CN108342511A - 检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及其应用 - Google Patents

检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及其应用，属于生物检测技术领域。本发明提供了根据多种鱼类细胞肿大虹彩病毒基因序列的高度保守区域设计的引物组，该引物组具有特异性强、灵敏度高等特点，在此基础上，将上述引物组制备成检测细胞肿大虹彩病毒的试剂盒，并使用LAMP法检测鱼细胞肿大虹彩病毒具有操作简单、反应迅速、反应结果可视化的特点。

Description

检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及其应用。
背景技术
虹彩病毒主要感染无脊椎动物和低级脊椎动物；属于大型20面体状、细胞质型DNA病毒。虹彩病毒(Iridovirudae)分为5个属，即虹彩病毒属(Iridovirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)、蛙病毒属(Ranavirus)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)和细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)。其中，细胞肿大病毒属虹彩病毒是鱼类重要病毒性病原之一。近年来，由细胞肿大虹彩病毒引起的鱼类疾病呈明显上升趋势，患病鱼的死亡率高，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。
目前，国内外针对虹彩病毒的检测方法已进行了相关的研究，但是很多方法耗时长、成本高、对仪器要求高、灵敏度不够、特异性不高等问题；亟需建立一种快速高效、灵敏度高、特异性强的检测该病毒的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及检测细胞肿大虹彩病毒的试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
检测细胞肿大虹彩病毒的引物组，是根据SEQ ID No:1所示核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。
在上述方案的基础上，所述检测细胞肿大虹彩病毒的引物组，核酸序列为：
F3：5’-GTTCCTGGTACAGCAAGCT-3’；
B3：5’-ACCGACACCTCCTCAACT-3’；
FIP：5’-CCACCCCTTGCCACAGTCACTCAAAACAGACTGGCCATGC-3’；
BIP：5’-GTGGCTGCGTGTTAAGATCCCCCACACCAGCGAATGTAGCT-3’；
LB：5’-CATCACGTCCAGCAAGGAGAA-3’。
在上述方案的基础上，所述检测细胞肿大虹彩病毒的引物组，核酸序列为：
F3：5’-GCATTGCCTACTGTGTCTCT-3’；
B3：5’-TACAGCGTAGGTGCCCATC-3’；
FIP：5’-GCTGATGAGCAGGTCCTCCCCCGTACAATGAGGTGCGC-3’；
BIP：5’-AGGCCGACATGGCCATATCGGACACGTTGGTCAGTGCG-3’；
LB：5’-CTGGCTAACATTGGCAATGTAGC-3’。
在上述方案的基础上，所述检测细胞肿大虹彩病毒的引物组，核酸序列为：
F3：5’-AAGGTGAATCTGCCTTTGCT-3’；
B3：5’-TCGAGCCCATAGGGTTGAT-3’；
FIP：5’-TCCCATCTGGTGGAGCCGAGACCAATCCCCTGTCCGAG-3’；
BIP：5’-CGACCCCTACTACTTTGCGCCTGCCCATGTCCAGCGTAT-3’；
LF：5’-TGTTCTCGTAAATGAGCGACAC-3’；
LB：5’-GCATGTCTGAGATGGATGGTGTT-3’。
上述引物组在鱼类细胞肿大虹彩病毒检测中的应用。
在上述方案的基础上，所述鱼类为：鳜鱼、条石鲷、石斑鱼、真鲷、海鲈。
在上述方案的基础上，用于制备检测鱼类细胞肿大虹彩病毒的试剂盒或检测试剂。
一种含有上述引物组的鱼类细胞肿大虹彩病毒检测试剂盒，所述试剂盒为DNA试剂盒。
一种鱼类细胞肿大虹彩病毒的DNA检测试剂盒，包含上述的至少一组引物组，还包含反应缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
在上述方案的基础上，所述的阳性对照为含有SEQ ID No:1所示核酸序列的T克隆载体。
使用上述试剂盒检测鱼类细胞肿大虹彩病毒的方法，使用LAMP法检测，反应温度为：64℃，反应时间为60min。
本发明的有益效果：
