CN110698546A

CN110698546A - 一种猪瘟核酸病毒样颗粒的制备方法及应用

Info

Publication number: CN110698546A
Application number: CN201911105616.4A
Authority: CN
Inventors: 邓俊花; 吴绍强; 林祥梅
Original assignee: China inspection and Quarantine Research Institute
Current assignee: China inspection and Quarantine Research Institute; Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2020-01-17

Abstract

本发明公开了猪瘟核酸病毒样颗粒的制备方法及其应用，属于应用分子生物学领域。本发明以pTrcHis‑MS2为基础载体，通过改造、修饰MS2噬菌体外壳蛋白编码序列，构建了新型的Armored RNA表达载体pTMACC。进一步通过基因克隆将猪瘟核酸检测靶基因连接至pTMACC，然后进行表达、纯化，制备猪瘟核酸假病毒颗粒。利用本发明制备的猪瘟核酸假病毒颗粒，适用于猪瘟核酸国家标准及OIE推荐检测方法，可以在制备用于监控猪瘟疫情的高效阳性参比物质中进行推广应用。

Description

一种猪瘟核酸病毒样颗粒的制备方法及应用

技术领域

本发明属于应用分子生物学领域，具体地，涉及一种猪瘟核酸病毒样颗粒的制备方法及应用。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是一种由经典的猪瘟病毒(CSFV)引起的高度接触性、传染性疾病。该病的高发病率和高死亡率给全球范围内的养猪业造成巨大经济损失，严重危害畜牧业的发展。目前国内猪瘟疫情的主要特点为温和性、散发性、多种病原混合感染、隐性感染和亚病毒感染等，非典型猪瘟病理变化的情况时有发生，这对CSF的临床诊断带来了很大的困难。猪瘟病毒为黄病毒科 (Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员，其核酸类型为RNA。

目前，国内外许多研究者建立了分子生物学诊断方法。但是，在核酸实际检测中，目前由于无生物安全危险的阳性质控物的缺乏，使得猪瘟检测方法很难做到全程监控。

发明内容

为了解决上述技术问题的至少一个，发明人以pTrcHis-MS2为基础载体，通过改造、修饰MS2噬菌体外壳蛋白编码序列，构建了新型的Armored RNA表达载体pTMACC。进一步通过基因克隆将猪瘟核酸检测靶基因N基因连接至 pTMACC，然后进行表达、纯化，制备猪瘟核酸病毒样颗粒。

本发明的第一方面提供了猪瘟核酸病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)以pTrcHis-MS2质粒为模板，分别利用第一引物对和第二引物对进行第一PCR扩增和第二PCR扩增，得到第一PCR扩增产物和第二PCR扩增产物，

利用Xho Ⅰ和Hind Ⅲ对pTrcHis-MS2质粒进行第一双酶切，得到第一酶切产物，

将所述第一PCR扩增产物、所述第二PCR扩增产物和所述第一酶切产物进行第一连接，得到第一重组质粒；

(2)以第一重组质粒为模板，利用第三引物对进行第三PCR扩增，得到第三PCR扩增产物，

利用Nco Ⅰ和PmaC Ⅰ对所述第一重组质粒进行第二双酶切，得到第二酶切产物，

将所述第二酶切产物和所述第三PCR扩增产物进行第二连接得到第二重组质粒；

(3)将野生型MS2噬菌体外壳蛋白基因序列去掉终止子，与来自假病毒载体pTrcMS的含组氨酸蛋白标签的MS2噬菌体外壳蛋白的基因编码序列进行串联，并将串联后的基因与pUC57载体进行第三连接得到第三重组质粒；

(4)利用Xho Ⅰ和Hind Ⅲ分别对所述第二重组质粒和所述第三重组质粒进行第三双酶切和第四双酶切，分别得到第三酶切产物和第四酶切产物，

将所述第三酶切产物和第四酶切产物进行第四连接得到第四重组质粒；

(5)提取猪瘟RNA，并以RNA为模板，利用第四引物对进行第四PCR扩增，得到第四PCR扩增产物；

将所述第四PCR扩增产物与pGM T easy vector进行第五连接得到第五重组质粒；

(6)利用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ分别对所述第四重组质粒和所述第五重组质粒进行第五双酶切和第六双酶切，分别得到第五酶切产物和第六酶切产物，

将所述第五酶切产物和所述第六酶切产物进行第六连接得到第六重组质粒，即为猪瘟核酸病毒样颗粒的表达载体，

其中：

所述第一引物对包括具有SEQ ID No.l所示核苷酸序列的上游引物和具有 SEQID No.2所示核苷酸序列的下游引物，

所述第二引物对包括具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物和具有 SEQID No.4所示核苷酸序列的下游引物，

