制活性测定中，血管紧张素Ⅰ模拟马尿酰组氨酰亮氨酸及马尿酸的高效液相色谱标准图谱。
图3为本发明实施例的ACE抑制活性测定中，经岩藻多糖及低分子量岩藻多糖作用后马尿酸含量变化高效液相色谱图。
图4为本发明实施例的岩藻多糖及低分子量岩藻多糖的红外光谱图。
图5为本发明实施例的岩藻多糖及低分子量岩藻多糖的核磁共振氢谱图(1HNMR)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明的发明人拟利用岩藻多糖作为活性物质制备降血压功能性食品或药品，获得了岩藻多糖，然而经ACE抑制活性测定实验发现，该岩藻多糖几乎没有ACE抑制活性。
岩藻多糖含有大量岩藻糖和硫酸基团，不同来源、不同方法制备得到的岩藻多糖，结构存在显著不同，进而导致生物活性的差异。为解决前期制备的岩藻多糖几乎不具有ACE抑制活性的问题，本发明创新性的提出了一种改性的低分子量岩藻多糖，并提出该低分子量岩藻多糖的制备方法，以及其在降血压功能性食品及药物中的应用。
一种典型实施方法，提供了一种低分子量岩藻多糖的制备方法，先获取母糖岩藻多糖，再以母糖岩藻多糖为基础，经改性制得低分子量岩藻多糖。以褐藻铜藻为原料，采用CaCl2溶液提取、阴离子交换色谱分离纯化的方式获得了岩藻多糖。经过表征表明，该方法制备的岩藻多糖分子量为327kDa，硫酸基团含量为19.42％，单糖组成包括岩藻糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖，摩尔比例(mol％)为26.94％，19.01％，28.74％，7.30％，8.38％，2.68％，6.95％，经过ACE抑制活性测定实验发现，该岩藻多糖的ACE抑制率仅6.36％，几乎没有ACE抑制活性。
为此，本发明进行进一步酸条件下加热分解改性，经过表征表明岩藻多糖经过酸性条件下的加热分解，硫酸基含量、单糖组成比例、分子量均发生变化，分子量、硫酸基团、单糖组成均为影响岩藻多糖生物活性的重要因素，上述变化导致低分子量岩藻多糖的生物活性发生变化，具有了远高于母糖岩藻多糖的ACE抑制活性。
经酸性改性后，制备获得的ACE抑制低分子量岩藻多糖分子量为6.7kDa，远低于母糖岩藻多糖，硫酸基含量为17.12％，单糖组成包括岩藻糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖，摩尔比例(mol％)为33.93％，19.40％，26.14％，8.24％，3.78％，1.24％，7.27％。
其中，岩藻糖由非硫酸化岩藻糖，4-硫酸化及2,3-硫酸化岩藻糖构成，半乳糖由非硫酸化-半乳糖及3-硫酸化半乳糖组成，甘露糖由非硫酸化甘露糖及4-硫酸化甘露糖组成。
对改性的低分子量岩藻多糖经母糖岩藻多糖相同条件的ACE抑制活性测定实验发现，该低分子量岩藻多糖的ACE抑制率为28.71％。与母糖岩藻多糖的ACE抑制率6.36％相比，低分子量岩藻多糖具有远高于母糖的ACE抑制活性，存在极显著性差异(P＜0.01)，同时分子量显著低于母糖。表明本发明制备的低分子量岩藻多糖可用于辅助降低血压功能性食品和医药品的开发。
作为优选地，本发明的另一典型实施方式，提供了上述ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备方法，包括如下步骤：
S1、将褐藻粉末脱脂后，收集沉淀部分，干燥处理；
S2、向脱脂后的褐藻粉末中加入CaCl2溶液，搅拌设定时间后，固液分离，收集上清液，将上清液浓缩、醇沉、收集沉淀部分，得混合岩藻多糖；
S3、将得到的混合岩藻多糖通过离子交换色谱分离，依次用0-3mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集洗脱液，将其浓缩、脱盐、再浓缩、冷冻干燥，得到冻干样品；
S4、取所需量冻干样品，经酸性降解得到6种低分子量组分，6种低分子量组分分别为岩藻糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖。
S1中，褐藻可具体采用铜藻，利用20-30倍体积的浓度为95％的乙醇溶液对褐藻粉末进行脱脂处理；脱脂的时间为20-30h，重复2-3次。
S2中，CaCl2溶液的浓度为1.5％-2.5％，％为质量百分数。每克褐藻粉末采用20-30ml的CaCl2溶液进行浸渍处理，褐藻粉末在CaCl2溶液中的浸渍温度为60-70℃，时间为2-4h；该操作实现了褐藻酸、褐藻酸钠的去除。浸渍处理后，收集上清液，过滤浓缩，利用95％乙醇溶液作醇沉处理，将醇沉体系在3-5℃条件下静置设定的时间，再收集沉淀部分。