本发明应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermamplification，LAMP)，根据细胞肿大虹彩病毒基因中的一段序列SEQ ID No:1，采用PrimerExploer V4软件设计3套LAMP特异性引物组合，分别记为MCP-1、MCP-2和MCP-3，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和环引物(LF和/或LB)。通过筛选，最终确定将MCP-2和MCP-3用于检测细胞肿大虹彩病毒，并对其特异性和灵敏度进行验证，结果显示，MCP-2和MCP-3对水、NNV病毒核酸、IHHNV病毒核酸、柠檬酸杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、虾核酸和鱼核酸均无非特异性扩增，MCP-2最低检测含量为50fg～5fg，MCP-3最低检测含量为500ag～50ag。
本发明的SEQ ID No:1序列是根据鳜鱼、条石鲷、石斑鱼、真鲷、海鲈的细胞肿大虹彩病毒基因比对而得，以该序列为模板设计的引物可以用于检测多种鱼类的细胞肿大虹彩病毒，而且，本发明的引物组用于检测细胞肿大虹彩病毒的灵敏度高于传统PCR方法。
本发明应用LAMP法可以从分子水平上直接、快速、准确的检测细胞肿大虹彩病毒，并具有如下优点：1、操作简单：在恒温热水浴即可完成操作，不需要对模板进行热变性处理，节省了因温度循环而消耗的时间，对仪器依赖性小；2、反应迅速：在25～33min即可完成反应；3、特异性强：本发明的引物对水、NNV病毒核酸、IHHNV病毒核酸、柠檬酸杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、虾核酸和鱼核酸均无非特异性扩增；4、鉴定方便：反应中从dNTPs中解离出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，产生副产物焦磷酸镁沉淀，用肉眼即可观察到反应结果，借助浊度仪可获得精确的结果；此外，在反应体系中添加钙黄绿素，有核酸扩增的反应产物在紫外光下可观察到黄绿色荧光；5、灵敏度高：本发明MCP-2最低检测含量为50fg～5fg，MCP-3最低检测含量为500ag～50ag。6、本发明试剂盒中的阳性对照为含有SEQ ID No:1序列的阳性质粒，稳定性好，浓度高，能够对检测的样品起到定性定量分析的作用。
附图说明
图1MCP-1引物初步筛选结果；
图2MCP-2引物初步筛选结果；
图3MCP-3引物初步筛选结果；
图4引物初步验证-1结果(其中BlockA中的1～4是MCP-1引物在不添加FD的情况下分别以阳性对照1、阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果，BlockA中的5～8是MCP-2引物在不添加FD的情况下分别以阳性对照1、阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果；Block B中的1～4是MCP-3引物在不添加FD的情况下分别以阳性对照1、阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果；Block C中的1～4是MCP-1引物在添加FD的情况下分别以阳性对照1、阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果，Block C中的5～8是MCP-2引物在添加FD的情况下分别以阳性对照1、阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果；Block D中的1～4是MCP-3引物在添加FD的情况下分别以阳性对照1、阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果)；
图5引物初步验证-2结果(其中BlockA中的1～3是MCP-1引物在不添加FD的情况下分别以阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果，BlockA中的4～6是MCP-2引物在不添加FD的情况下分别以阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果；BlockA中的7～8和Block B中的1是MCP-3引物在不添加FD的情况下分别以阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果；Block C中的1～3是MCP-1引物在添加FD的情况下分别以阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果，Block C中的4～6是MCP-2引物在添加FD的情况下分别以阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果；Block C中的7～8和Block D中的1是MCP-3引物在添加FD的情况下分别以阳性对照2、阴性对照和水为模板的扩增结果)；