所述第三引物对包括具有SEQ ID No.7所示核苷酸序列的上游引物和具有 SEQID No.8所示核苷酸序列的下游引物，

所述第四引物对包括具有SEQ ID No.9所示核苷酸序列的上游引物和具有 SEQID No.10所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明中，所述病毒样颗粒又称假病毒(pseudovirus)颗粒，是指类似于真病毒的病毒颗粒。

在本发明的一些实施方案中，所述第一PCR扩增和所述第二PCR扩增可以分别进行，也可以在同一个反应体系里进行。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第一PCR扩增和/或第二PCR扩增的体系为：

STAR Buffer(Mg²⁺plus)10μL，

STAR HS DNA Polymerase 1.3U，dNTPMixture(各2.5mmol/L)4μL，第一引物对和/或第二引物对上、下游引物(10pmol/μL)各1μL，pTrcHis-MS2 DNA 10ng，补ddH₂O至 50μL。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第一PCR扩增和/或第二PCR扩增的程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第一双酶切的体系为：Xho Ⅰ/Hind Ⅲ10U，10×M buffer 5μL，模板1μg，补水至50μL。

在本发明中，所述第一PCR扩增、所述第二PCR扩增和所述第一双酶切的顺序没有任何限定，同时可以分开进行，也可以同时进行。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第一连接的体系为：所述第一PCR 扩增产物200ng，所述第二PCR扩增产物200ng，所述第一酶切产物100ng， 5×In-Fusion HDEnzyme Premix 2μL，补水至10μL。所述第一连接的程序为：50 ℃反应15min。

在本发明的一些具体实施方案中，进一步包括利用克隆——PCR扩增的方法对所述第一重组质粒进行鉴定的步骤：取第一重组质粒2.5μL热转化至E.coli Competent CellJM109，37℃过夜培养，挑取阳性菌落利用第五引物对进行第四 PCR扩增，其中，所述第五引物对包括具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.6所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第三PCR扩增的体系为：

STARBuffer(Mg²⁺plus)10μL，

STAR HS DNA Polymerase 1.3U，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4μL，第三引物对上、下游引物(10pmol/μL) 各1μL，pTrcHis-MS2 DNA 10ng，补ddH₂O至50μL。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第三PCR扩增的程序为：98℃变性 10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第二双酶切和所述第三双酶切的体系为：Nco Ⅰ和PmaC Ⅰ 10U，10×M buffer 5μL，模板1μg，补水至50μL。

在本发明中，所述第二双酶切和所述第三双酶切的顺序没有任何限定，可以分开进行，也可以同时进行。

在本发明中，所述猪瘟病毒是指猪瘟活疫苗(兔源)国家参考品。在本发明的一些实施中，所述猪瘟活疫苗，源自法国Thiverval株，菌种保藏编号S0521207，购自中国兽医药品监察所。

在本发明的一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：

(2)将所述第六重组质粒转化进大肠杆菌，鉴定正确后得到重组菌体；

(3)利用IPTG诱导表达所述重组菌体，进行离心收集菌体，加入细胞裂解液破碎细胞，采用His标签纯化蛋白方式进行收集上清，所述上清即为含有猪瘟核酸病毒样颗粒的溶液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述诱导的程序为：28℃诱导表达16h。

在本发明的一些具体实施方案中，所述离心是指将诱导表达后的培养液5000rpm，离心10min。

本发明第二方面提供一种猪瘟核酸病毒样颗粒，所述猪瘟核酸病毒样颗粒是利用本发明第一方面所述的方法制备得到的。

本发明第三方面提供本发明第三方面所述的猪瘟核酸病毒样颗粒在制备用于检测猪瘟病的阳性参比物质的用途。

本发明第四方面提供利用本发明第三方面所述的猪瘟核酸病毒样颗粒制备的用于检测猪瘟病的阳性参比物质。

在本发明中，所述检测检测猪瘟病是指利用分子生物学的方法检测。

本发明的有益效果

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)本发明以pTrcHis-MS2为基础载体，通过改造、修饰MS2噬菌体外壳蛋白编码序列，构建了新型的Armored RNA表达载体pTMACC。pTMACC载体中第2个MS2噬菌体外壳蛋白的第15和16氨基酸之间插入6His组氨酸蛋白纯化标签，不会改变噬菌体MS2外壳蛋白的整体构象，并且此位点外露，易于病毒样颗粒的纯化流程。

