CN112011647A - 一种lamp法检测水产病原用内参质控引物组及其应用 - Google Patents

一种lamp法检测水产病原用内参质控引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种LAMP法检测水产病原用内参质控引物组及其应用，属于水产病原检测试剂开发技术领域。本发明LAMP法检测水产病原用内参质控引物组根据SEQ ID No:1所示核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。本发明的内参质控引物组可用于鱼类、虾类、蟹类、参类等多种水产动物病原的检测，为多种水产动物病原检测体系的构建奠定基础。

Description

一种LAMP法检测水产病原用内参质控引物组及其应用
技术领域
本发明属于水产病原检测试剂开发技术领域，具体涉及一种LAMP法检测水产病原用内参质控引物组及其应用。
背景技术
我国是世界上重要的水产品生产和出口大国之一，水产养殖业是农业经济的主要支柱产业。近年来，随着水产养殖业的发展，养殖规模的不断扩大，水产养殖病害的发生日益频繁，危害越来越严重，是制约整个水产养殖业发展的最重要的因素之一。据不完全统计，2002-2009年，我国水产养殖病害平均年损失达百亿元之巨，其中鱼类约占55％～77％，甲壳类约占11％～28％，贝类约占3％～16％。因此，做好水产病害的预防工作是现代水产养殖业中的重中之重。
水产病原的快速诊断，对水产养殖的良种选育，疾病预防、进出口检疫、水产品食品安全等方面具有重大意义。目前常用的水产病害的检测技术主要包括：目检、镜检、病原的分离鉴定、聚合酶链式反应、核酸杂交、限制性酶切、基因芯片、酶联免疫检测技术、免疫荧光技术；这些检测方法均存在依赖精密仪器、检测成本高、灵敏性和特异性差，操作程序繁琐，难以推广等缺点；而且常规的病原检测技术大都不适合养殖基层的现场快速检测。
LAMP技术是一种新的DNA扩增方法，该技术依赖于自动循环的链置换反应，在等温条件下，不到1h就能扩增出109靶序列拷贝，具有特异、灵敏、快速、简便等特点，在水产病原检测上有较为广泛的应用前景。
由于LAMP反应易受检测试剂(例如反应酶失活)、扩增模板的核酸提取质量(例如提取的核酸被严重降解或因操作失误未将核酸提取出来)等因素的影响，因此，设置LAMP反应检测的内参质控显得尤为重要；目前，关于内参质控的报道多见于人类疾病检测，而关于水产病原检测的内参质控鲜有报道。而且现有的内参质控引物组多数只针对于同一种生物，适用于多种生物的内参质控引物组的报道较少。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种LAMP法检测水产病原用内参质控引物组及其应用，本发明的内参质控引物组可用于鱼类、虾类、蟹类、参类等多种水产动物病原的检测，为多种水产动物病原检测体系的构建奠定基础。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
SEQ ID No:1所示核酸序列在设计LAMP法检测水产病原用内参质控引物组中的应用。
一种LAMP法检测水产病原用内参质控引物组，根据SEQ ID No:1所示核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。
在上述方案的基础上，所述LAMP法检测水产病原用内参质控引物组的序列为：
F3：5’-CGGGGAATCAGGGTTCGA-3’；
B3：5’-GTGGAGCTGGAATTACCGC-3’；
FIP：5’-TTCGTCACTACCTCCCCGTGCCTGAGAAACGGCTACCACAT-3’；
BIP：5’-CGAACGGGGCCTCGCAATTGACTTGCCCTCCACTCGA-3’；
LF：5’-CGGGAGTGGGTAATTTGCGC-3’；
LB：5’-ACACTTTAAATCCTTGTACGAGGA-3’；
或
F3：5’-TTCTTAGACCGTCGCATGAC-3’；
B3：5’-CCCCCGGAACTCAAAGACT-3’；
FIP：5’-CGGTATCTGATCGCCTTCGAACCGACCTACTGCGAAAGCATCT-3’；
BIP：5’-ATGCTGACTAGCGATCCGCCTTGGTTTCCCGGAAGCTAC-3’；
LF：5’-TCGTTCTTGATCAATGAAAACATCC-3’；
LB：5’-GCAGTTATTCCCATGACCCG-3’；
或
F3：5’-GCCGGCACGTTTACTTTGA-3’；
B3：5’-TCGTCATGCGACGGTCTA-3’；
FIP：5’-ACCGAGGTCCTGTTCCATCATTCAGAGCAGGCTGGTTTTTGC-3’；
BIP：5’-TTGTCGGTTTTTCGGAACCCGATCTAGCGTCGCAGTACGAAT-3’；
LF：5’-CACGACCATTCGGGCTGTA-3’；
LB：5’-TTAATAGAAGCAGACGGGGGC-3’；
或
F3：5’-TCGATTGTAGGTTAAACGCCT-3’；
B3：5’-CTCCACTCGATCCTCGTACA-3’；
FIP：5’-CCTTCCTTAGATGTGGTAGCCGTTGGTAACGGGGAATCAGGGT-3’；
BIP：5’-GCACGGGGAGGTAGTGACGATCATTCCAATTGCGAGGCC-3’；
LF：5’-GGCTCCCTCTCCGGAAT-3’；
LB：5’-TGTTGCGAGCCCCGAAC-3’。
上述引物组在制备水产动物病害检测试剂中的应用。
在上述方案的基础上，所述的水产动物为鱼类、虾类、蟹类、参类中的至少一种。
在上述方案的基础上，所述的水产动物为克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、双斑东方鲀、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、糙海参、花刺参、仿刺参中的至少一种。
一种LAMP法检测水产动物病害的试剂盒，所述试剂盒包含上述的至少一组内参质控引物组。
本发明技术方案的优点
本发明的内参质控引物组能够将对虾基因组DNA中的18S核糖体RNA的基因序列扩增出；本发明内参质控引物组的设计能够避免在试剂盒使用过程中因核酸提取失败或检测试剂失效对检测结果的影响；在实际检测过程中，当内参质控引物组未出现扩增时，即指示检测结果无效，无论病原微生物的检测引物组是否出现扩增。
