CN111499700B

CN111499700B - 一种新型褐藻胶特异性结合蛋白及其制备与应用

Info

Publication number: CN111499700B
Application number: CN202010370711.3A
Authority: CN
Inventors: 常耀光; 梅轩玮; 申晶晶; 薛长湖; 李嘉靖; 陈广宁; 李兆杰; 唐庆娟
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2040-05-06
Also published as: CN111499700A

Abstract

本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种新型褐藻胶特异性结合蛋白及其制备与应用。AusG_Wf对褐藻胶具有特异性结合能力，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。本发明中的AusG_Wf制备程序简便、快速、成本低、且能够大批量制备，解决了此前褐藻胶特异性结合蛋白无法实现高效获取的问题。另外，本发明还提供了基于AusG_Wf在褐藻胶定性、半定量、可视化观察中的方法及应用实例。AusG_Wf是一种研究褐藻胶的理想工具，具有可观的开发应用前景。

Description

一种新型褐藻胶特异性结合蛋白及其制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种新型褐藻胶特异性结合蛋白及其制备与应用。

背景技术

褐藻胶是一类存在于海带、马尾藻、巨藻等褐藻细胞壁中的天然阴离子多糖，是由α-L 古洛糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸通过1,4糖苷键连接而成的线性高分子聚合物。褐藻胶是一种重要的海洋多糖，因其良好的凝胶性、乳化性、增稠性等物理化学特性，在食品、化工、医药等领域得到了广泛的应用。现已证明褐藻胶具有促进肠胃蠕动、神经保护、降血脂、抗凝血、抗病毒等一系列生理调节功能，在功能食品开发方面亦具有巨大潜力。

碳水化合物特异性结合蛋白是一类可以特异性识别、结合特定结构碳水化合物的蛋白。基于特异性结合的特点，碳水化合物结合蛋白可用于多糖及寡糖的亲和纯化、酶的固定化、以及特定结构碳水化合物的定性、半定量与特异性可视化观察，是碳水化合物的研究与开发的重要工具。当前国内外关于褐藻胶特异性结合蛋白的报道稀少，仅有Torode等人于2016 年报道了一组可特异性识别褐藻胶的抗体BAM6及BAM8-BAM11；但抗体获取的流程繁琐且成本高昂，而且目前抗体BAM6及BAM8-BAM11的编码基因序列未知，无法对其进行克隆表达以实现大批量制备。因此，制备低成本且能够高效获取的褐藻胶特异性结合蛋白具有意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是目前少见关于褐藻胶特异性结合蛋白的研究，且没有高效获取褐藻胶特异性结合蛋白的有效途径，不利于对褐藻胶的深入研究与开发。

为解决上述问题，本发明从海洋细菌Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T中挖掘出一条编码褐藻胶特异性结合蛋白的基因序列AusG_Wf。基于其明确的基因序列，本发明通过克隆表达的方法制备出褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf。与传统褐藻胶特异性抗体的获取相比具有简便、快速、成本低、且能够大批量制备的优点。另外，本发明还提供了基于AusG_Wf 的褐藻胶定性、半定量、可视化观察的方法及应用实例，展现出AusG_Wf的良好应用潜力。

进一步的，所述褐藻胶特异性结合蛋白为褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1：

EDLPEAGSKPDNTPPSSSFSAEEQSGDYLTYLFTNTSDSATDYEWDFGDAASGADNTS TEKDPSHTFSGEGTYTVTLVASDKLGVESTFSSTVEVVEPDAPSVFVPTILEAGFEDGGLAG GTGDGRDSWRISGGKIFGITSSPVRTGSQGAKFDAGDPRVAYQELTVTPNADYIVSIYYTMK TDPAGGALRLAVLGEAISNASEAEAAIIASVSGTDQTSASDYVQMTLEFNSGNRSTIAIWIDS NNITEARVDDVTIIAKPE

