CN114369683B - 马来西亚大虾病毒的检测试剂盒 - Google Patents

马来西亚大虾病毒的检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114369683B
CN114369683B CN202111089485.2A CN202111089485A CN114369683B CN 114369683 B CN114369683 B CN 114369683B CN 202111089485 A CN202111089485 A CN 202111089485A CN 114369683 B CN114369683 B CN 114369683B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mrpv
primer
seq
virus
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111089485.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114369683A (zh
Inventor
何建国
缪琪瑾
翁少萍
周丹丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen University filed Critical Sun Yat Sen University
Priority to CN202111089485.2A priority Critical patent/CN114369683B/zh
Publication of CN114369683A publication Critical patent/CN114369683A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114369683B publication Critical patent/CN114369683B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种马来西亚大虾病毒的检测试剂盒。本发明以马来西亚大虾病毒MrPV‑4基因组中第313～1029位的核苷酸序列为靶基因，设计开发了相应的检测试剂盒，并建立了巢氏和qPCR检测方法。本发明所建立的巢氏PCR方法的灵敏度高、重复性和特异性好，最低检出限为10copies/μL；所建立的qPCR方法的Ct值与标准品拷贝数的线性关系良好，最低检出限为102copies/μL，可用于养殖过程中铁壳虾病的监测，用于MrPV‑4的检测。

Description

马来西亚大虾病毒的检测试剂盒
技术领域
本发明属于水产病毒病原的检测技术领域。更具体地，涉及一种马来西亚大虾病毒的检测试剂盒。
背景技术
水产疾病严重制约着水产养殖业的发展，越来越多的迹象表明水产疾病的研究对新病毒的快速检测及鉴定有着迫切需求。面对俞渐纷繁复杂的水产病毒，宏病毒组学似乎可以满足鉴定新病毒的需求。宏病毒组学将环境中的病毒通过富集，测序，加以生物信息分析，初步拼接出病毒的基因组序列，并将其初步分类到已知的各病毒科属。这种方法不需要培养病毒的特定细胞株系，也不需要对病毒进行抗原抗体反应，已有多项研究表明通过宏病毒组学方法得到了传统方法难以发现的新病毒。本发明通过对感染“铁壳虾”病的马拉西亚大虾体内的病毒进行富集和宏病毒组测序，发现了一种新的小RNA病毒，暂命名为MrPV-4。
“铁壳虾”是指表现出体表发黄，生长缓慢或停止生长，以及双螯肢变蓝，变长等性早熟现象的虾，铁壳虾虽不会死亡，但会导致产量下降，造成饲料等养殖资源的浪费，导致经济损失。为便于对铁壳虾病进行监测，及时对可能存在的风险进行针对性处理，有必要建立一种铁壳虾病的监测方法，针对MrPV-4进行检测，开发相应的检测试剂盒等。
巢式PCR和荧光定量PCR具有检测特异性强，灵敏度高等优点，现已广泛应用于水产动物病毒病原的检测。例如，高文辉等基于牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因建立了该病毒的巢式PCR检测方法(高文辉,白昌明,蔡生力,等.基于牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因的巢式PCR检测方法的建立及应用[J].水产学报,2016,40(3):326-333.)。中国专利CN103966358A也公开了一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。但目前还未有针对MrPV-4进行检测，以监测铁壳虾病的试剂盒和方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术中的缺陷和不足，提供一种马来西亚大虾病毒的检测试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一种用于检测马来西亚大虾病毒MrPV-4的靶基因。