本发明的内参质控引物组可用于鱼类、虾类、蟹类、参类等多种水产动物病原的检测，为多种水产动物病原检测体系的构建奠定基础。
附图说明
图1不加FD时引物组NCZK-1的初步扩增结果；
图2不加FD时引物组NCZK-2的初步扩增结果；
图3不加FD时引物组NCZK-3的初步扩增结果；
图4不加FD时引物组NCZK-4的初步扩增结果；
图5添加FD时引物组NCZK-1的全标本扩增结果；
图6自然光下添加FD时引物组NCZK-1的全标本扩增结果；
图7紫外光下添加FD时引物组NCZK-1的全标本扩增结果；
图8添加FD时引物组NCZK-2的全标本扩增结果；
图9自然光下添加FD时引物组NCZK-2的全标本扩增结果；
图10紫外光下添加FD时引物组NCZK-2的全标本扩增结果；
图11添加FD时引物组NCZK-3的全标本扩增结果；
图12自然光下添加FD时引物组NCZK-3的全标本扩增结果；
图13紫外光下添加FD时引物组NCZK-3的全标本扩增结果；
图14添加FD时引物组NCZK-4的全标本扩增结果；
图15自然光下添加FD时引物组NCZK-4的全标本扩增结果；
图16紫外光下添加FD时引物组NCZK-4的全标本扩增结果；
图17添加FD时引物组NCZK-3、NCZK-4特殊标本扩增结果；
图18添加FD时引物组NCZK-3部分标本二次扩增结果；
图19添加FD时引物组NCZK-4部分标本二次扩增结果；
图20本发明内参质控引物组的检测效果验证。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
采用虾类、蟹类、鱼类和参类等多个物种的18S核糖体RNA的基因序列与SEQ IDNo:1所示的凡纳滨对虾18S核糖体RNA基因序列进行多重比对；当采用的比对序列较多时，则无法获得具有高度保守区域的序列；因此，经筛选最终采用Macrobrachium rosenbergii18S(GQ131934)、Penaeus indicus 18S(MH400902)、Penaeus semisulcatus 18S(DQ079766)、Procambarus clarkii 18S(AF436001)、Scylla paramamosain 18S(KC902763)与SEQ ID No:1所示序列进行多重比对；筛选获得SEQ ID No:1所示序列的高度保守区域；根据保守区域采用PrimerExplorer V4软件设计内参质控LAMP引物组；本发明共设计了四组引物分别记为NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和两条环引物(LF和LB)。
本发明所设计的内参质控引物组序列如下：
Figure BDA0002686023840000041
本发明的上述引物组序列均是由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例2四套内参质控引物组的扩增分析
模板准备：分别提取克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、双斑东方鲀、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、糙海参、花刺参、仿刺参等11个物种的基因组DNA，用于NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4四套引物组的扩增分析。
1、将NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4引物组合分别以克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、凡纳滨对虾的基因组DNA为模板，并且以水作为阴性对照，在63℃下进行LAMP反应60分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
Figure BDA0002686023840000051
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
反应结果如图1-4和表1所示，NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3三套引物，在未加FD的情况下能将选定澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼和凡纳滨对虾检测出，而克氏原螯虾未检测出，水对照正常。NCZK-4引物未加FD情况下能将克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼和凡纳滨对虾都检测出，水对照正常。
表1各引物组扩增时间
Figure BDA0002686023840000052
注：“——”表示未出现扩增；“\”表示未进行试验；上述时间是以各引物开始反应起峰时间为准。
2、采用NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4引物组合分别以克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、双斑东方鲀、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、糙海参、花刺参、仿刺参的基因组DNA为模板，并且以水作为阴性对照，在添加FD的条件下，63℃下进行LAMP反应70分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
Figure BDA0002686023840000061
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
结果如图5-16所示：
其中，图6、7，图9、10，图12、13，图15、16，从左到右各管内的模板分别为：克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、双斑东方鲀、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、糙海参、花刺参、仿刺参、水。