S3中，采用DEAE-Sepharose FastFlow完成离子交换色谱分离；脱盐为透析脱盐，截留分子量为10000Da。
S4中，冻干样品在酸性条件下得到改性：将冻干样品配制成溶液，并调节pH值为0.3，水浴加热设定时间后，再调节至中性，冻干，低分子量岩藻多糖是由岩藻多糖经酸降解得到的。
水浴加热的温度为40-80℃，水浴加热的时间为1-23h。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。
【实施例】
ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)将铜藻洗净，除去泥沙，40-50℃烘干，粉碎得到藻体粉末。取100g藻体粉末，加入30倍体积的95％乙醇脱脂，室温下搅拌24h，重复3次。脱脂完毕后，静置离心，收集沉淀部分，自然晾干。
(2)取脱脂后的晾干藻体粉末，加入2％的CaCl2溶液，料液比为1:30g/mL，67-70℃下搅拌3h，搅拌结束静置离心，重复2次，合并上层清液。
(3)将上层清液超滤，液体体积浓缩至原体积的1/10～1/15时，加入4倍体积的95％乙醇，醇沉，4℃静置过夜，离心，收集沉淀部分，即混合岩藻多糖。
(4)将(3)中收集的沉淀部分通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱分离，依次用0-3mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、透析脱盐(截留分子量为10000Da)，脱盐后的溶液再次减压浓缩、冷冻干燥，得到冻干样品。
(5)选取得率较高的冻干样品配制成10mg/mL，利用HCl调节pH＝0.3，40-80℃水浴1-23h，绘制分子量变化曲线，如图1所示。
根据图1，选择温度为60℃降解1、3、7、11、15、23h得到的低分子量岩藻多糖，调节pH至中性，冻干，分别标记为F1-F6。
(6)对母糖岩藻多糖F及低分子量岩藻多糖F1-F6进行ACE抑制活性测定，红外光谱分析及核磁共振波谱分析。
以下为测定结果分析：
ACE抑制剂可通过抑制ACE的活性有效抑制Ang-II的合成来控制高血压，临床上用作一些降压药。筛选新型安全的ACE抑制天然活性物质仍是目前降血压功能性食品和医药品领域的研究热点。目前，ACE抑制活性物质的研究主要集中在ACE抑制肽，ACE抑制多糖的研究相对较少，尤其是岩藻多糖。采用高效液相色谱法测定岩藻多糖和低分子量岩藻多糖的ACE抑制活性。测定原理是37℃、pH 8.3条件下，ACE催化水解血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸产生马尿酸，马尿酸在紫外228nm处具有特征吸收峰，通过生成物马尿酸的变化计算ACE抑制率，母糖岩藻多糖F及低分子量岩藻多糖F1-F6的ACE抑制率如表1所示。
表1低分子量岩藻多糖F1-F6的ACE抑制率(％)测定结果
注：**，与岩藻多糖F组比较，P<0.01。
表1显示岩藻多糖F的ACE抑制率仅6.36％，几乎没有ACE抑制活性。低分子量岩藻多糖F1-F5的ACE抑制率与母糖相比，变化不大，直到F6，ACE抑制率增长至28.71％，远高于母糖且存在极显著性差异(P<0.01)，表明F6具有显著高于母糖的ACE抑制活性。图2为马尿酰组氨酰亮氨酸及马尿酸的高效液相色谱标准图谱，图3显示了在多糖的作用下，ACE催化马尿酰组氨酰亮氨酸生成马尿酸含量的变化，表明低分子量岩藻多糖F6可显著提高ACE抑制率。
图4为岩藻多糖F及低分子量岩藻多糖F6的红外光谱图，显示了硫酸化多糖的特征吸收峰：3700～3200cm-1处有极大吸收峰，源自于O-H的伸缩振动；3000～2800cm-1处有两个明显的吸收峰，多出现于2900cm-1周围，主要是由岩藻糖甲基所导致的；1670cm-1处为多糖类物质常见的微量水分缔合羟基造成；1245cm-1、820cm-1处的吸收峰表明存在硫酸基团，其中1245cm-1处的吸收峰归属于S＝O的不对称伸缩振动，820cm-1附近的吸收峰为C-O-S的轴向配位的伸缩振动。
图5为岩藻多糖F及低分子量岩藻多糖F6的核磁共振氢谱图，低场区δ5.00-5.50ppm为α-l-Fucp异头氢所在的区域，根据文献报道推测分别为非硫酸化岩藻糖，2,3-硫酸化岩藻糖及4-硫酸化岩藻糖的异头氢信号。δ4.00-4.50ppm为β-d-Manp及β-d-Galp异头氢所在的区域，根据文献报道推测为非硫酸化甘露糖、4-硫酸化甘露糖、非硫酸化半乳糖及3-硫酸化甘露糖。低分子量岩藻多糖与岩藻多糖的结构整体相似，但是分子量、糖残基的比例发生改变。再者，图中，“S”代表硫酸基，“di-S”代表双硫酸基；“0,2,3,4”代表硫酸基团在糖残基上的位置；Fuc,Man,Gal分别代表岩藻糖、甘露糖及半乳糖。