上述褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf含有一个CBM16家族的碳水化合物结合结构域。 AusG_Wf能够结合褐藻胶，且对与褐藻胶具有类似结构的多糖(果胶、硫酸软骨素、透明质酸、肝素)及褐藻来源的多糖(海带淀粉、岩藻聚糖)不具有结合能力(图1所示)。本发明中的AusG_Wf底物特异性强、制备简便且成本低，同时能够大批量获取，在褐藻胶的定性、半定量、可视化观察等研究中可发挥重要作用。

上述褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf所对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

GAAGATTTACCAGAGGCTGGTTCTAAACCAGATAACACTCCTCCAAGTAGTAGCTT TTCTGCAGAAGAACAAAGTGGGGATTATTTAACCTATTTATTTACAAACACTTCTGATAG TGCAACGGATTATGAATGGGACTTTGGTGATGCCGCTTCAGGAGCTGATAATACATCTAC TGAAAAAGATCCATCACATACTTTTTCTGGAGAAGGAACTTATACAGTTACTTTAGTTGC TTCTGATAAATTAGGAGTAGAAAGTACGTTTAGCAGTACTGTTGAGGTTGTAGAACCAG ATGCGCCAAGTGTATTTGTACCAACAATTTTAGAAGCTGGTTTTGAAGATGGTGGTTTAG CAGGTGGTACTGGTGATGGTCGTGATTCTTGGAGAATATCTGGAGGTAAAATATTTGGAA TTACTAGTAGCCCTGTTCGTACAGGTTCTCAAGGAGCTAAGTTTGATGCAGGAGATCCTC GTGTTGCTTATCAAGAGTTAACAGTTACTCCAAATGCAGATTATATCGTTTCTATTTATTAT ACCATGAAAACAGATCCTGCTGGAGGAGCGTTGAGGTTAGCTGTTTTAGGAGAAGCTAT CTCTAATGCCTCTGAAGCTGAAGCAGCTATTATTGCTTCTGTTAGTGGTACAGACCAAAC AAGTGCAAGCGATTATGTACAAATGACGTTAGAGTTTAACTCTGGAAATAGAAGTACAA TTGCTATATGGATTGATAGCAATAATATTACTGAAGCAAGAGTAGATGATGTGACTATTAT TGCTAAACCAGAATAA

本发明中编码上述褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf的基因，其核苷酸序列为SEQID NO. 2及可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。

本发明提供了一种褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf的制备方法，其中，基于AusG_Wf 明确的基因序列，通过克隆表达的方法制备出褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf。表达宿主为但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等中的任意一种。包括以下及同等作用步骤：

(1)在培养基中培养Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T直至对数末期并提取全基因组DNA。

(2)依据目的基因、表达载体、酶切位点设计引物，经聚合酶链式反应(PCR)得到目基因片段AusG_Wf，PCR反应条件为95℃ 3min，95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s。

(3)利用限制性内切酶双酶切目的基因及表达载体，连接构成重组质粒，而后将其转入感受态细胞构成重组菌株。其中，限制性内切酶和感受态细胞的选择分别需根据所选表达载体和表达宿主而定。

(4)菌株培养、蛋白表达及获取，该步骤所使用的条件根据不同的表达宿主而选择。

进一步的，本发明还提供了一种褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf与荧光蛋白融合表达的方法，进而实现AusG_Wf的荧光标记。其中，上述步骤(2)中的表达载体为但不限于pRSET_EmGFP大肠绿色荧光表达质粒、pRSETB_mCherry大肠红色荧光表达质粒等中的任意一种。

本发明还提供了一种基于褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf对褐藻胶进行定性和半定量检测的方法。基于褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf，结合微阵列技术能够实现褐藻胶的定性和半定量分析。包括以下及同等作用步骤：