图6MCP-2引物的特异性试验结果；
图7紫外光下MCP-2引特异性试验结果(1是阳性对照，2是水，3是NNV病毒核酸，4是IHHNV病毒核酸，5是柠檬酸杆菌，6是绿脓杆菌，7是沙门氏菌，8是金黄色葡萄球菌，9是虾核酸，10是鱼核酸)；
图8MCP-3引物的特异性试验结果；
图9紫外光下MCP-3引特异性试验结果(1是阳性对照，2是水，3是NNV病毒核酸，4是IHHNV病毒核酸，5是柠檬酸杆菌，6是绿脓杆菌，7是沙门氏菌，8是金黄色葡萄球菌，9是虾核酸，10是鱼核酸)；
图10MCP-2引物组灵敏性试验结果；
图11紫外光下MCP-2引物组灵敏性试验结果(1是2.5ng/μL，2是250pg/μL，3是25pg/μL，4是2.5pg/μL，5是250fg/μL，6是25fg/μL，7是2.5fg/μL，8是250ag/μL，9是25ag/μL，10是2.5ag/μL，11是水；250ag/μL曲线稍微出峰，即有颜色变化)；
图12MCP-3引物组灵敏性试验结果；
图13紫外光下MCP-3引物组灵敏性试验结果(1是250pg/μL，2是25pg/μL，3是2.5pg/μL，4是250fg/μL，5是25fg/μL，6是2.5fg/μL，7是250ag/μL，8是25ag/μL，9是2.5ag/μL，10是0.25ag/μL，11是水)；
具体实施方式
本发明中的试样可以采用分离自感染实验等中所用的细胞和其培养液或者来自活体的标本和培养细胞等含病毒的样本，也可以来自于被怀疑感染细胞肿大虹彩病毒生物的活体样本，这些试样可以进行分离、抽提、浓缩、纯化等预处理。
LAMP法即环介导等温核酸扩增技术，该方法是通过使自身的3’末端退火到作为模版的核苷酸上而作为互补链合成的起点的同时，组合退火到这时形成的环上的引物，可以实现恒温下的互补链合成反应的核酸扩增法。此外，LAMP法是至少使用识别6个区域的4个引物的特异性高的核酸扩增法。
LAMP反应后的核酸扩增产物的检测可以使用公知的技术，例如，可以将反应产物直接进行琼脂糖凝胶电泳而容易的进行检测，通过琼脂糖凝胶电泳，LAMP扩增产物因碱基的长度不同而呈现阶梯状。此外，LAMP法中，由于核酸的合成，底物被大量消耗，作为副产物的焦磷酸离子与共存的镁离子反应而生成焦磷酸镁，反应液白浊至肉眼也可确认的程度。因此，可以进行光学观察或使用浊度仪进行检测。本发明在反应体系中加入钙黄绿素，有核酸扩增的反应产物在黑暗条件下可观察到黄绿色荧光；从而使反应结果更加直观。
使用本发明的引物进行核酸扩增检测时所需的各种试剂可以事先组合而试剂盒化，具体来说，作为本发明的引物或环引物所需的各种寡聚核酸、作为核酸合成底物的4种dNTP、进行核酸合成的DNA聚合酶、具有反转录活性的酶、提供适合于酶反应的条件的缓冲液和盐类、阳性对照核酸、使酶和模板稳定化的保护试剂以及根据需要采用的反应生成物的检测所需的试剂以试剂盒的形式提供。
实施例1
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
1、引物的设计与合成
根据多条鱼类细胞肿大虹彩病毒基因序列，序列号分别为KC775381.1、AY532608.1AY285746.1、AB263097.1、AB178942.1，通过https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/网站比对，获得高度保守序列，其序列如SEQ ID No:1所示，将其作为本发明引物设计序列区。
根据序列SEQ ID No:1采用PrimerExplorer V4软件设计LAMP引物，选取内引物FIP/BIP的Tm值在65度左右，外引物F3/B3的温度为60度左右，FIP/BIP的5′端dataG值小于等于-4kcal/mol，F3/B3的3′端dataG值小于等于-4kcal/mol，GC含量在40％-60％之间，引物扩增片段在200bp左右的引物作为初筛引物，并分别记为MCP-1、MCP-2和MCP-3，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和一条或两条环引物(LF和/或LB)。其核苷酸序列分别如下：
MCP-1
F3：5’-GTTCCTGGTACAGCAAGCT-3’(SEQ ID No:2)；
B3：5’-ACCGACACCTCCTCAACT-3’(SEQ ID No:3)；
FIP：5’-CCACCCCTTGCCACAGTCACTCAAAACAGACTGGCCATGC-3’(SEQ ID No:4)；
BIP：5’-GTGGCTGCGTGTTAAGATCCCCCACACCAGCGAATGTAGCT-3’(SEQ ID No:5)；
LB：5’-CATCACGTCCAGCAAGGAGAA-3’(SEQ ID No:6)。
MCP-2
F3：5’-GCATTGCCTACTGTGTCTCT-3’(SEQ ID No:7)；
