CN104256252A - 一种分步提取与生物转化偶联制备海带降血压制品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种辅助降血压保健制品，提供一种分步提取与生物转化偶联制备辅助降血压保健海带制品的方法，属于海洋食品精深加工领域。该方法以优质海带为原料，采用循环超声分步浸提工艺与生物转化偶联制备技术，制备步骤依次为：原料预处理、醇提甘露糖醇、酸提醇沉褐藻胶和褐藻糖胶、生物转化、超滤，得到降血压生理活性组分并进行科学配伍。本发明方法针对我国传统大宗海产品海带进行精深加工和综合利用，得到具有降血压功能的甘露糖醇、褐藻胶、褐藻糖胶、海带膳食纤维和海带降血压肽五个产品。对这五个产品进行科学配伍，开发系列具有显著辅助降血压功能的新型海带降血压功能性制品。该制品ACE抑制活性IC50为0.68~1.15mg/g，显著降低SHR大鼠血压（-12.4~-17.5）mmHg。
Description
技术领域
本发明属于海洋食品精深加工领域，具体涉及一种分步提取和生物转化偶联制备辅助降血压保健海带制品的方法。
背景技术
高血压是引起心脑血管疾病的重要危险因子，已成为严重的国际公共卫生问题，然而，目前市场上所销售的降血压药物大多为化学合成药物，长时间服用易产生相应的副作用，引起身体不适。因此研发一种安全性高、副作用小、易吸收的食源性降血压制品将十分重要。
海带营养丰富、功能众多，有“碱性植物之冠”之称，具有很高的经济价值，不但可以食用，补充人体内所需营养，而且在医疗保健方面有更多功用，如降血压、降血脂及抗癌等，是医药工业宝贵的原材料。据资料记载，古往今来，食用海带降低血压是我国民间普遍使用的有效方法，日本也有通过饮用海带浸泡液来降低血压的民间习俗。由此可见，海带为降血压制品的研发提供了高品质的资源。
我国海带总产量跃居世界首位，而利用率却仅为30%，行业总体加工水平偏低，仅限于初级加工产品形式（如海带丝、海带结等）以及单一物质的提取（如甘露糖醇、褐藻酸钠等），加工副产物中的褐藻糖胶、活性多肽、膳食纤维等优质资源则被当成废料废弃，造成了海带资源的极大浪费。例如，申请号为201310101070.1的发明专利“一种海带营养成分的制备方法”（申请时间为2013.03.26），是以海带为原料，采用微波提取法分步提取海带中的甘露糖醇、低级性营养成分及多糖蛋白混合物等几种营养成分。该专利大体上实现了海带的综合利用，得到了海带的营养成分混合粗提物，但尚未得到具体的单一成分，也未能将营养成分的具体功效加以研究利用，经济价值不高，不足以实现海带的高值化利用，且步骤操作复杂，耗能巨大。
因此，开发一种分步提取和生物转化偶联制备海带降血压制品的方法，不仅能获取甘露糖醇、褐藻胶、褐藻糖胶等单一组分的营养物质，且可以生物转化得到短链活性小肽，科学配伍得到具有降血压功效的海带制品，实现了海带高值化利用，且降低能耗、减少污染、节约成本，同时实现海带资源回收利用，大大提升海带产品附加值，进而带动和促进海带产业的发展。
发明内容
本发明目的在于提供一种以海带为原料，分步提取与生物转化偶联制备降血压制品的方法，以解决上述技术中存在的难题并实现海带高值化综合利用，进而大幅度提高海带的附加值，降低海带的资源浪费，同时降低生产成本，实现节能降耗。
上述一种分步提取与生物转化偶联制备海带降血压制品的方法包括以下步骤：
1）原料预处理：新鲜海带或海带下脚料清洗除杂后，60 ℃低温烘干至恒重，粉碎成80~200目粉末，备用；
2）醇提甘露糖醇：将步骤1）中粉末与95wt.%乙醇以固液比为1:25~1:30进行循环超声辅助提取，时间50~60min，温度50~55℃，减压抽滤，滤渣真空干燥后备用；滤液浓缩后趁热抽滤，0 ℃下析晶，过滤干燥得海带甘露糖醇产品；
3）酸提褐藻胶及褐藻糖胶：将步骤2）中滤渣与0.1mol·L-1盐酸溶液以固液比为1:35~1:50进行循环超声辅助提取，时间40~50min，温度为50~60℃，离心备用；