(1)取1μL待测样品至反应介质(硝酸纤维素膜，以下反应介质均指硝酸纤维素膜)上，室温干燥，使待测样品充分与反应介质结合。

(2)用含有封闭剂(脱脂奶粉)的pH值为4-11的缓冲液(磷酸盐缓冲液)封闭反应介质30-90min，避免非特异性结合干扰实验结果。

(3)取一定量褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf均匀滴加至反应介质上(5cm²反应介质约需2mL)，孵育一段时间，用水冲洗，使AusG_Wf与褐藻胶特异性结合。

(4)利用步骤(2)中缓冲液稀释(1：50000-1：5000)连有辣根过氧化酶的抗组氨酸单克隆抗体，取一定量的稀释抗体(5cm²反应介质约需2mL)均匀滴加至反应介质上，孵育60-120min，用水冲洗。均匀滴加一定量电化学发光(ECL)试剂(5cm²反应介质约需2mL) 至反应介质上，显色1-2min。如果AusG_Wf可以结合某种多糖，且由于AusG_Wf中含有组氨酸标签，则连有辣根过氧化酶的抗组氨酸单克隆抗体可与AusG_Wf结合进而吸附至反应介质上，而后在辣根过氧化酶的催化下，ECL试剂中的鲁米诺和过氧化氢会发生反应从而产生荧光信号。相反，由于此前利用脱脂奶粉封闭了反应介质，如果AusG_Wf对多糖没有结合能力，则连有辣根过氧化酶的抗组氨酸单克隆抗体不会结合至反应介质上，进而不会产生荧光信号。

(5)信号检测。若在成像仪中观察有荧光信号的出现，则代表此样品中存在褐藻胶；若没有荧光信号，则不含有褐藻胶。

进一步的，若要对褐藻胶进行半定量分析。在上述步骤(1)处称取化学级或以上纯度的褐藻胶溶于pH值为4-11的缓冲液(磷酸盐缓冲液)中，分别取1μL具有浓度梯度的褐藻胶标准溶液于反应介质上，室温干燥后，执行(2)-(5)步骤。信号检测后，利用图像处理软件将已知褐藻胶浓度的荧光信号转化为灰度值，最高灰度值(即最高褐藻胶浓度)设置为1，其它数值均相应的标准化。以灰度值为纵坐标、褐藻胶浓度值为横坐标建立标准曲线，将待测样品的灰度值带入标准曲线即可实现对样品中褐藻胶的半定量分析。

进一步的，在上述步骤(3)处还可使用与荧光蛋白融合表达的褐藻胶特异性结合蛋白 AusG_Wf，而后无需进行上述步骤(4)，可直接在成像仪中检测，实现样品中褐藻胶的定性和半定量分析。

本发明还提供了一种采用荧光标记或与荧光蛋白融合表达的褐藻胶特异性结合蛋白 AusG_Wf对褐藻胶进行特异性可视化观察的方法，基于荧光标记或与荧光蛋白融合表达的褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf，搭配显微镜实现褐藻胶的特异性可视化观察。包括以下及同等作用步骤：

(1)固定：将新鲜组织切片放入万能固定液中浸泡24h；

(2)脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-超纯水洗；

(3)组织切片置于盛满EDTA褐藻胶修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中高火5min停火5min转中低火10min。自然冷却后将玻片置于磷酸盐缓冲液中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min(修复液和修复条件根据组织切片来确定)；

(4)自荧光猝灭：在切片上加入自发荧光淬灭剂，处理5min，超纯水冲洗；

(5)封闭：在切片中滴加BSA，处理30min；

(6)染色：在切片中滴加荧光标记的AusG_Wf，4℃孵育过夜，超纯水冲洗；

(7)显微镜观察采集图像。

进一步的，如果样品为非组织类样品，如凝胶块，则不需要进行(1)-(5)步，可以直接执行(6)-(7)步。具体使用的方法需根据样品类型而定。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种新颖的褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf，其具有对褐藻胶的特异性结合能力；