本发明的第二个目的是提供所述靶基因在制备检测MrPV-4的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种马来西亚大虾病毒MrPV-4的检测试剂盒。
本发明的第四个目的是提供一种用于检测所述靶基因的引物组。
本发明的第五个目的是提供上述引物组在制备检测MrPV-4的产品中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种检测MrPV-4的巢氏PCR方法。
本发明的第七个目的是提供一种检测MrPV-4的荧光定量PCR方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)又名马来西亚大虾，本发明通过对感染“铁壳虾”病的马来西亚大虾体内的病毒进行富集和宏病毒组测序，从中发现了一种新的小RNA病毒，暂将其命名为Macrobrachium rosenbergii picorna virus 4(MrPV-4)，基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明参照国际病毒分类委员会(ICTV)对小RNA病毒科Picornaviridae的系统发育分析，通过贝叶斯建树，对小RNA病毒目Picornavirales下8个科内的多个属的代表种，未分类到属的暂定种，以及新发现的小RNA病毒MrPV-1、MrPV-4、MrPV-7、MrPV-12进行了系统发育分析。结果表明，MrPV-4与MrPV-12的亲缘关系相对最近，但仍不能分到同一个属，其枝落在Marnaviridae和Iflaviridae之间，但离两科距离较远，也不能分入已知的科。
为便于对“铁壳虾”病进行监测，本发明针对MrPV-4，以其基因组中第8790～9506位的核苷酸序列为靶基因，设计筛选巢氏PCR和荧光定量PCR引物，开发了用于铁壳虾病监测的试剂盒，并建立了相应的监测方法。
本发明提供了一种用于检测马来西亚大虾病毒MrPV-4的靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明在此靶基因的基础上，通过设计PCR引物，成功构建了MrPV-4的巢氏PCR和荧光定量PCR检测方法，实现了对铁壳虾病的监测。因此，本发明申请保护SEQ ID NO.2所示靶基因在制备检测MrPV-4的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于检测SEQ ID NO.2所示靶基因的引物组。
优选地，所述检测SEQ ID NO.2所示靶基因的引物组为巢氏PCR引物，其序列如SEQID NO.3～6所示，见实施例1。
优选地，所述检测SEQ ID NO.2所示靶基因的引物组为荧光定量PCR引物，其序列如SEQ ID NO.7～8所示，见实施例4。
本发明还申请保护上述引物组在制备检测MrPV-4的产品中的应用。
本发明还申请保护一种马来西亚大虾病毒MrPV-4的检测试剂盒，其含有检测SEQID NO.2所示靶基因的试剂。
优选地，所述试剂包含检测SEQ ID NO.2所示靶基因的引物组。
优选地，所述试剂包含检测SEQ ID NO.2所示靶基因的巢氏PCR引物，引物序列如SEQ ID NO.3～6所示。
优选地，所述试剂包含检测SEQ ID NO.2所示靶基因的荧光定量PCR引物，引物序列如SEQ ID NO.7～8所示。
优选地，所述试剂盒中还包含含有SEQ ID NO.2所示靶基因序列的阳性重组质粒作为阳性对照。
本发明还提供了一种通过检测MrPV-4以监测铁壳虾病的巢氏PCR方法，即用SEQID NO.3～6所示巢氏PCR引物对待测样本进行PCR扩增，若巢氏第一轮PCR出现了大小为717bp的特异性条带或第二轮出现大小为340bp的特异性条带，则表示所检样本中含有病毒MrPV-4。
本发明还提供了一种通过检测MrPV-4以监测铁壳虾病的荧光定量PCR方法，即用SEQ ID NO.7～8所示荧光定量PCR引物对待测样本进行扩增，若qPCR结果出现了扩增曲线且对应Ct值＜37，则所测样本为阳性结果；若无扩增曲线或Ct值≥40则为阴性结果；若扩增曲线的Ct值处于37～40之间，则建议重复实验，若重复结果的Ct值＜40且扩增曲线有明显起峰，则所测样本为阳性，否则为阴性。优选地，在选取样本组织时，若样本为虾苗则取甲壳下组织，若样本为大虾则取鳃和肌肉，或亲虾的游泳足，见实施例1。