B3：5’-TACAGCGTAGGTGCCCATC-3’(SEQ ID No:8)；
FIP：5’-GCTGATGAGCAGGTCCTCCCCCGTACAATGAGGTGCGC-3’(SEQ ID No:9)；
BIP：5’-AGGCCGACATGGCCATATCGGACACGTTGGTCAGTGCG-3’(SEQ ID No:10)；
LB：5’-CTGGCTAACATTGGCAATGTAGC-3’(SEQ ID No:11)。
MCP-3
F3：5’-AAGGTGAATCTGCCTTTGCT-3’(SEQ ID No:12)；
B3：5’-TCGAGCCCATAGGGTTGAT-3’(SEQ ID No:13)；
FIP：5’-TCCCATCTGGTGGAGCCGAGACCAATCCCCTGTCCGAG-3’(SEQ ID No:14)；
BIP：5’-CGACCCCTACTACTTTGCGCCTGCCCATGTCCAGCGTAT-3’(SEQ ID No:15)；
LF：5’-TGTTCTCGTAAATGAGCGACAC-3’(SEQ ID No:16)；
LB：5’-GCATGTCTGAGATGGATGGTGTT-3’(SEQ ID No:17)。
将上述引物序列交由上海生工生物工程有限公司合成。
2、细胞肿大病毒阳性质粒的构建
将SEQ ID No:1所示核酸序列构建到克隆载体pMD18-T中，转化、筛选获得阳性质粒。
3、引物的初步筛选
将MCP-1、MCP-2和MCP-3引物组合分别以制备的细胞肿大虹彩病毒的阳性质粒和水为模板，在64℃下进行LAMP反应60分钟，其中，各引物的用量分别为FIP、BIP 40pmol，F3、B35pmol，环引物20pmol；反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
试验结果如图1～3所示：
由图1可知：MCP-1LAMP引物能够在16分钟左右将细胞肿大虹彩病毒的核酸扩增出来，对照组水在50分钟左右出现非特异性扩增，待后续继续验证。
由图2可知：MCP-2LAMP引物能够在23分钟左右将细胞肿大虹彩病毒的核酸扩增出来，对照组水60分钟未出现非特异性扩增，所以含有环引物的MCP-2引物初步能够使用，待后续继续验证。
由图3可知：MCP-3LAMP引物能够在11分钟左右将细胞肿大虹彩病毒的核酸扩增出来，对照组水60分钟未出现非特异性扩增，所以含有环引物的MCP-3引物初步能够使用，待后续继续验证。
4、引物初步验证-1
MCP-1、MCP-2、MCP-3分别以阳性对照1、阳性对照2、阴性对照(此处的阳性对照1是采用传统的PCR方法检测为阳性的鱼核酸；阳性对照2为本发明构建的含有SEQ ID No:1所述核酸序列的阳性质粒；阴性对照为采用传统的PCR方法检测为阴性的细胞肿大虹彩病毒含量低的鱼核酸)和水为模板，在添加FD和不添加FD的条件下，进行扩增。扩增结果如图4所示。
由图4可知：
MCP-1引物能够检测出阳性1和阳性2，但是阴性对照在30分钟左右检测出，水对照在五十多分钟出峰(未加FD)；MCP-1加FD的体系只能检测出阳性1和阳性2，阴性对照和水对照都未被检出，后续再验证下，进行取舍。
MCP-2引物能够检测出阳性1和阳性2，阴性对照和水对照六十分钟内未出峰(未加FD)；MCP-2加FD的体系只能检测出阳性1和阳性2，阴性对照在59分钟左右略有起峰，水对照未被检出，后续再验证下。
MCP-3引物能够检测出阳性1和2号阳性，阴性对照在25分钟左右出峰，水对照未出现扩增；MCP-3加FD的体系亦能检测出阳性1和阳性2，阴性对照在30分钟左右有起峰，水对照未出现扩增，后续再验证下。
5、引物初步验证-2
MCP-1、MCP-2、MCP-3分别以阳性对照2、阴性对照(阳性对照2为本发明构建的含有SEQ ID No:1所述核酸序列的阳性质粒；阴性对照为采用传统的PCR方法检测为阴性的细胞肿大虹彩病毒含量低的鱼核酸)和水为模板，在添加FD和不添加FD的条件下，进行扩增。扩增结果如图5所示。
由图5可知：
MCP-1引物仍然能够检测出阳性2，但是阴性对照加FD和未加FD的体系都能将其检测出，水对照未出现扩增。由于其在验证1中水也出现扩增，总体不太稳定，使用时需进行样本验证。
MCP-2引物能够检测出阳性2，阴性对照和水对照加FD和未加FD体系六十分钟内均未出峰，结果与前一致，较稳定。进行后续特异性和灵敏度实验。
MCP-3引物能够检测出阳性2，阴性对照加FD和未加FD体系仍然被检测出，水对照未出现扩增，与前一致，结果较稳定。进行后续特异性和灵敏度实验。
6、特异性试验
6.1MCP-2特异性试验