(2)利用Amored RNA技术制备的RNA假病毒颗粒稳定、易保存、安全性高，能模拟天然病毒特性，与临床样本保持一致，可作为核酸提取、扩增和扩增后分析等各个环节的质控，确保结果的真实可靠，可有效克服传统RNA物质存在的缺陷。

(3)利用本发明制备的高纯度猪瘟核酸病毒样颗粒，将为口岸监控猪瘟疫情提供高效的阳性参比物质，同时为假病毒制备技术的推广和应用提供借鉴。

附图说明

图1示出了噬菌体MS2外壳蛋白对应的基因编码序列改造模式。

图2示出了噬菌体MS2中外壳蛋白改造的蛋白三维构象模型对比分析。A：野生型噬菌体MS2中外壳蛋白三维构象模型；B：噬菌体MS2中外壳蛋白改造后蛋白三维构象模型。

图3示出了靶基因PCR产物电泳图。M：DL2000bp；1：PCR产物；2：空白对照。

图4示出了pTMACC-CSFV病毒样颗粒简并序列溯源性分析结果。

图5示出了pTMACC-CSFV病毒样颗粒透射电镜结果。

图6示出了pTMACC-CSFV病毒样颗粒动态光散射图谱。

图7示出了pTMACC-CSFV病毒样颗粒SDS-PAGE电泳分析结果。M：蛋白分子质量标准；1：pTMACC-CSFV病毒样颗粒。

图8示出了pTMACC-CSFV病毒样颗粒核酸电泳分析结果。M：1kb DNA Ladder；1：pTMACC-CSFV病毒样颗粒(加热前)；2：pTMACC-CSFV病毒样颗粒(加热后)。

图9示出了CSFV病毒样颗粒核酸扩增检测结果。A：利用国标GB/T 27540-2011进行检测的结果；B：利用OIE陆生动物卫生手册(2014)chapter 2.8.3 中1.1.4推荐方法进行检测的结果。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中，猪瘟活疫苗，源自法国Thiverval株，菌种保藏编号S0521207，购自中国兽医药品监察所。

下述实施例中，用到的主要试剂包括但不限于：

STAR HS DNAPolymerase(TaKaRa)；Xho Ⅰ、HindⅢ及kpn Ⅰ(TaKaRa)；HD Cloning Kit(Clontech)；E.coli Competent Cell JM109(北京全式金生物技术有限公司)； IPTG固体粉末(TaKaRa)；MagneHis^TM protein purification system试剂盒 (promega)；RNeasyMiNi Kit(Qiagen)One-Step qRT-PCR Kit(TaKaRa)。

下述实施例中，用到的仪器设备包括但不限于：核酸蛋白测定仪(美国 Thermo，NanoDrop-1000)；Roche lighter 480 Ⅱ荧光PCR仪(Roche)。

实施例1 pTMACC载体构建

1.pTM制备

以质粒pTrcHis-MS2为模板，分别以A-F/R、B-F/R为引物对，用

STAR HSDNA Polymerase分别进行PCR扩增，PCR扩增的体系为：

STAR Buffer(Mg²⁺plus)10μL，

STAR HS DNA Polymerase 1.3U，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4μL，第一引物对和/或第二引物对上、下游引物(10pmol/μL)各1μL，pTrcHis-MS2DNA 10ng，补ddH₂O至50μL；所述第一PCR扩增和/或第二PCR扩增的程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃ 延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物命名为PCR产物A、B。

pTrcHis-MS2质粒采用Xho Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，体系为：Xho Ⅰ/Hind Ⅲ 10U，10×M buffer 5μL，模板1μg，补水至50μL。分别将酶切产物进行胶回收纯化，命名为pTrcHis-MS2(X/H)。

使用

HD Cloning Kit(Clontech Code No.639648)，将PCR产物 A、B和pTrcHis-MS2(X/H)连接，反应体系及条件如下：PCR产物A/B各200ng， pTrcHis-MS2(X/H)100ng，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，加ddH₂O至 10μL。50℃反应15min。取上述In-Fusion产物2.5μL热转化至E.coli Competent Cell JM109，37℃过夜培养，挑取阳性菌落进行测序鉴定，将测序正确的质粒命名为pTM。

其中，A、B扩增引物为：

A-F(SEQ ID No.1)：

5'-GAGGAATAAACCATGCGAGCTTTTAGTACCCTTG-3'

A-R(SEQ ID No.2)：

5'-TGGGTGATCCTCATGTTTGAATGGCCGGCGTC-3'

B-F(SEQ ID No.3)：

5'-GCCATTCAAACATGAGGATCACCCATGTCGAAG-3'

B-R(SEQ ID No.4)：

5'-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3'