综上所述，本本发明以铜藻为原料，采用水提醇沉的方式获得岩藻多糖；通过前期试验发现上述获得的岩藻多糖几乎没有ACE抑制活性，因而将岩藻多糖在酸性条件下进行加热降解获得低分子量岩藻多糖。经过实验发现，该低分子量岩藻多糖具有远高于母糖及其他低分子量岩藻多糖的ACE抑制活性且存在极显著性差异(P＜0.01)。为本发明制备的低分子量岩藻多糖在辅助降血压功能性食品和医药品的开发奠定了理论基础。
上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种ACE抑制低分子量岩藻多糖，其特征在于：所述ACE抑制低分子量岩藻多糖分子量为6.7kDa，远低于母糖岩藻多糖，硫酸基含量为17.12％；
单糖组成包括岩藻糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖，摩尔比例mol％为33.93％，19.40％，26.14％，8.24％，3.78％，1.24％，7.27％。
2.根据权利要求1所述的ACE抑制低分子量岩藻多糖，其特征在于：所述岩藻糖由非硫酸化岩藻糖，4-硫酸化及2,3-硫酸化岩藻糖构成，半乳糖由非硫酸化-半乳糖及3-硫酸化半乳糖组成，甘露糖由非硫酸化甘露糖及4-硫酸化甘露糖组成。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备方法，其特征在于：以褐藻为原料，采用CaCl2溶液提取、阴离子交换色谱分离纯化的方式获得母糖岩藻多糖，将母糖岩藻多糖在酸性条件下进行加热降解，获得改性的ACE抑制低分子量岩藻多糖。
4.根据权利要求3所述的ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备方法，其特征在于：所述ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备包括如下步骤：
S1、将褐藻制成粉末状，将褐藻粉末脱脂，收集沉淀部分，再做干燥处理；
S2、向脱脂后的褐藻粉末中加入CaCl2溶液以提取，搅拌设定时间后，固液分离，收集上清液，将上清液浓缩、醇沉，收集沉淀部分，得混合岩藻多糖；
S3、将得到的混合岩藻多糖通过离子交换色谱分离纯化，一次用0-3mol/L的氯化钠水溶液洗脱，收集洗脱液，将其浓缩、脱盐、再浓缩、冷冻干燥，得到冻干样品；
S4、取冻干样品酸性条件下加热降解，得到ACE抑制低分子量岩藻多糖的6种低分子量单糖组分。
5.根据权利要求4所述的ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备方法，其特征在于：所述褐藻为铜藻。
6.根据权利要求4所述的ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备方法，其特征在于：S1中，采用20-30倍体积的乙醇溶液对褐藻粉末进行脱脂；乙醇溶液的浓度为95％；脱脂时间为20-30h，重复2-3次。
7.根据权利要求4所述的ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备方法，其特征在于：S2中，CaCl2溶液的浓度为1.5-2.5％，％表示质量百分数；
每克褐藻粉末采用20-30ml的CaCl2溶液进行浸渍处理，浸渍温度为60-70℃，时间为2-4h。
8.根据权利要求7所述的ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备方法，其特征在于：S2中，醇沉溶液为95％的乙醇溶液，醇沉体系在3-5℃静置设定时间；
S3中，脱盐采用透析脱盐，截留分子量为10000Da。
9.根据权利要求4所述的ACE抑制低分子量岩藻多糖的制备方法，其特征在于：S4中，酸性条件下的加热降解过程为：将冻干样品配制成溶液，调节pH至0.3，水浴加热设定时间后，再调节至中性，冻干获得ACE抑制低分子量岩藻多糖；
其中，水浴加热的温度为40-80℃，水浴加热时间为1-23h。
10.一种如权利要求1-2任一项所述的ACE抑制低分子量岩藻多糖在制备降血压保健食品和/或药物中的应用。
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