加入FD的引物组NCZK-1，只能检测出凡纳滨对虾，其余十种都未出现扩增；加入FD的引物组NCZK-2，可以检测出澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、双斑东方鲀、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、糙海参等，对克氏原螯虾、花刺参、仿刺参等未见扩增；加入FD的引物组NCZK-3，未检出克氏原螯虾和双斑东方鲀，其余都检测出，阴性对照水扩增正常；加入FD的引物组NCZK-4，未检出糙海参，克氏原螯虾55分钟左右开始出峰，阴性对照水扩增正常。
表2各引物组扩增时间
Figure BDA0002686023840000062
Figure BDA0002686023840000071
注：“——”表示未出现扩增；上述时间是以各引物开始反应起峰时间为准。
3、采用NCZK-3、NCZK-4引物组合，进一步验证2中未扩增出的模板；其中NCZK-3组以克氏原螯虾、双斑东方鲀、仿刺参的基因组DNA为模板，NCZK-4组以克氏原螯虾、糙海参、花刺参的基因组DNA为模板，两者均以水作为阴性对照，在添加FD的条件下，63℃下进行LAMP反应70分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。反应体系同2。
结果如图17所示：
本次试验将反应时间延长至70分钟，结果显示两组引物的阴性对照水均未出现扩增；表明阴性对照正常，试验结果可信；
加入FD的引物NCZK-3，仍未检出克氏原螯虾和双斑东方鲀；加入FD的引物NCZK-4，仍未检出糙海参，但克氏原螯虾52分钟左右被检测出。
表3各组引物扩增时间
Figure BDA0002686023840000072
注：“——”表示未出现扩增；“\”表示未进行试验；上述时间是以各引物开始反应起峰时间为准。
4、采用NCZK-3、NCZK-4引物组合，分别以澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、仿刺参基因组DNA为模板，并且以水作为阴性对照，在63℃下进行LAMP反应70分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。反应体系同2。
结果如图19所示：
加入FD的引物NCZK-3，未检出斜带石斑鱼，其余都检测出。水对照正常。
加入FD的引物NCZK-4，都检测出。水对照正常。
表4各引物组扩增时间
Figure BDA0002686023840000073
Figure BDA0002686023840000081
注：“——”表示未出现扩增；上述时间是以各引物开始反应起峰时间为准。
综上，当用于检测凡纳滨对虾时，NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4引物组合均适合；当用于检测克氏原螯虾时，只有NCZK-4引物组合合适；对于澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼；除NCZK-1外，NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4引物组合均适合；针对于双斑东方鲀只有NCZK-2、NCZK-4引物组合适；针对于糙海参只有NCZK-2、NCZK-3合适，其中，NCZK-2扩增时间较长，以NCZK-3效果较好；针对于花刺参和仿刺参NCZK-3、NCZK-4引物组较为合适。
实施例3
一种LAMP法检测对虾常见病原微生物的试剂盒，包括：内参质控引物组和IHHNV病毒引物组、白斑综合症病毒引物组、肝肠胞虫引物组、对虾虹彩病毒引物组、对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌引物组中的至少一组；还包含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)和显色染料；其中，显色染料为钙黄绿素、HNB、酚红试剂中的任意一种。
所述IHHNV病毒引物组序列为：
F3：5’-AACCCTCCACCAGACAAGA-3’ SEQ ID No:26
B3：5’-TGTAGACATCTGTGTGGGTCT-3’ SEQ ID No:27
FIP：5’-CGGCGCACATGGTTGTCTATGATCACCAGCGACGACTTCCT-3’ SEQ ID No:28
BIP：5’-TTCAACAAGAGCAAGCCCAAGGACTTGATCCTTCGGCGTGTT-3’ SEQ ID No:29
LF：5’-CTTTTCGTATTCTTGGAAGAGTCCT-3’ SEQ ID No:30
LB：5’-GGAGGGATCCACATAATGAAGACG-3’ SEQ ID No:31
所述白斑综合症病毒引物组序列为：
F3：5’-CCTCATCTCAGAAGCCATGAA-3’ SEQ ID No:32
B3：5’-GGTAGAGGATACGGCAGCT-3’ SEQ ID No:33
FIP：5’-GGCGCATGAGGCGAATGGTACACACACTAATTTCCGGCAAG-3’ SEQ ID No:34
BIP：5’-CGGCCCTCTCGCCTTTGATCACCTTGTTCGGCGTTCT-3’ SEQ ID No:35
LB：5’-GTCAAAGGGAGATACATTCGAAGA-3’ SEQ ID No:36
所述肝肠胞虫引物组序列为：
F3：5’-TGAGTAGAAGGGTCGAGTGTA-3’ SEQ ID No:37
B3：5’-ACCATGCTCCCTATCCGT-3’ SEQ ID No:38
FIP：5’-AGTTGGAATTACCGCGGCTGCACCTTGACGTGAAGCAATTGG-3’ SEQ ID No:39
BIP：5’-TGCAGTTAAAGGGTCCGTAGTCGTCCGCTACTCTCAACAAACTC-3’ SEQ ID No:40
LF：5’-TGGCACCAAAACTTGCCCT-3’ SEQ ID No:41
所述对虾虹彩病毒引物组序列为：
F3：5’-CCCCAACATTGAAATCAGAG-3’ SEQ ID No:42
B3：5’-TTTGCCTTTTTACCCGTAAT-3’ SEQ ID No:43
FIP:5’-CCTGTCCAAAATAGAATGACCTTGTATTATTTTCTAGATCAGGCCAGT-3’ SEQ ID No:44
BIP:5’-AGAGGGAAATAACGGGAAAACGGGAGATGTGTTGAATTTAATTGCA-3’ SEQ ID No:45