(2)本发明中的AusG_Wf序列新颖，具有明确的基因序列，制备程序简便，成本低，同时可以大批量获取。

(3)本发明中的AusG_Wf序列明确，能够轻松实现AusG_Wf的荧光标记，利于AusG_Wf 的进一步应用。

(4)本发明还提供了基于AusG_Wf的褐藻胶定性和半定量的方法，具有操作简便、特异性强、成本低及可以实现样品大规模高通量检测的优点；

(5)本发明还提供了基于AusG_Wf的特异性可视化观察褐藻胶的方法，具有特异性强、准确度高的优点。

附图说明

图1：验证AusG_Wf对不同多糖的结合能力；其中，Fv，Mp、An分别表示不同海藻种类。Fv代表：Fucus vesiculosus，Mp代表：Macrocystis pyifera，An代表：Ascophyllumnodosum。

图2：实施例6的检测结果。

图3：实施例7的检测结果。

图4：实施例10的检测结果。

图5：实施例12的检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf在大肠杆菌中克隆表达及获取

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T直至对数末期并提取全基因组DNA，依据所需目的基因设计两对上下游引物(第一对：5’AAGTTGGTGGCCGCTATCAC；5’GGCAAGTAGCATTCACAGATAG)，(第二对：5’GACACGACACCATATGGAAGATTTACCAGAGGCTGG； 5’GACACCTCGAGTTATTCTGGTTTAGCAATAATAGTCAC)。以全基因组为模板进行两轮 PCR，PCR反应条件均为95℃ 3min，95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s，25个循环，最后72℃持续5min，得到了AusG_Wf基因片段。NdeI和XhoI双酶切目的基因与pET28a(+)表达载体，连接构成重组质粒。42℃热激处理将重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中构成重组菌株。利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，离心收集菌体，加入一定量20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(PBS)缓冲液重悬，冰浴超声破碎，离心取上清。

实施例2：褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf在毕赤酵母中克隆表达及获取

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’- AGCTTACGTAGAATTCGAAGATTTACCAGAGGCTGGTTCTAAACC；5’- AATTAATTCGCGGCCGCTTCTGGTTTAGCAATAATAGTCACATCATCTACTCT)，以全基因组为模板如实施例1中的条件进行PCR，得到褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf基因片段。利用EcoRI和NotI双酶切目的基因与pPIC9k质粒，连接构成重组质粒，经Sac I酶切后，转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中构成重组细胞；离心后用10mM pH 8.0N,N-二羟乙基甘氨酸重新悬浮菌体；将菌液涂布到含有氨苄青霉素的YPD平板，30℃倒置培养3-4天，将平板中含有重组质粒的阳性克隆子接种于YPD培养基中，30℃培养20h，然后接种于发酵基本培养基中，加入0.3％甲醇诱导，发酵150h后，离心收集上清，此即为褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf粗蛋白液，用中空纤维超滤膜进行超滤，以去除粗蛋白液中小分子的杂质，并将其浓缩3-5倍。

实施例3:褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf在枯草芽孢杆菌中克隆表达及获取

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物 (5’-CGTAGGATCCTCTAGAGAAGATTTACCAGAGGCTGGTTCTAAACC；5’- TAGGCGGGCTGCCCCGGGTTCTGGTTTAGCAATAATAGTCACATCATCTACTCTTG)，以全基因组为模板按照如实施例1中的条件进行PCR，得到褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf 基因片段。XbaI和SmaI双酶切目的基因与pHT43质粒，连接构成重组质粒，转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，37℃培养90min后，涂布到加有氯霉素抗性的LB平板上。挑取阳性克隆子接种于LB培养基中37℃，培养12h，按3％的接种量接种到基础发酵培养基置于37℃，利用异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达。离心收集菌体，加入一定量的20mM PBS缓冲液悬浮，然后在冰水浴中进行超声破碎，离心收集上清。

实施例4：褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf与绿色荧光蛋白GFP融合(GFP-AusG_Wf)在大肠杆菌中克隆表达及获取