优选地，RNA反转录成cDNA时，20μL的反转录体系中加500～1000ng的RNA，见实施例1。
更优选地，RNA反转录成cDNA时，20μL的反转录体系中加500～800ng的RNA，见实施例1。
优选地，第一轮巢氏PCR引物的退火温度为50℃～60℃，见实施例1。
更优选地，第一轮巢氏PCR引物的退火温度为57℃，见实施例1。
优选地，第二轮巢氏PCR引物的退火温度为50℃～60℃，见实施例1。
更优选地，第二轮巢氏PCR引物的退火温度为56℃，见实施例1。
具体地，第一轮巢氏PCR反应的反应体系为：2×Accurate Taq Master Mix 10uL，5μM的正反向引物各0.5uL，1uL的cDNA模板，灭菌水8uL。
具体地，第一轮巢氏PCR反应的扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
具体地，若第一轮巢氏PCR扩增未检测出阳性条带，则将产物用灭菌水稀释50～100倍后作为模板，进行第二轮PCR扩增。
具体地，第二轮巢氏PCR反应的扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
具体地，荧光定量PCR的反应体系为：cDNA 1μL，primer F 0.2μL，primer R 0.2μL，2×SYBR GREEN I MIX 5μL，ddH2O补足至10μL。
本发明具有以下有益效果：
本发明针对MrPV-4，提供了一种检测MrPV-4的试剂盒及方法。本发明所建立的检测MrPV-4的巢氏PCR方法的检测灵敏度高、重复性和特异性好，其最低检出限为10copies/μL。所建立的qPCR方法的Ct值与标准品拷贝数的线性关系良好，灵敏度高，特异性和重复性好，其最低检出限为102copies/μL，得到的组内变异系数和组间变异系数均低于5％，可用于MrPV-4病毒的检测，筛选淘汰带毒种虾，减少养殖过程中的损失，对铁壳虾病起到监测作用。
附图说明
图1为MrPV-4病毒的系统发育分析结果。
图2为巢氏PCR引物MrPV-4-1-F/R的扩增结果。
图3为巢氏PCR引物的扩增结果，其中左图为引物MrPV-4-1-F/R的扩增结果，右图为引物MrPV-4-2-F/R扩增结果。
图4为巢氏PCR引物MrPV-4-1-F/R的最佳退火温度检测结果，实验重复三次，泳道1～6对应的退火温度依次为50℃、50.9℃、53.3℃、55.7℃、56.8℃和59.9℃，泳道7为阴性对照。
图5为巢氏PCR引物MrPV-4-2-F/R的最佳退火温度检测结果，实验重复三次，泳道1～6对应的退火温度依次为50℃、50.9℃、53.3℃、55.7℃、56.8℃和59.9℃，泳道7为阴性对照。
图6为巢氏PCR引物MrPV-4-1-F/R的灵敏度检测结果，实验重复三次，泳道1～7对应的模板浓度依次为107copies/uL、106copies/uL、105copies/uL、104copies/uL、103copies/uL、102copies/uL和10copies/uL，泳道8为阴性对照。
图7为巢氏PCR引物MrPV-4-2-F/R的灵敏度检测结果，实验重复三次，泳道1～4对应的模板浓度依次为104copies/uL、103copies/uL、102copies/uL和10copies/uL，泳道5为阴性对照。
图8为巢氏PCR引物MrPV-4-1-F/R的特异性检测结果，泳道1～4对应的阳性样本分别为IPV、MrPV-1、MrDV-3、McDV和McRV，泳道5为阳性重组质粒，N为阴性对照。
图9为巢氏PCR引物MrPV-4-2-F/R的特异性检测结果，泳道1～4对应的阳性样本分别为IPV、MrPV-1、MrDV-3、McDV和McRV，泳道5为阳性重组质粒，N为阴性对照。
图10为巢氏PCR引物MrPV-4-1-F/R对浙江省湖州市的10份罗氏沼虾的鳃样品的检测结果，其中N为阴性对照。
图11为巢氏PCR引物MrPV-4-1-F/R对浙江省湖州市的10份罗氏沼虾的鳃样品的检测结果，其中N为阴性对照。
图12为荧光定量PCR标准曲线。
图13为荧光定量PCR引物的扩增曲线，A～H阳性重组质粒的浓度依次为108copies/uL～10copies/uL。
图14为荧光定量PCR的特异性检测结果，其中A为IPV阳性样本，B为MrPV-1阳性样本，C为MrDV3阳性样本，D为McDV和McRV阳性样本，E为阳性对照，F为阴性对照。
图15为荧光定量PCR引物对浙江省湖州市的10份罗氏沼虾鳃样品的检测结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1巢式PCR检测方法的建立及反应条件的优化