4）醇沉褐藻胶及褐藻糖胶：将步骤3）中上清液用30~40wt.%乙醇沉淀，离心收集沉淀，无水乙醇洗涤即得褐藻胶，提取完褐藻胶的上清液用60~70wt.%的乙醇沉淀，离心收集沉淀、无水乙醇漂洗即得褐藻糖胶；收集上清液，与步骤3）中滤渣混合浓缩，冷冻干燥备用；
5）梯度生物转化：以ACE抑制活性为指标，将步骤4）中冷冻干燥物按固液比1:20~1:40，酶添加量2~8%（w/w）依次加入不同的蛋白酶，按蛋白酶的最佳反应条件可控酶解4~6 h，90 ℃灭酶15~20 min，离心收集上清液；沉淀经真空干燥即为海带膳食纤维粗品；
6）超滤：步骤5）中上清液进行超滤处理，截留10000 Da分子量以下组分，冷冻干燥得海带降血压肽；
7）科学配伍：将上述步骤中所得的5个海带降血压功能组分进行科学配伍，获得系列海带降血压制品；
8）活性检测：将步骤7）所制得的海带降血压制品进行体外ACE活性抑制检测，检测该制品抑制ACE活性的IC50值0.68~1.15mg/g。
所述梯度生物转化中不同蛋白酶依次可控酶解顺序为风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。
所述工艺，先将海带中甘露糖醇、褐藻胶、褐藻糖胶等成分采用超声循环分步提取，降低其对海带蛋白酶解的干扰作用，提高水解效率，并实现海带综合利用。
所述梯度生物转化中的蛋白酶水解时间和水解度根据产物的ACE抑制活性高低确定。
所述工艺步骤可获得具有降血压功能的甘露糖醇、褐藻胶、褐藻糖胶、海带膳食纤维和海带降血压肽五个产品。
所述的海带降血压制品中5个产品按重量比例计为：甘露糖醇15~23%，褐藻胶18~21%，褐藻糖胶11~19%，降血压肽31~43%，膳食纤维16~25%。所述制品经体外降血压模型检测，具有显著的ACE抑制活性，其IC50值为0.68 ~ 1.15 mg/g。
上述分步提取与生物转化偶联制备海带降血压制品的方法与现有海带深加工技术相比有以下优点：
1. 该发明结合循环超声技术，偶联梯度生物转化技术实现了海带中的甘露糖醇、褐藻胶、褐藻糖胶、海带降血压肽、膳食纤维等五种组分的分步提取，减少了海带资源的浪费，达到了海带综合利用的目的，同时缩短提取时间，提高提取效率，降低生产成本，总体实现节能降耗，节约成本，提高海带的高值化利用率。
2. 该发明不仅实现了海带资源的综合利用，且提取得到的五种活性组分经科学配伍后对预防和治疗高血压有着显著效果，具有辅助降血压的功效，大大提高了海带的附加值。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下结合具体实例来进一步说明本发明的技术方案，但以下实施例仅属于本发明范围，却并不局限于此。
实施例1
一种分步提取与生物转化偶联制备海带降血压制品的方法包括以下步骤：
1）原料预处理：新鲜海带或海带下脚料清洗除杂后，60℃低温烘干至恒重，粉碎成80目粉末，备用。
2）醇提甘露糖醇：将步骤1）中粉末与95wt.%乙醇以固液比为1:30进行循环超声辅助提取，时间55min，温度50℃，减压抽滤，滤渣真空干燥后备用；滤液浓缩后趁热抽滤，0℃下析晶，过滤干燥得海带甘露糖醇产品；
3）酸提褐藻胶及褐藻糖胶：将2）中滤渣与0.1mol·L-1盐酸溶液以固液比为1: 50进行循环超声辅助提取，时间45min，温度为60℃，离心备用；
4）醇沉褐藻胶及褐藻糖胶：将步骤3）中上清液用30wt.%乙醇沉淀，离心收集沉淀，无水乙醇洗涤即得褐藻胶，提取完褐藻胶的上清液用65wt.%乙醇沉淀，离心收集沉淀、无水乙醇漂洗即得褐藻糖胶；收集上清液，与步骤3）中滤渣混合浓缩，冷冻干燥备用；
5）梯度生物转化：以ACE抑制活性为指标，将步骤4）中冷冻干燥物按固液比1:30，酶添加量6%（w/w）依次加入不同的蛋白酶，按蛋白酶的最佳反应条件可控酶解6h，90℃灭酶15min，离心收集上清液；沉淀经真空干燥即为膳食纤维粗品。
6）超滤：步骤5）中上清液进行超滤处理，截留10000Da分子量以下组分，冷冻干燥得海带降血压肽。
7）科学配伍：将上述步骤中所得的5个海带降血压功能组分按重量比例进行科学配伍，其中甘露糖醇15%，褐藻胶18%，褐藻糖胶11%，降血压肽31%，膳食纤维25%，进而获得新型海带降血压功能制品。