LF：5’-TGTGATTTCCACCAACGAATACA-3’ SEQ ID No:46
LB：5’-CGTTATTTGAGAAAATGTTGGGAA-3’ SEQ ID No:47
所述对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌引物组序列为：
F3：5’-TGATAATGCATTCTATCATCAGC-3’ SEQ ID No:48
B3：5’-ATTTGAAAGACCAAATGAAACC-3’ SEQ ID No:49
FIP：5’-GTGAGCACCTTCTTAGTGGTAATAGTTGTAATTAACAATGGCGCTAG-3’ SEQ ID No:50
BIP:5’-TGACGGAATTTAACCCTAACAATGCGCTTTGAAAGCATAGTTAGGATC-3’ SEQ ID No:51
取一排八联排管，依次标记各管为1-8，各个管中的引物、模板如下所示：
标号 引物组 模板
1 IHHNV 虾核酸+IHHNV阳性质粒
2 WSSV 虾核酸+WSSV阳性质粒
3 EHP 虾核酸+EHP阳性质粒
4 SHIV 虾核酸+SHIV阳性质粒
5 AHPND 虾核酸+AHPND阳性质粒
6 NCZK-3 虾核酸
7 NCZK-3 不加模板
8 NCZK-3 虾核酸
其中采用的虾核酸为提取的凡纳滨对虾的基因组DNA，所述IHHNV阳性质粒、WSSV阳性质粒、EHP阳性质粒、SHIV阳性质粒、AHPND阳性质粒分别为专利申请201711252452.9、201810770090.0、201911107097.5、202010883027.5和202010882807.8中所记载的阳性质粒；上述各管除8号管不添加Bst DNA聚合酶外，各管中依次加入反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)和显色染料；所述显色染料为酚红试剂；反应体系中各组分的添加量和浓度参照实施例2反应体系。
将上述八联排管置于63℃，恒温反应60分钟；观察反应后各管溶液变化，判断反应结果，如图20所示：1-6号管均观察到颜色变化，表明出现扩增；而7和8号管未发生颜色变化，未出现扩增情况。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）
<120> 一种LAMP法检测水产病原用内参质控引物组及其应用
<160> 51
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 854
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)
<400> 2
tgccttatca gctatcgatt gtaggttaaa cgcctacaat ggctatcacg ggtaacgggg 60
aatcagggtt cgattccgga gagggagcct gagaaacggc taccacatct aaggaaggca 120
gcaggcgcgc aaattaccca ctcccggcac ggggaggtag tgacgaaaaa tactgttgcg 180
agccccgaac ggggcctcgc aattggaatg agtacacttt aaatccttgt acgaggatcg 240
agtggagggc aagtctggtg ccagccgccg cggtaattcc agctccacta gcgtatatta 300
aagttgttgc ggttgaaacg ctcgtagttt gacttctgct ccggaccggc ggtccgcctt 360
agcggcggct actgccgggt tccgagctgt gtccccgccg gcgcacatgg ggtttttatg 420
cccttaaccg ggtgtcccct tgtggccggc acgtttactt tgaaaaaatt agagtgctca 480
gagcaggctg gtttttgctt acagcccgaa tggtcgtgca tggaatgatg gaacaggacc 540
tcggttctat tttgtcggtt tttcggaacc cgaggtaatg attaatagaa gcagacgggg 600
gcattcgtac tgcgacgcta gaggtgaaat tcttagaccg tcgcatgacg acctactgcg 660
aaagcatctg ccaaggatgt tttcattgat caagaacgaa agttagaggt tcgaaggcga 720
tcagataccg ccctagttct aaccttaaac gatgctgact agcgatccgc cgcagttatt 780
cccatgaccc ggcgggtagc ttccgggaaa ccaaagtctt tgagttccgg gggaagtatg 840
gttgcaaacc tgaa 854
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 2
cggggaatca gggttcga 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 3
gtggagctgg aattaccgc 19
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 4
ttcgtcacta cctccccgtg cctgagaaac ggctaccaca t 41
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 5
cgaacggggc ctcgcaattg acttgccctc cactcga 37
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 6
cgggagtggg taatttgcgc 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 7
acactttaaa tccttgtacg agga 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 8