1、巢氏PCR引物的设计
本发明通过宏病毒组测序，从感染“铁壳虾”病的马来西亚大虾中发现了一种新的小RNA病毒，暂将其命名为Macrobrachium rosenbergii picorna virus 4(MrPV-4)，基因组序列如SEQ ID NO.1所示。同时，本发明参照国际病毒分类委员会(ICTV)对小RNA病毒科Picornaviridae的系统发育分析，通过贝叶斯建树，对小RNA病毒目Picornavirales下8个科内的多个属的代表种，未分类到属的暂定种，以及新发现的小RNA病毒MrPV-1、MrPV-4、MrPV-7、MrPV-12进行了系统发育分析，结果如图1所示。由图1可知，MrPV-4与MrPV-12的亲缘关系相对最近，但仍不能分到同一个属，其枝落在Marnaviridae和Iflaviridae之间，但离两科距离较远，也不能分入已知的科。
为实现对MrPV-4病毒的监测，本发明以MrPV-4病毒基因组中的第8790～9506位的核苷酸序列为靶基因(如SEQ ID NO.2所示)，设计并筛选出了巢式PCR扩增引物MrPV-4-1-F/R和MrPV-4-2-F/R，拟扩增的片段大小分别为717bp和340bp。
巢式PCR第一轮扩增引物(以下简称一扩)的序列如下所示：
MrPV-4-1-F(SEQ ID NO.3)：CCTTGGATATGAAGTCACCTCAG
MrPV-4-1-R(SEQ ID NO.4)：GCGAGCGGATAAGTTCTTAATAGA
巢式PCR扩增引物MrPV-4-1-F长23bp，其位于MrPV-4基因组5’端起的第8790～8812位，MrPV-4-1-R长24bp，其位于基因组的第9483～9506位。
巢式PCR第二轮扩增引物(以下简称二扩)的序列如下所示：
MrPV-4-2-F(SEQ ID NO.5)：GATGGAACACCACCTTAC
MrPV-4-2-R(SEQ ID NO.6)：TCAATTACAGCACGAGTC
巢式PCR扩增引物MrPV-4-2-F长18bp，其位于MrPV-4基因组5’端起的第8829～8846位，MrPV-4-2-R长18bp，其位于基因组的第9151～9168位。
2、组织RNA的提取和反转录
组织的选取：若待测样本为虾苗，则取甲壳下组织，若待测样本为大虾则取鳃和肌肉，或亲虾取游泳足。
组织RNA的提取使用的是普洛麦格公司的Super总RNA提取试剂盒(货号LS1040)，具体步骤参照试剂盒说明书进行。RNA提取结束后，测其浓度，再使用艾科瑞公司的Evo M-MLV反转录预混型试剂盒(货号AG11728)将组织RNA反转录为cDNA。
在配制的反应体系中加500～1000ng(500～800ng更佳)的模板RNA，37℃水浴15min，再85℃水浴灭活5s，-20℃冻存备用。
3、巢氏PCR方法的建立
(1)第一轮巢式PCR
以反转录所得cDNA为模板，使用第一轮巢式PCR引物MrPV-4-7-F/R进行PCR扩增，并设置阴性对照。PCR采用20uL体系，扩增所用试剂为艾科瑞公司的2x Accurate Taq预混液(含染料)，货号为AG11019。
PCR反应体系：2×Accurate Taq Master Mix 10uL，浓度为5μM的正反向引物各0.5uL，1uL的cDNA模板，灭菌水8uL。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR反应结束后，取适量PCR产物进行电泳检测，结果如图2所示，阴性对照(N)无条带，泳道4出现了大小与预期相符的单一条带，表明PCR方法构建成功，所检测样品为MrPV-4病毒阳性，且带毒量较高。
(2)第二轮巢式PCR
若第一轮巢式PCR扩增产物未检测出阳性条带，则将第一轮PCR产物用灭菌水稀释50～100倍后作为模板，用引物MrPV-4-2-F/R进行第二轮巢式PCR扩增。PCR反应体系同上，扩增程序改为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1mins，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR扩增结果如图3所示，左侧为第一轮巢氏PCR扩增结果，无条带，将第一轮扩增产物稀释50倍后，第二轮扩增出现了单一的阳性条带而阴性对照无条带，条带大小与预期的片段大小相符，表明PCR方法构建成功，所检测样品为MrPV-4病毒阳性，但带毒量较低。
4、构建阳性重组质粒pMD19-T-MrPV-4