采用MCP-2引物组，在添加和不添加FD的条件下(添加FD的为在反应体系中加入1.0μL的钙黄绿素)，分别以阳性对照(本发明构建的含有SEQ ID No:1所述核酸序列的阳性质粒)、水、NNV病毒核酸、IHHNV病毒核酸、柠檬酸杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、虾核酸和鱼核酸为模板，在64℃下进行LAMP反应60分钟，其中，各引物的用量分别为FIP、BIP40pmol，F3、B35pmol；所述鱼核酸为斜带石斑鱼的总RNA；所述虾核酸为南美白对虾总RNA。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
试验结果如图6和图7所示：未加FD和加入FD的MCP-2引物对阳性核酸2能够有效检测出，而对NNV、IHHNV、柠檬酸杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、虾核酸、鱼核酸和水等都未检测出，特异性良好。
6.2MCP-3特异性试验
采用MCP-3引物组，在添加和不添加FD的条件下(添加FD的为在反应体系中加入1.0μL的钙黄绿素)，分别以提取的阳性对照(本发明构建的含有SEQ ID No:1所述核酸序列的阳性质粒)、水、NNV病毒核酸、IHHNV病毒核酸、柠檬酸杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、虾核酸和鱼核酸为模板，在64℃下进行LAMP反应60分钟，其中，各引物的用量分别为FIP、BIP 40pmol，F3、B35pmol；所述鱼核酸为斜带石斑鱼的总RNA；所述虾核酸为南美白对虾总RNA。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
试验结果如图8和图9所示：未加FD和加入FD的MCP-3引物对阳性核酸2能够有效检测出，而对NNV、IHHNV、柠檬酸杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、虾核酸、鱼核酸和水等都未检测出，特异性良好。
此外由本发明验证试验-1可知，采用传统的PCR方法检测为阴性的细胞肿大虹彩病毒含量低的鱼核酸，本发明的引物组也能将其扩增出来，这说明本发明引物组的灵敏度高。而且，将不含有细胞肿大虹彩病毒的鱼核酸作为模板，进行特异性试验结果发现：未出现非特异性扩增；这说明验证试验-1中的结果并非是本发明引物组的非特异性扩增而得，试验结果可靠。
7、灵敏度检测
7.1MCP-2的灵敏度检测
将上述合成的质粒(5μg)加入200μL水，使其浓度为25ng/μL；用双蒸水将其进行10倍递进稀释，使其浓度依次为2.5ng/μL、250pg/μL、25pg/μL、2.5pg/μL、250fg/μL、25fg/μL、2.5fg/μL、250ag/μL、25ag/μL、2.5ag/μL、0.25ag/μL等，用作灵敏度试验。
采用MCP-2引物组，分别以2.5ng/μL、250pg/μL、25pg/μL、2.5pg/μL、250fg/μL、25fg/μL、2.5fg/μL、250ag/μL、25ag/μL、2.5ag/μL浓度的阳性质粒为模板，25μL体系中加入模板2μL，在LAMP实时浊度仪上64℃反应60分钟。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图10和图11所示：病毒阳性质粒含量在5ng～50fg均能检测到扩增，阴性对照未见扩增，可见MCP-2引物组的最低检测限为50fg～5fg，约560～5600copies/μL。
7.2MCP-3的灵敏度检测
采用MCP-3引物组，分别以2.5ng/μL、250pg/μL、25pg/μL、2.5pg/μL、250fg/μL、25fg/μL、2.5fg/μL、250ag/μL、25ag/μL、2.5ag/μL、0.25ag/μL浓度的阳性质粒为模板，25μL体系中加入模板2μL，在LAMP实时浊度仪上64℃反应60分钟。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图12和图13所示：病毒阳性质粒含量在500pg～500ag均能检测到扩增，阴性对照未见扩增，可见MCP-3引物组的最低检测限为500ag～50ag，约5.6～56copies/μL。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）
<120> 检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及其应用
<130> 2018
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1362
<212> DNA
<213> Iridovirudae(Iridovirudae)
<400> 1
atgtctgcaa tctcaggtgc gaacgtaacc agtgggttca tcgacatctc cgcgtttgat 60
gcgatggaga cccacttgta tggcggcgac aatgccgtga cctactttgc ccgtgagacc 120