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T直至对数末期并提取全基因组DNA，依据所需目的基因设计上下游引物(5’ GATAAGGATCGATGGGGATCCGAAGATTTACCAGAGGCTGG；5’ GCTCACCATGGTGGCGAATTCTTCTGGTTTAGCAATAATAGTCA)。以全基因组为模板进行PCR，PCR反应条件为：95℃ 3min，95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s，25个循环，最后72℃持续5min，得到了AusG_Wf基因片段。BamHI和EcoRI双酶切目的基因与 pRSET_EmGFP大肠绿色荧光表达载体，连接构成重组质粒。42℃热激处理将重组质粒转入 BL21(DE3)感受态细胞中构成重组菌株。利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，离心收集菌体，加入一定量20mM PBS缓冲液重悬，冰浴超声破碎，离心取上清。

实施例5：褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf与红色荧光蛋白RFP融合(RFP-AusG_Wf)在大肠杆菌中克隆表达及获取

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T直至对数末期并提取全基因组DNA，根据所需目的基因设计上下游引物(5’ TCATGGTATGGCTAGCGAAGATTTACCAGAGGCTGGTTCTAAACC；5’ GCTCACCATCGGATCCGCTTCTGGTTTAGCAATAATAGTCACATCATCT)。以全基因组为模板进行PCR，PCR反应条件为：95℃ 3min，95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s，25个循环，最后72℃持续5min，得到了AusG_Wf基因片段。BamHI和NheI双酶切目的基因与pRSETB_mCherry大肠红色荧光表达载体，连接构成重组质粒。42℃热激处理将重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中构成重组菌株。利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，离心收集菌体，加入一定量20mM PBS缓冲液重悬，冰浴超声破碎，离心取上清。

实施例6：检测一种口服液中是否含有褐藻胶

(1)分别取1μL待测口服液和超纯水至硝酸纤维素膜上，平行三次，室温干燥30min以上；

(2)用含有5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(140mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM 磷酸氢二钠、1.7mM磷酸二氢钾，pH值为7.5)封闭硝酸纤维素膜1h，超纯水适当冲洗；

(3)取2mL褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf均匀滴加至硝酸纤维素膜上，孵育2h，超纯水冲洗；

(4)利用步骤(2)中含有5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液稀释(1：5000)连有辣根过氧化酶的抗组氨酸单克隆抗体，取2mL均匀滴加至硝酸纤维素膜上，孵育2h，超纯水冲洗；

(5)均匀滴加2mL ECL试剂至硝酸纤维素膜上，显色2min；

(6)化学发光仪信号检测。

由图2实验结果可知，该口服液中含有褐藻胶。

实施例7：利用实施例4中的GFP-AusG_Wf检测一种口服液中是否含有褐藻胶

(1)分别取1μL待测口服液和超纯水至硝酸纤维素膜上，室温干燥30min以上；

(2)用含有5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(140mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸氢二钠、1.7mM磷酸二氢钾，pH值为7.5)封闭硝酸纤维素膜1h，超纯水适当冲洗；

(3)取2mL GFP-AusG_Wf均匀滴加至硝酸纤维素膜上，孵育2h，超纯水冲洗；

(4)荧光成像仪下信号检测。

由图3实验结果可知，该口服液中含有褐藻胶，与实施例6中的实验结果相一致。

实施例8：半定量一种口服液中褐藻胶含量

(1)分别配置不同浓度的褐藻胶标准溶液，即1mg/mL、0.2mg/mL、0.04mg/mL、0.008mg/mL，分别吸取1μL上述不同浓度的标准溶液及待测口服液至硝酸纤维素膜上，平行三次，室温干燥30min以上；

(3)取4mL褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf均匀滴加至硝酸纤维素膜上，孵育2h，超纯水冲洗；