8）活性检测：将步骤7）所制得的海带降血压制品进行体外ACE活性抑制检测，检测该制品的IC50值为1.03mg/g。
检验该实施例降血压功能的动物实验，检验依据：保健食品检验与评价技术规范（卫生部2003版）。
1试验材料和方法
1.1 受试动物：实验用清洁级原发性高血压大鼠（SHR），购于福建医科大学实验动物中心，雄性，11周龄，体重180~220克。
1.2 饲养及检测条件：饲喂于恒温动物房，温度25℃，相对湿度70%，饲喂标准饲料，自由进食和饮水，实验前在动物房内适应一周。
1.3实验方法
1.3.1 剂量配制：根据保健食品检验与评价技术规范（卫生部2003版）要求，实验根据人体每日推荐量（240mg/日）的5倍，10倍，30倍分别设低、中、高三个剂量组，依次为4mg/kg、8mg/kg、24mg/kg体重，同时设定空白对照组（H2O）及阳性对照组（卡托普利），卡托普利剂量为2.5mg/kg体重，灌胃给予受试物，灌胃容积按0.1mL/10g体重计。
1.3.2 测定方法：将SHR大鼠随机分为3个剂量组、1个阴性对照组及1个阳性对照组，每组10只，按照1.3.1设计的剂量给予相应剂量，每日一次，连续给予4周，空白组给予相应体积的水。给药结束后采用大鼠尾动脉收缩压法测定SHR大鼠的血压，重复测定三次取平均值。给药期间每周测定一次大鼠的血压和体重。实验前一周对受试动物进行多次血压测量，以便其适应测压环境。
1.4 数据统计：采用IBM SPSS Statistics 20软件进行统计分析。
2 实验结果
2.1海带降血压制品对SHR大鼠血压的影响
表1 海带降血压制品对SHR大鼠血压的影响（ ，n=10）
注：与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。
由表1知，空白条件下饲喂SHR大鼠4周后，SHR大鼠的血压持续增高。给予海带降血压制品及卡托普利4周后，SHR大鼠的血压有不同程度的下降，随着给予降血压制品和卡托普利时间的持续，SHR大鼠血压逐渐减缓趋于平稳，且与空白对照组相比均显著降低（P<0.05），处于较低水平；高剂量组较对照组相比血压降低-17.4mmHg，中剂量组比对照组血压降低-15.4mmHg，低剂量组降低-5.7mmHg。说明海带降血压产品有明显的降血压效果，可以作为辅助降血压功能性食品。
2.2海带降血压制品对SHR大鼠体重的影响
表2 海带降血压制品对SHR大鼠体重的影响（）
实验中各组动物生长良好，一切正常，结果见表2，各组动物体重与空白对照组相比均无显著差异性（P>0.05）。
2.3海带降血压制品对SHR大鼠心率的影响
表3 海带降血压制品对SHR大鼠心率的影响（）
数据结果分析实验前与实验后大鼠心率变化不显著(P>0.05)，且各个剂量对大鼠心率不产生显著影响（P>0.05），小鼠生长良好。
上述动物实验结果显示：实验前与实验后相比，小鼠体重、心率变化无显著性差异（P>0.05），说明该海带降血压制品对小鼠的正常生长发育没有不良影响； SHR大鼠的血压值依剂量显示不同程度的下降，高剂量组下降约10.05%，中剂量组下降约8.89%，低剂量组下降约5.7%。实验说明该海带降血压制品具有良好的降血压功效。
实施例2
一种分步提取与生物转化偶联制备海带降血压制品的方法包括以下步骤：
1）原料预处理：新鲜海带或海带下脚料清洗除杂后，60℃低温烘干至恒重，粉碎成100目粉末，备用。
2）醇提甘露糖醇：将步骤1）中粉末与95wt.%乙醇以固液比为1:25进行循环超声辅助提取，时间60min，温度50℃，减压抽滤，滤渣真空干燥后备用；滤液浓缩后趁热抽滤，0℃下析晶，过滤干燥得海带甘露糖醇产品；
3）酸提褐藻胶及褐藻糖胶：将2）中滤渣与0.1mol·L-1盐酸溶液以固液比为1:35进行循环超声辅助提取，时间50min，温度为55℃，离心备用；
4）醇沉褐藻胶及褐藻糖胶：将步骤3）中上清液用35wt.%乙醇沉淀，离心收集沉淀，无水乙醇洗涤即得褐藻胶，提取完褐藻胶的上清液用60wt.%的乙醇沉淀，离心收集沉淀、无水乙醇漂洗即得褐藻糖胶；收集上清液，与步骤3）中滤渣混合浓缩，冷冻干燥备用；