ttcttagacc gtcgcatgac 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 9
cccccggaac tcaaagact 19
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 10
cggtatctga tcgccttcga accgacctac tgcgaaagca tct 43
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 11
atgctgacta gcgatccgcc ttggtttccc ggaagctac 39
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 12
tcgttcttga tcaatgaaaa catcc 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 13
gcagttattc ccatgacccg 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 14
gccggcacgt ttactttga 19
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 15
tcgtcatgcg acggtcta 18
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 16
accgaggtcc tgttccatca ttcagagcag gctggttttt gc 42
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 17
ttgtcggttt ttcggaaccc gatctagcgt cgcagtacga at 42
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 18
cacgaccatt cgggctgta 19
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 19
ttaatagaag cagacggggg c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 20
tcgattgtag gttaaacgcc t 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 21
ctccactcga tcctcgtaca 20
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 22
ccttccttag atgtggtagc cgttggtaac ggggaatcag ggt 43
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 23
gcacggggag gtagtgacga tcattccaat tgcgaggcc 39
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 24
ggctccctct ccggaat 17
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 25
tgttgcgagc cccgaac 17
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)
<400> 26
aaccctccac cagacaaga 19
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)
<400> 27
tgtagacatc tgtgtgggtc t 21
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)
<400> 28
cggcgcacat ggttgtctat gatcaccagc gacgacttcc t 41
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)
<400> 29
ttcaacaaga gcaagcccaa ggacttgatc cttcggcgtg tt 42
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)
<400> 30
cttttcgtat tcttggaaga gtcct 25
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)
<400> 31
ggagggatcc acataatgaa gacg 24
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 32
cctcatctca gaagccatga a 21
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 33
ggtagaggat acggcagct 19
<210> 34
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 34
ggcgcatgag gcgaatggta cacacactaa tttccggcaa g 41
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 35
cggccctctc gcctttgatc accttgttcg gcgttct 37
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 36
gtcaaaggga gatacattcg aaga 24
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 37
tgagtagaag ggtcgagtgt a 21
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 38
accatgctcc ctatccgt 18
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 39