(4)利用步骤(2)中含有的5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液稀释(1：5000)连有辣根过氧化酶的抗组氨酸单克隆抗体，取4mL均匀滴加至硝酸纤维素膜上，孵育2h，超纯水冲洗；

(5)均匀滴加4mL ECL试剂于硝酸纤维素膜上，显色2min；

(6)化学发光仪信号检测，利用ImageJ图像处理软件将已知褐藻胶浓度的荧光信号转化为灰度值，最大浓度值(即1mg/mL)设置为1，其它数值均相应的标准化，将待测样品的灰度值带入标准曲线y＝0.247x+0.741，R²＝0.9979。即可实现对样品中褐藻胶的半定量分析。

该口服液中褐藻胶的含量约为0.93mg/mL。

实施例9：利用实施例4中的GFP-AusG_Wf半定量一种口服液中褐藻胶

(1)分别配置不同浓度的褐藻胶标准溶液，即1mg/mL、0.2mg/mL、0.04mg/mL、0.008mg/mL，分别取1μL上述不同浓度的标准溶液及待测口服液至硝酸纤维素膜上，室温干燥30min以上；

(3)吸取4mL GFP-AusG_Wf均匀滴加至硝酸纤维素膜上，孵育2h，超纯水冲洗；

(4)荧光成像仪信号检测，利用ImageJ图像处理软件将已知褐藻胶浓度的荧光信号转化为灰度值，最大浓度值(即1mg/mL)设置为1，其它数值均相应的标准化，将待测样品的灰度值带入标准曲线y＝0.239x+0.748，R²＝0.9983。

该口服液中褐藻胶含量约为0.89mg/mL，与实施例8中的实验结果基本一致。

实施例10：检测一种果冻中是否含有褐藻胶

(1)将1g果冻样品磨碎加热后溶解在1mL超纯水中；

(2)分别吸取1μL待测果冻样品溶液与超纯水至硝酸纤维素膜上，平行三次，室温干燥30min以上；

(3)用含有5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(140mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM 磷酸氢二钠、1.7mM磷酸二氢钾，pH值为7.5)封闭硝酸纤维素膜1h，超纯水适当冲洗；

(4)取2mL褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf均匀滴加于硝酸纤维素膜上，孵育2h，超纯水冲洗；

(5)利用步骤二中含有的5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液稀释(1：5000)连有辣根过氧化酶的抗组氨酸单克隆抗体，吸取2mL均匀滴加至硝酸纤维素膜上，孵育2h，超纯水冲洗；

(6)均匀滴加2mL ECL试剂于硝酸纤维素膜上，显色2min；

(7)化学发光仪信号检测；

由图4实验结果可知，该果冻样品中含有褐藻胶。

实施例11：半定量一种果冻中褐藻胶含量

(1)分别配置不同浓度的褐藻胶标准溶液，即1mg/mL、0.2mg/mL、0.04mg/mL、0.008mg/mL，分别取1μL于硝酸纤维素膜上，平行三次，室温干燥半小时以上；

(2)将1g果冻样品磨碎加热后溶解在1mL超纯水中，吸取1μL待测果冻样品于硝酸纤维素膜上，室温干燥30min以上；

(3)用含有5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(140mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸氢二钠、1.7mM磷酸二氢钾，pH值为7.5)封闭硝酸纤维素膜1h，超纯水适当冲洗；

(4)取4mL褐藻胶特异性结合蛋白AusG_Wf均匀滴加至硝酸纤维素膜上，孵育2h，超纯水冲洗；

(5)利用步骤二中含有的5％脱脂奶粉的PBS缓冲液稀释(1：5000)连有辣根过氧化酶的抗组氨酸单克隆抗体，吸取4mL均匀滴加至硝酸纤维素膜上，孵育2h，超纯水冲洗；