5）梯度生物转化：以ACE抑制活性为指标，将步骤4）中冷冻干燥物按固液比1:25，酶添加量为4%（w/w）依次加入不同的蛋白酶，按蛋白酶的最佳反应条件可控酶解4.8h，90℃灭酶15min，离心收集上清液；沉淀经真空干燥即为膳食纤维粗品。
6）超滤：步骤5）中上清液进行超滤处理，截留10000Da分子量以下组分，冷冻干燥得海带降血压肽。
7）科学配伍：将上述步骤中所得的5个海带降血压功能组分按重量比例进行科学配伍，其中甘露糖醇21%，褐藻胶16%，褐藻糖胶15%，降血压肽38%，膳食纤维10%，进而获得新型海带降血压功能制品。
8）活性检测：将步骤7）所制得的海带降血压制品进行体外ACE活性抑制检测，检测该制品ACE活性抑制IC50值为0.92mg/g。
检验该实施例降血压功能的动物实验，检验依据：保健食品检验与评价技术规范（卫生部2003版）。
动物实验的具体实施步骤同实施例1，实验结果显示，该海带降血压制品对SHR大鼠的血压值有显著影响，可显著降低血压值为14.6mmHg，且对大鼠的心率、体重无显著影响（P>0.05），无碍SHR大鼠正常生长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种分步提取与生物转化偶联制备海带降血压制品的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）原料预处理：新鲜海带或海带下脚料清洗除杂后，60℃低温烘干至恒重，粉碎成80~200目粉末，备用；
2）醇提甘露糖醇：将步骤1）中粉末与95wt.%乙醇以固液比为1:25~1:30进行循环超声辅助提取，时间50~60min，温度50~55℃，减压抽滤，滤渣真空干燥后备用；滤液浓缩后趁热抽滤，0 ℃下析晶，过滤干燥得海带甘露糖醇产品；
3）酸提褐藻胶及褐藻糖胶：将步骤2）中滤渣与0.1mol·L-1盐酸溶液以固液比为1:35~1:50进行循环超声辅助提取，时间40~50min，温度为50~60℃，离心备用；
4）醇沉褐藻胶及褐藻糖胶：将步骤3）中上清液用30~40wt.%乙醇沉淀，离心收集沉淀，无水乙醇洗涤即得褐藻胶，提取完褐藻胶的上清液用60~70wt.%的乙醇沉淀，离心收集沉淀、无水乙醇漂洗即得褐藻糖胶；收集上清液，与步骤3）中滤渣混合浓缩，冷冻干燥备用；
5）梯度生物转化：以血管紧张素转化酶抑制活性为指标，在步骤3）0.1mol·L-1盐酸轻度水解的基础上，将步骤4）中冷冻干燥物按固液比1:20~1:40，酶添加量为2~8wt.%依次加入不同的蛋白酶，按蛋白酶的最佳反应条件可控酶解4~6 h，90 ℃灭酶15~20 min，离心收集上清液；沉淀经真空干燥即为海带膳食纤维粗品；
6）超滤：步骤5）中上清液进行超滤处理，截留10000 Da分子量以下组分，冷冻干燥得海带降血压肽；
7）科学配伍：将上述步骤中所得的5个海带降血压功能组分进行科学配伍，获得系列海带降血压制品。
2.根据权利要求1所述分步提取和生物转化偶联制备海带降血压制品的方法，其特征在于：所述梯度生物转化中不同蛋白酶依次可控酶解顺序为风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。
3. 一种如权利要求1所述方法制得的产品，其特征在于：所述工艺步骤可获得具有降血压功能的甘露糖醇、褐藻胶、褐藻糖胶、海带膳食纤维和海带降血压肽五个产品。
4. 一种如权利要求1所述方法制得的海带降血压制品，其特征在于：所述海带降血压制品中的五种产品按重量比例计为：甘露糖醇15~23%，褐藻胶18~21%，褐藻糖胶11~19%，降血压肽31~43%，膳食纤维16~25%。
5. 根据权利要求4所述方法制得的海带降血压制品，其特征在于：所述制品经体外降血压模型检测，具有显著的ACE抑制活性，其IC50值为0.68 ~ 1.15 mg/g。
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