gtgcgtagtt cctggtacag caagctgccc gtcaccctat caaaacagac tggccatgct 180
aatttcggcc aggagtttag tgtgactgtg gcaaggggtg gcgactacct cattaatgtg 240
tggctgcgtg ttaagatccc ctccatcacg tccagcaagg agaacagcta cattcgctgg 300
tgtgataatt tgatgcacaa tctagttgag gaggtgtcgg tgtcatttaa cgacctggtg 360
gcacagaccc tgaccagcga gttccttgac ttttggaacg cctgcatgat gcctggcagc 420
aaacaatctg gctacaacaa gatgattggc atgcgcagcg acctggtggg cggtatcacc 480
aacggtcaga ctatgcccgc cgcctacctt aatttgccca ttcccctgtt ctttacccgt 540
gacacaggcc ttgcattgcc tactgtgtct ctgccgtaca atgaggtgcg catccacttc 600
aagctgcggc gctgggagga cctgctcatc agccagagca cccaggccga catggccata 660
tcgactgtca ccctggctaa cattggcaat gtagcacccg cactgaccaa cgtgtccgtg 720
atgggcacct acgctgtact gacaagtgag gagcgtgagg ttgtggccca gtctagccgt 780
agcatgctca ttgagcagtg tcaggtggcg cctcgtgtgc ctgtcacacc cgtagacaat 840
tccttggtgc atctcgacct gaggttcagt caccctgtga aggccttgtt ctttgcagtc 900
aagaatgtca ctcaccgcaa cgtgcaaagc aattacaccg cggccagtcc cgtgtatgtc 960
aacaacaagg tgaatctgcc tttgctggcc accaatcccc tgtccgaggt gtcgctcatt 1020
tacgagaaca cccctcggct ccaccagatg ggagtagact acttcacatc tgtcgacccc 1080
tactactttg cgcccagcat gtctgagatg gatggtgtta tgacctactg ttatacgctg 1140
gacatgggca atatcaaccc tatgggctcg accaactacg gccgcctgtc caacgtcacc 1200
ctgtcatgta aggtgtcgga caatgccaag accaccgcgg cgggcggtgg aggcaacggc 1260
accggctaca cggtcgccca aaagtttgaa ctggtcgtta ttgcagtcaa ccacaacatc 1320
atgaagattg ctgacggcgc tgcaggcttc cctatcctgt aa 1362
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 2
gttcctggta cagcaagct 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 3
accgacacct cctcaact 18
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 4
ccaccccttg ccacagtcac tcaaaacaga ctggccatgc 40
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 5
gtggctgcgt gttaagatcc cccacaccag cgaatgtagc t 41
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 6
catcacgtcc agcaaggaga a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 7
gcattgccta ctgtgtctct 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 8
tacagcgtag gtgcccatc 19
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 9
gctgatgagc aggtcctccc ccgtacaatg aggtgcgc 38