以反转录所得cDNA为模板，用一扩引物MrPV-4-1-F/R进行扩增，扩增反应体系及反应程序同上。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，选取大小与预期相符的条带，将条带对应的PCR产物送天一辉远公司测序，将测序结果与宏病毒组拼接的序列进行比较，序列一致，进行下一步实验。
使用TaKaRa公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0将PCR产物进行切胶回收，并用TaKaRa的pMDTM19-T Vector Cloning Kit(货号：3271)将胶回收产物与pMD-19T载体连接。连接结束后，用热激法将连接产物转进DH5α大肠杆菌感受态细胞中，摇菌后涂布于含Amp抗性的LB培养基上，37℃恒温培养过夜，于次日筛选单菌落。将挑取的单菌落扩繁后，用一扩引物MrPV-4-1-F/R对挑取的单菌落菌液进行PCR检测。筛选具有目标条带的菌液测序，检测其是否含有目标质粒。将测序结果正确的单菌落菌液扩繁，用TaKaRa公司的MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0试剂盒提取质粒，即得阳性重组质粒pMD19-T-MrPV-4，测定浓度后于-20℃冻存备用。
5、退火温度的优化
以浓度较低的(104copies/uL)阳性重组质粒为模板，在不同的退火温度下分别用一扩引物MrPV-4-1-F/R和二扩引物MrPV-4-2-F/R进行扩增，选取其中最亮的条带所对应的退火温度为最佳退火温度，实验重复3次。
一扩引物MrPV-4-1-F/R的退火温度优化结果如图4所示，泳道1～6对应的退火温度分别为50℃、50.9℃、53.3℃、55.7℃、56.8℃和59.9℃，泳道7为阴性对照，由图可知，泳道5的条带最亮，故一扩引物MrPV-4-1-F/R的最佳退火温度为57℃。
二扩引物MrPV-4-2-F/R的退火温度优化结果如图5所示，泳道1～6对应的退火温度分别为50℃、50.9℃、53.3℃、55.7℃、56.8℃和59.9℃，泳道7为阴性对照，由图可知，泳道1～4的条带亮度相当，故选取其中最高的退火温度56℃作为二扩引物MrPV-4-2-F/R的最佳退火温度。
实施例2引物的灵敏度、重复性及特异性检测
1、灵敏度及重复性检测
将实施例1制备所得阳性重组质粒分别稀释为107copies/uL、106copies/uL、105copies/uL、104copies/uL、103copies/uL、102copies/uL、10copies/uL和1copy/uL。以不同浓度的阳性重组质粒为模板，用一扩引物进行PCR扩增，重复3次，检测引物的灵敏度和重复性。
一扩引物的灵敏度和重复性检测结果如图6所示，由图可知，3次扩增的结果均一致，一扩引物的最低检出限为104copies/uL。
以浓度为104copies/uL、103copies/uL、102copies/uL、10copies/uL和1copy/uL的阳性重组质粒为模板，用二扩引物进行PCR扩增，重复3次，检测引物的灵敏度和重复性。
二扩引物的灵敏度和重复性检测结果如图7所示，由图可知，3次扩增的结果均一致，二扩引物的最低检出限为10copies/uL。
2、特异性检测
本发明分别提取了传染性早熟病毒(IPV)，罗氏沼虾小RNA样病毒-1(MrPV-1)，罗氏沼虾双顺反子病毒-3(MrDV-3)，青蟹双顺反子病毒(McDV)和青蟹呼肠孤病毒(McRV)阳性样本的组织RNA，逆转录为cDNA。以所得cDNA为模板，先用一扩引物MrPV-4-1-F/R进行扩增，一扩结束后将PCR产物稀释50倍后作为模板，再用二扩引物MrPV-4-2-F/R进行扩增。特异性检测结果分别如图8和图9所示，其中泳道1～4对应的阳性样本分别为IPV、MrPV-1、MrDV-3和McDV、McRV，泳道5为阳性质粒，泳道6为阴性对照。因McDV是McRV的卫星病毒，故在实际检测过程中，这两种病毒在同一份阳性样本中。由图8和9可知，除阳性对照有单一条带外，其余组均无条带，表明本发明所述巢氏PCR引物的特异性良好。
实施例3实际样本的检测
利用所构建的巢氏PCR检测方法，对从浙江省湖州市采集的10个马来西亚大虾的鳃样品进行了检测，检测结果分别如图10和图11所示，第一轮扩增未出现条带，第二轮扩增有3个样品出现了单一条带，表明所构建的巢氏PCR检测方法适用于病毒MrPV-4的实际检测。
实施例4荧光定量PCR引物的设计及PCR方法的建立
1、荧光定量PCR引物的设计
使用与实施例1相同的靶基因，设计筛选获得的qPCR引物命名为MrPV-4-q-F/R，拟扩增的片段大小为220bp，引物序列如下所示：
MrPV-4-q-F(SEQ ID NO.7)：GCTGTTGAGATGGAACACCACCTT