(6)均匀滴加4mL ECL试剂至硝酸纤维素膜上，显色2min；

(7)化学发光仪信号检测，利用ImageJ图像处理软件将已知褐藻胶浓度的荧光信号转化为灰度值，最大浓度值(即1mg/mL)设置为1，其它数值均相应的标准化，将待测样品的灰度值带入标准曲线y＝0.241x+0.759，R²＝0.9991。

1g果冻样品中约含有0.97mg褐藻胶。

实施例12：特异性原位观察海带组织切片中的褐藻胶

(1)将新鲜海带放入万能固定液中浸泡24h。

(2)依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。

(3)组织切片置于盛满EDTA褐藻胶修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中高火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定)

(4)切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

(5)在圈内滴加BSA孵育30min。

(6)轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加与荧光蛋白融合表达的褐藻胶特异性结合蛋白 GFP-AusG_Wf，将切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。

(7)玻片置于PBS(pH值为7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

(8)玻片置于PBS(pH值为7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

(9)切片于显微镜下观察并采集图像。

其中，如图5所示，将荧光成像图进行灰度转换，白色条带处表示海带中褐藻胶所在区域。

最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围中。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种新型褐藻胶特异性结合蛋白及其制备与应用

<140> 1

<141> 2019-11-13

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Asp Leu Pro Glu Ala Gly Ser Lys Pro Asp Asn Thr Pro Pro Ser

1 5 10 15

Ser Ser Phe Ser Ala Glu Glu Gln Ser Gly Asp Tyr Leu Thr Tyr Leu

20 25 30

Phe Thr Asn Thr Ser Asp Ser Ala Thr Asp Tyr Glu Trp Asp Phe Gly

35 40 45

Asp Ala Ala Ser Gly Ala Asp Asn Thr Ser Thr Glu Lys Asp Pro Ser

50 55 60

His Thr Phe Ser Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Val Thr Leu Val Ala Ser

65 70 75 80

Asp Lys Leu Gly Val Glu Ser Thr Phe Ser Ser Thr Val Glu Val Val

85 90 95

Glu Pro Asp Ala Pro Ser Val Phe Val Pro Thr Ile Leu Glu Ala Gly

100 105 110

Phe Glu Asp Gly Gly Leu Ala Gly Gly Thr Gly Asp Gly Arg Asp Ser

115 120 125

Trp Arg Ile Ser Gly Gly Lys Ile Phe Gly Ile Thr Ser Ser Pro Val

130 135 140

Arg Thr Gly Ser Gln Gly Ala Lys Phe Asp Ala Gly Asp Pro Arg Val

145 150 155 160

Ala Tyr Gln Glu Leu Thr Val Thr Pro Asn Ala Asp Tyr Ile Val Ser

165 170 175

Ile Tyr Tyr Thr Met Lys Thr Asp Pro Ala Gly Gly Ala Leu Arg Leu

180 185 190

Ala Val Leu Gly Glu Ala Ile Ser Asn Ala Ser Glu Ala Glu Ala Ala

195 200 205

Ile Ile Ala Ser Val Ser Gly Thr Asp Gln Thr Ser Ala Ser Asp Tyr

210 215 220

Val Gln Met Thr Leu Glu Phe Asn Ser Gly Asn Arg Ser Thr Ile Ala

225 230 235 240

Ile Trp Ile Asp Ser Asn Asn Ile Thr Glu Ala Arg Val Asp Asp Val

245 250 255

Thr Ile Ile Ala Lys Pro Glu

260

<210> 2

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaagatttac cagaggctgg ttctaaacca gataacactc ctccaagtag tagcttttct 60