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 10
aggccgacat ggccatatcg gacacgttgg tcagtgcg 38
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 11
ctggctaaca ttggcaatgt agc 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 12
aaggtgaatc tgcctttgct 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 13
tcgagcccat agggttgat 19
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 14
tcccatctgg tggagccgag accaatcccc tgtccgag 38
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 15
cgacccctac tactttgcgc ctgcccatgt ccagcgtat 39
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 16
tgttctcgta aatgagcgac ac 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Iridovirudae)
<400> 17
gcatgtctga gatggatggt gtt 23

Claims (10)

1.检测细胞肿大虹彩病毒的引物组，其特征在于：根据SEQ ID No:1所示核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。
2.根据权利要求1所述检测细胞肿大虹彩病毒的引物组，其特征在于：核酸序列为：
F3：5’-GTTCCTGGTACAGCAAGCT-3’；
B3：5’-ACCGACACCTCCTCAACT-3’；
FIP：5’-CCACCCCTTGCCACAGTCACTCAAAACAGACTGGCCATGC-3’；
BIP：5’-GTGGCTGCGTGTTAAGATCCCCCACACCAGCGAATGTAGCT-3’；
LB：5’-CATCACGTCCAGCAAGGAGAA-3’。
3.根据权利要求1所述检测细胞肿大虹彩病毒的引物组，其特征在于：核酸序列为：
F3：5’-GCATTGCCTACTGTGTCTCT-3’；
B3：5’-TACAGCGTAGGTGCCCATC-3’；
FIP：5’-GCTGATGAGCAGGTCCTCCCCCGTACAATGAGGTGCGC-3’；
BIP：5’-AGGCCGACATGGCCATATCGGACACGTTGGTCAGTGCG-3’；
LB：5’-CTGGCTAACATTGGCAATGTAGC-3’。
4.根据权利要求1所述检测细胞肿大虹彩病毒的引物组，其特征在于：核酸序列为：
F3：5’-AAGGTGAATCTGCCTTTGCT-3’；
B3：5’-TCGAGCCCATAGGGTTGAT-3’；
FIP：5’-TCCCATCTGGTGGAGCCGAGACCAATCCCCTGTCCGAG-3’；
BIP：5’-CGACCCCTACTACTTTGCGCCTGCCCATGTCCAGCGTAT-3’；
LF：5’-TGTTCTCGTAAATGAGCGACAC-3’；
LB：5’-GCATGTCTGAGATGGATGGTGTT-3’。
5.权利要求1～4任一项所述引物组在鱼类细胞肿大虹彩病毒检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述鱼类为：鳜鱼、条石鲷、石斑鱼、真鲷、海鲈。
7.一种含有权利要求1～4任一项所述引物组的鱼类细胞肿大虹彩病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为DNA试剂盒。
8.一种鱼类细胞肿大虹彩病毒的DNA检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1～4任一项所述的至少一组引物组，还包含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
9.根据权利要求8所述鱼类细胞肿大虹彩病毒的DNA检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为含有SEQ ID No:1所示核酸序列的T克隆载体。
10.使用权利要求8或9所述试剂盒检测鱼类细胞肿大虹彩病毒的方法，其特征在于：使用LAMP法检测，反应温度为：64℃，反应时间为60min。
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