MrPV-4-q-R(SEQ ID NO.8)：GCTCCTTGAGAATGTCAGGCATGG
MrPV-4-q-F引物的长度为24bp，从5’端起，其位于病毒基因组的第8821～8844位，MrPV-4-q-R引物的长度为24bp，其位于基因组的第8915～8938位。
2、荧光定量PCR方法的建立
以实施例1中的cDNA为模板，用MrPV-4-q-F/R进行qPCR检测，构建病毒MrPV-4的qPCR检测方法。所用实时荧光定量系统为：Roche LightCycler480II；所用qPCR试剂盒为艾科瑞公司的Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒II(AG11702)。
qPCR反应体系为：cDNA1uL，primer F 0.2uL，primer R 0.2uL，2×SYBR GREEN IMIX 5uL，ddH2O补足10uL。
qPCR反应程序如表1所示：
表1 qPCR反应程序
若qPCR结果出现了扩增曲线且曲线对应的Ct值＜37，则所测样本为阳性结果；若无扩增曲线或Ct值≥40则为阴性结果；若曲线的Ct值处于37～40之间，则建议重复实验，若重复结果的Ct值＜40且扩增曲线有明显起峰，则所测样本为阳性，否则为阴性。
3、标准曲线的绘制及qPCR检测
将阳性重组质粒10倍递减稀释，选取102copies/uL～107copies/uL共6个稀释度进行qPCR扩增，以重组质粒拷贝数的对数值为X轴，以Ct值为Y轴，建立标准曲线，标准曲线如图12所示，得到的标准曲线方程式为：y＝-3.4071x+36.361。经测定本方法的相关系数(R2)＝0.9942，扩增效率(E)＝96.6％，提示本方法所设计的引物良好，反应体系正常。
以上述不同浓度的阳性重组质粒为模板进行qPCR检测，qPCR扩增曲线如图13所示，由图可知，除阴性对照无S型扩增曲线外，其余均出现了S型扩增曲线，其中A的浓度为107copies/uL，B为106copies/uL，C为105copies/uL，D为104copies/uL，E为103copies/uL，F为102copies/uL，结果表明所述荧光定量PCR方法的适用浓度范围广。
实施例5灵敏度、特异性及重复性检测
1、灵敏度检测
将阳性质粒标准品稀释为100copies/uL～103copies/uL 4个浓度，用qPCR引物对其进行扩增，每个浓度做20个重复，反应体系及程序同上，选取变异系数小于5％且阳性检出率大于95％的最小稀释度作为其最低检出限。
灵敏度检测结果如表2所示，当稀释度小于102copies/uL时，变异系数大于5％，且阳性检出率小于95％，因此最低检出限为102copies/uL。
表2灵敏度检测结果
2、特异性检测
以实施例2中巢氏PCR引物特异性检测所用样本的cDNA为模板，用引物MrPV-4-q-F/R进行qPCR检测。特异性检测结果如图14所示，其中A为IPV阳性样本，B为MrPV-1阳性样本，C为MrDV-3阳性样本，D为McDV和McRV的阳性样本，E为阳性对照，F为阴性对照。由图可知，只有阳性对照出现了扩增曲线，结果与巢式PCR一致，说明qPCR检测法特异性良好。
3、重复性检测
以5个不同浓度的阳性重组质粒(103copies/uL、104copies/uL、105copies/uL、106copies/uL、107copies/uL)为模板，重复检测五次，根据Ct值计算组内变异系数。另外在3个不同的时间点进行批间重复性试验，根据Ct值计算批间的变异系数，利用批内和批间变异系数，评价所建立方法的稳定性。qPCR引物的重复性检测结果如表3所示，组内变异系数为0.43％～3.90％，组间变异系数为1.49％～3.81％，组内变异系数和组间变异系数都在5％以下，表明本方法的重复性和重现性都很好，结果稳定可靠。
表3重复性检测
实施例6实际样本的荧光定量PCR检测
利用所构建的荧光定量PCR检测方法，对从浙江省湖州市采集的10个马来西亚大虾的鳃样品进行了检测，荧光定量PCR结果如图15所示，曲线对应的Ct值如表4所示。由图15可知，10个样品中有3个样品有扩增曲线且对应的Ct值小于37。将阳性结果的Ct值对照标准曲线换算成拷贝数，拷贝数分别为908copies，6067copies和385copies，均处于巢式PCR一扩(104copies/uL)和二扩检出限(101copies/uL)之间，检测结果与巢式PCR一致。
表4 10个罗氏沼虾的鳃样品的qPCR检测Ct值
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学