agttggaatt accgcggctg caccttgacg tgaagcaatt gg 42
<210> 40
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 40
tgcagttaaa gggtccgtag tcgtccgcta ctctcaacaa actc 44
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 41
tggcaccaaa acttgccct 19
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 42
ccccaacatt gaaatcagag 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 43
tttgcctttt tacccgtaat 20
<210> 44
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 44
cctgtccaaa atagaatgac cttgtattat tttctagatc aggccagt 48
<210> 45
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 45
agagggaaat aacgggaaaa cgggagatgt gttgaattta attgca 46
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 46
tgtgatttcc accaacgaat aca 23
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 47
cgttatttga gaaaatgttg ggaa 24
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 48
tgataatgca ttctatcatc agc 23
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 49
atttgaaaga ccaaatgaaa cc 22
<210> 50
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 50
gtgagcacct tcttagtggt aatagttgta attaacaatg gcgctag 47
<210> 51
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 51
tgacggaatt taaccctaac aatgcgcttt gaaagcatag ttaggatc 48

Claims (7)

1.SEQ ID No:1所示核酸序列在设计LAMP法检测水产病原用内参质控引物组中的应用。
2.一种LAMP法检测水产病原用内参质控引物组，其特征在于，根据SEQ ID No:1所示核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。
3.根据权利要求2所述LAMP法检测水产病原用内参质控引物组，其特征在于，所述引物组的序列为：
F3：5’-CGGGGAATCAGGGTTCGA-3’；
B3：5’-GTGGAGCTGGAATTACCGC-3’；
FIP：5’-TTCGTCACTACCTCCCCGTGCCTGAGAAACGGCTACCACAT-3’；
BIP：5’-CGAACGGGGCCTCGCAATTGACTTGCCCTCCACTCGA-3’；
LF：5’-CGGGAGTGGGTAATTTGCGC-3’；
LB：5’-ACACTTTAAATCCTTGTACGAGGA-3’；
或
F3：5’-TTCTTAGACCGTCGCATGAC-3’；
B3：5’-CCCCCGGAACTCAAAGACT-3’；
FIP：5’-CGGTATCTGATCGCCTTCGAACCGACCTACTGCGAAAGCATCT-3’；
BIP：5’-ATGCTGACTAGCGATCCGCCTTGGTTTCCCGGAAGCTAC-3’；
LF：5’-TCGTTCTTGATCAATGAAAACATCC-3’；
LB：5’-GCAGTTATTCCCATGACCCG-3’；
或
F3：5’-GCCGGCACGTTTACTTTGA-3’；
B3：5’-TCGTCATGCGACGGTCTA-3’；
FIP：5’-ACCGAGGTCCTGTTCCATCATTCAGAGCAGGCTGGTTTTTGC-3’；
BIP：5’-TTGTCGGTTTTTCGGAACCCGATCTAGCGTCGCAGTACGAAT-3’；
LF：5’-CACGACCATTCGGGCTGTA-3’；
LB：5’-TTAATAGAAGCAGACGGGGGC-3’；
或
F3：5’-TCGATTGTAGGTTAAACGCCT-3’；
B3：5’-CTCCACTCGATCCTCGTACA-3’；
FIP：5’-CCTTCCTTAGATGTGGTAGCCGTTGGTAACGGGGAATCAGGGT-3’；
BIP：5’-GCACGGGGAGGTAGTGACGATCATTCCAATTGCGAGGCC-3’；
LF：5’-GGCTCCCTCTCCGGAAT-3’；
LB：5’-TGTTGCGAGCCCCGAAC-3’。
4.权利要求3所述引物组在制备水产动物病害检测试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的水产动物为鱼类、虾类、蟹类、参类中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的水产动物为克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、双斑东方鲀、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、糙海参、花刺参、仿刺参中的至少一种。
7.一种LAMP法检测水产动物病害的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2或3所述的至少一组内参质控引物组。
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