gcagaagaac aaagtgggga ttatttaacc tatttattta caaacacttc tgatagtgca 120

acggattatg aatgggactt tggtgatgcc gcttcaggag ctgataatac atctactgaa 180

aaagatccat cacatacttt ttctggagaa ggaacttata cagttacttt agttgcttct 240

gataaattag gagtagaaag tacgtttagc agtactgttg aggttgtaga accagatgcg 300

ccaagtgtat ttgtaccaac aattttagaa gctggttttg aagatggtgg tttagcaggt 360

ggtactggtg atggtcgtga ttcttggaga atatctggag gtaaaatatt tggaattact 420

agtagccctg ttcgtacagg ttctcaagga gctaagtttg atgcaggaga tcctcgtgtt 480

gcttatcaag agttaacagt tactccaaat gcagattata tcgtttctat ttattatacc 540

atgaaaacag atcctgctgg aggagcgttg aggttagctg ttttaggaga agctatctct 600

aatgcctctg aagctgaagc agctattatt gcttctgtta gtggtacaga ccaaacaagt 660

gcaagcgatt atgtacaaat gacgttagag tttaactctg gaaatagaag tacaattgct 720

atatggattg atagcaataa tattactgaa gcaagagtag atgatgtgac tattattgct 780

aaaccagaat aa 792

Claims

1.一种褐藻胶特异性结合蛋白，其特征在于：为褐藻胶特异性结合蛋白 AusG_Wf，其氨基酸序列为 SEQ ID NO. 1。

2.编码权利要求 1 中 AusG_Wf 的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQID NO. 2 所示及可翻译出 SEQ ID NO. 1 的所有序列。

3.一种权利要求 1 中所述的 AusG_Wf 的制备方法，其特征在于：基于 AusG_Wf基因序列，通过克隆表达的方法实现 AusG_Wf 的制备，其中表达宿主为大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌中的一种。

4.一种权利要求 1 中所述的 AusG_Wf 与荧光蛋白融合制备的方法，其特征在于：表达载体为 pRSET_EmGFP 大肠绿色荧光表达质粒、pRSETB_mCherry 大肠红色荧光表达质粒中的一种，此时得到与荧光蛋白融合表达的 AusG_Wf。

5.权利要求 1 中所述的 AusG_Wf 在褐藻胶定性、半定量、可视化观察中的应用。

6.一种采用权利要求 1 中所述的 AusG_Wf 对褐藻胶进行定性或半定量检测的方法，其特征在于：基于 AusG_Wf，结合微阵列技术实现褐藻胶的定性或半定量检测。

7.如权利要求 6 所述的对褐藻胶进行定性或半定量检测的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取待测液 1μL 至反应介质上，室温干燥；

（2）用含有封闭剂的缓冲液封闭反应介质；

（3）根据反应介质面积的大小，将一定量 AusG_Wf 滴加至反应介质上，孵育后用水冲洗；

（4）利用步骤（2）中缓冲液稀释对重组表达的 AusG_Wf 具有结合能力的抗体，取一定量滴加至反应介质上，孵育后用水冲洗，根据反应介质面积的大小，滴加一定量显色试剂，显色；

（5）化学发光仪信号检测。

8.如权利要求 6 所述的对褐藻胶进行定性或半定量检测的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取待测液 1μL 至反应介质上，室温干燥；

（2）用含有封闭剂的缓冲液封闭反应介质；

（3）根据反应介质面积的大小，将一定量荧光标记的或与荧光蛋白融合表达的 AusG_Wf 滴加至反应介质上，孵育后用水冲洗；

（4）荧光成像仪信号检测。

9.如权利要求7或8所述的对褐藻胶进行定性或半定量检测的方法，其特征在于：用于定性检测时，步骤（1）中的待测液为待测样品；用于半定量检测时，步骤（1）除待测液外，还需分别取 1μL 具有浓度梯度的褐藻胶标准溶液于反应介质上，信号检测后利用图像处理软件将已知褐藻胶浓度的荧光信号转化为灰度值，以灰度值为纵坐标，褐藻胶浓度值为横坐标建立标准曲线。

10.一种采用权利要求 1 中所述的 AusG_Wf 对褐藻胶进行特异性可视化观察的方法，其特征在于：染色时在样品中滴加荧光标记的 AusG_Wf，然后利用显微镜观察采集图像，实现褐藻胶的特异性可视化观察。