<120> 马来西亚大虾病毒的检测试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9818
<212> DNA
<213> 罗氏沼虾小RNA病毒-4(Macrobrachium rosenbergii picorna virus 4)
<400> 1
ttccggttaa atgtagggta tattaagacc caggcctaat aaagtaaaat aaactaaaat 60
gacggccgag gagcccagaa taaattctgg gtgctctaac atatacgtca tgtctaaaag 120
taaataaaag aaaattagtc atgcgttaag cggaatacta gcttgcttta agtcgtgcga 180
cgactcaatt ccaacgacaa tgacagcgac gaaataagtt aatagcgagg cgaaataaaa 240
tatcgaataa gtgcgtacgg ctccaacctt aaaaacggga tattccctag gaatcacgga 300
gatatcgcga acgcgagcgg ataagttctt aatagaatta tgcgaaatgg atttcaggac 360
caagacggat aaaagaaatt gaaaatttgt gaacgaagcg ttaaaatgtt tatattatgc 420
gagactactt aatactaagc gcaaaaccta tcactaggaa aaagcgcgaa cgaaaattaa 480
aatgataggc atacaacaat aacaactata ataaacaaca aatattcaaa caagaaaaat 540
gaattgttat tgagggcagg ttttgagaaa acattgcaaa acgaaaattg ggtactagct 600
tgcttaaagt cgtgcgacga ctcaacccag agaaaaagaa tgacacgtac tcaattacag 660
cacgagtcgt aggagacgaa cttcctttga aggtcgtaaa tctcgtttct cacggtgttg 720
taattaaccg tgagccacga gcggggaact tttgaaccaa acttccactt gaagtctctg 780
agagcatcag gaccgtgatg acaaatgaaa cgctgcacta cttggaaacg caattgcagg 840
tcactttcgt catcaatgaa ttgtttagga cggtatttga gctccttgag aatgtcaggc 900
atgggcaaag gtgcccacca gacactatca cggcaaacaa aaggtgactt caagaaagtc 960
atctggtcaa aagtaaggtg gtgttccatc tcaacagctt taagagctga ggtgacttca 1020
tatccaagga gatgaagaat ggccttgatg gactggccat tatatttttc tagaacatcg 1080
ggggtgacag attgagcaac atcatcacca taagttaaca tgcgaacttt cgaatcaaac 1140
atacgcaaat catacgcgga cggtgtaaca agcaaacaaa aagcaatata atgaatgtaa 1200
gtgttggtga ttgaattaaa cacgtcagta aacggatttc cagatttgtt tcccttgtgg 1260
gaggttgaaa tgcactccct catgatatgg tacggattgc gaagacattc aatcaaagca 1320
acgcgagcac gctgttcagc aggatccgcc ccctcataat acgccagaac gacgtcttca 1380
aagaagcgaa aagcaggttg tccaacagta ccatcataat tcttaaaatc ttcggcaata 1440
catttgtcac tattcctgag aaaaccctca gcgtaatagc gccaagcttc ctcacgatcc 1500
ataccaatac catgatagaa aacaaatcca gcacgagctt tataataatc aagaaaagca 1560
ccaaaataac gacgaacaag caaaacataa cacaagtcag gttgctcaaa aactcgagtt 1620