鉴定用引物为：

Primer-U1(SEQ ID No.5)：

5'-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3'

Primer-L1(SEQ ID No.6)：

5'-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3'

2.pTMA制备

以质粒pTM为模板，以Primer1-F/R为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物I，回收纯化扩增产物；pTM质粒用NcoI和PmaCI双酶切，然后利用In-Fusion技术将PCR产物I与酶切后的pTM质粒连接，转化受体菌，经筛选、鉴定，得到质粒 pTMA。

其中，PCR扩增引物为：

Primer1-F(SEQ ID No.7)：

5'-GAGGAATAAACCATGCGAGCTTTTAGTACCCTTG-3'

Primer1-R(SEQ ID No.8)：

5'-CCACCTGCCGGCCACGTGTTTTGATC-3'

体系为：

STAR Buffer(Mg²⁺plus)10μL，STAR HS DNAPolymerase 1.3U，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4μL，上、下游引物(10pmol/μL) 各1μL，pTrcHis-MS2DNA 10ng，补ddH₂O至50μL。

程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸 10min。

3.pTMACC的制备

M串联基因构造见图1。具体地，将野生型MS2噬菌体外壳蛋白基因序列去掉终止子，与来自假病毒载体pTrcMS的含组氨酸蛋白标签的MS2噬菌体外壳蛋白的基因编码序列进行串联。

采用蛋白三维模拟器(SWISS-model)分别对噬菌体MS2中串联外壳蛋白 (CP)结构与野生型MS2噬菌体中CP结构图进行建模(如图2A和2B)。通过对比得出，pTMACC载体中第2个MS2噬菌体外壳蛋白的第15和16氨基酸之间插入6His组氨酸蛋白纯化标签，不会改变噬菌体MS2外壳蛋白的整体构象，并且此位点外露，易于病毒样颗粒的纯化流程。

M基因序列由华大基因生物有限公司合成，合成的M基因连入pUC57载体，重组质粒为pUC57-2CP。pUC57-2CP和pTMA质粒分别采用Xho Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，将酶切产物进行胶回收纯化，采用DNA连接试剂盒(Takara,Code No.6022) 连接，转化受体菌，经筛选、鉴定，将测序正确的质粒命名为pTMACC。

实施例2猪瘟核酸病毒样颗粒的制备

1.猪瘟靶基因的获取

猪瘟活疫苗采用RNA提取试剂盒提取核酸，以RNA为模板，采用CSFV-F/R 引物进行PCR扩增。

其中，PCR扩增引物序列为：

CSFV-F(SEQ ID No.9)：

5'-CGGGGTACCTACGAGGTTAGTTCATTCTC-3'

CSFV-R(SEQ ID No.10)：

5'-CCCAAGCTTGTAGGTTCTTCAGTGTTG-3'

琼脂糖电泳显示目的条带在500bp至750bp之间，与预期大小(568bp)相符(如图3所示)。

PCR产物回收、纯化，连入pGEM T easy vector，获取重组质粒pGEM-CSFV。

2猪瘟核酸病毒样颗粒的制备及表达

将重组质粒pGEM-CSFV与载体pTMACC质粒分别采用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ 双酶切后，产物参照DNA Ligation Kit操作说明进行载体连接。连接产物经转化、摇菌及PCR鉴定后，挑选阳性克隆测序,正确菌株命名pTMACC-CSFV。 pTMACC-CSFV重组菌复苏培养至OD值大约在0.6后，加入终浓度为0.5mmol/L 的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在28℃条件下，200r/min诱导表达。收集表达产物，采用加入细胞裂解液FastBreakTM Cell LysisReagent(10×)破碎细胞，离心收集上清，采用MagneHisTM protein purificationsystem系统纯化后即为CSFV病毒样颗粒溶液。

3.溯源性分析

取10株pTMACC-CSFV阳性克隆，进行表达、纯化，获得的10株病毒样颗粒物质，分别提取RNA、RT-PCR后进行测序。测序结果进行在线BLAST分析。

比对显示，该病毒样颗粒含有的CSFV核酸序列溯源至法国Thiverval株，二者同源性达99％(如图4所示)。

实施例3猪瘟核酸病毒样颗粒的特性鉴定

1.形态学鉴定

实施例2制备的CSFV病毒样颗粒经1％醋酸双氧铀染色、自然干燥，利用透射电镜(JEM1400)进行形态观察；同时，病毒样颗粒溶液借助动态光散射仪，测定其粒子径的大小。

纯化的病毒样颗粒溶液，经1％醋酸双氧铀染色后，透射电镜观察(如图5 所示)：颗粒为“外亮内暗”规则的多边形物质，直径大约为26nm。该溶液经动态光散射图谱分析(如图6所示)：溶液均匀，颗粒内径约为26nm，与透射电镜数据一致。

2.病毒样颗粒物质核酸电泳以及蛋白电泳分析

实施例2制备的CSFV病毒样颗粒SDS-PAGE电泳分析，以验证该物质为蛋白产物；同时，CSFV病毒样颗粒经过80℃，加热5min，观察溶液变化，并采用琼脂糖电泳分析，以验证该物质含有核酸。

纯化的病毒样颗粒溶液进行SDS-PAGE电泳分析(如图7所示)，显示目的蛋白位于42ku与26ku之间，约是野生型MS2噬菌体外壳蛋白分子量(13.7ku) 大小的2倍，且仅有一条目的条带存在；该溶液经过80℃热处理后，溶液肉眼观察由透明状变成淡乳白色。

琼脂糖电泳结果显示(如图8所示)：加热后溶液电泳条带呈弥散性直至消失，源自该病毒样颗粒为RNA-蛋白复合体，热处理后蛋白外壳变性，包裹核酸被释放，这进一步表明此物质中包裹核酸类型为RNA，而非DNA。

3.实用性能检测

CSFV病毒样颗粒采用病毒RNA柱式提取试剂盒说明书提取总RNA，参照 TaKaRaOne Step RNA PCR Kit(AMV)(TaKaRa,Japan)操作说明，以提取的 RNA为模板进行RT-PCR扩增，参照方法为《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 27540-2011)、OIE陆生动物卫生手册(2014)chapter 2.8.3中1.1.4 部分推荐荧光RT-PCR方法(Hoffmann等方法)，以验证该物质可以应用于猪瘟疫病监测。

扩增结果如图9所述。可以看出，两种鉴定技术均呈S扩增曲线，依据判定标准，均为核酸阳性。这表明该病毒样颗粒可以作为猪瘟疫病核酸检测的质控品。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种猪瘟核酸病毒样颗粒的制备方法及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaggaataaa ccatgcgagc ttttagtacc cttg 34

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgggtgatcc tcatgtttga atggccggcg tc 32

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccattcaaa catgaggatc acccatgtcg aag 33

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttcgggccc aagcttcgaa ttccc 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacaattaat catccggctc g 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatcttcgtt tagggcaagg tag 23

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaggaataaa ccatgcgagc ttttagtacc cttg 34

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccacctgccg gccacgtgtt ttgatc 26

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggggtacct acgaggttag ttcattctc 29

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccaagcttg taggttcttc agtgttg 27

Claims

1.一种猪瘟核酸病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用XhoⅠ和HindⅢ对pTrcHis-MS2质粒进行第一双酶切，得到第一酶切产物，

利用NcoⅠ和PmaCⅠ对所述第一重组质粒进行第二双酶切，得到第二酶切产物，

(4)利用XhoⅠ和HindⅢ分别对所述第二重组质粒和所述第三重组质粒进行第三双酶切和第四双酶切，分别得到第三酶切产物和第四酶切产物，

(6)利用KpnⅠ和HindⅢ分别对所述第四重组质粒和所述第五重组质粒进行第五双酶切和第六双酶切，分别得到第五酶切产物和第六酶切产物，

将所述第五酶切产物和所述第六酶切产物进行第六连接得到第六重组质粒，

其中：

所述第一引物对包括具有SEQ ID No.l所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNo.2所示核苷酸序列的下游引物，

所述第二引物对包括具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNo.4所示核苷酸序列的下游引物，

所述第三引物对包括具有SEQ ID No.7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNo.8所示核苷酸序列的下游引物，

所述第四引物对包括具有SEQ ID No.10所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNo.11所示核苷酸序列的下游引物。

2.根据权利要求所述的方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：

(1)将所述第六重质粒转化进大肠杆菌，鉴定正确后得到重组菌体；

(2)利用IPTG诱导表达所述重组菌体，进行离心收集菌体，加入细胞裂解液破碎细胞，采用His标签纯化蛋白方式进行收集上清，所述上清即为含有猪瘟核酸病毒样颗粒的溶液。

3.一种猪瘟核酸病毒样颗粒，其特征在于，所述猪瘟核酸病毒样颗粒是利用权利要求1或2所述的方法制备得到的。

4.权利要求3所述的猪瘟核酸病毒样颗粒在制备用于检测猪瘟病的阳性参比物质的用途。

5.利用权利要求3所述的猪瘟核酸病毒样颗粒制备的用于检测猪瘟病的阳性参比物质。