ttgccaataa gacacttttc ctccttcaga agctcatcct tggtggtaga aatccaaagt 1680
gagagaggag caatgccttc acgacataac ttttcagcat tttctaaacg tttaacaaaa 1740
gtacatccaa acaaaggaat ttcatgttgc aaagctttag gtgagaattc atacttaacg 1800
ggttcgagtt cttgtccaat tccagtctcc tgaggcaaag ccttgaaaaa ctgtttcttc 1860
ccagccttga aaccaaagct agaccagtaa ccaactccgg tgttcatgtt gagtggctgc 1920
atgatctcgt ttccattgat tgcctcatga agggagtaaa catgcttttg acgacgaatc 1980
tcaaattttg acacaaaatg atcaacacaa tattcatgca gaccaggagg gatagcacgt 2040
cctgcagtgc aggcatactt ttgggcattt gaaataagtg ggtgaacgac gcgcaaatca 2100
ggcaaatgaa caacatgttg tgatgcggga cgataattac aatcttcgtc acgcaaaagt 2160
aattgaccac gataagtaac acgaacaaat ttagtttcag taggtgtaaa gtgtgaagct 2220
ttccacttgc caaacgtacc ctgaccaaca agttccatag tgctattcca atgacgagaa 2280
aagttggcag gcgcaggttc aacagacaac tgaacaatct ctttttcggc aggtggcaca 2340
aaggttaatt taattgaatc aaaagcagct tgcacggagt tgcggtgaat aggtgcggct 2400
ccgacgacat tagcattttt atacaaacaa caatgaaaag cgataatcgg cgagttaagc 2460
atacgtggat gctgcgaaag atatggtagt ccacaatctc catcaacagt agcactggaa 2520
ggtactccat taatgaaaac atggccaggc gcatagcctg cagcagaaaa aatgcccatg 2580
gtgacatcgt aatcatttcc gggcacaacg cgaccatcat gattgataat gcgagcagtt 2640
tgattcttgt taataatggg cgacaaatca tcggcaagaa aagtccaaat attacgacaa 2700
gacgacacag tttcggtacg caattttaca atacgcaaat caatcggttt tccgaaatac 2760
tcaagctggc atgaatttga agcagacaga taaaatggaa tgggttcaga gacagttccg 2820
tccactttac gattagaaat aaacatggca gtttcaggat tgtctcgaac ggcattacga 2880
aaatgttcat acatgtgatt tgggataagc atagtacgac catccaacat gagacattga 2940
gtgcgctgca aattaatacc atcctgaaat atgaaaactt cgcgtaaatt tttcctaatg 3000
cgctcctgat tttggagaac atcagaggtg tcaccttggg gcacagctgg tgcgcctttg 3060
ggttccacct tacggcgacg aataaaacga gcagtatcgt acaccgattg cattgaagca 3120
acctcaacgg aacgaagcaa cgagttaata ataaatgaaa cagttttaaa aacaacgact 3180
aaacctaaac caacagcggc gagaccagca cacattttca taaaaccttg aaaacgtgcc 3240
ttatacacac gataaaaacg cgacaaacga taaatagtgt caaagaaatt ggcatcaacg 3300
acggtttttt cctccttaaa cacttcagga ggccccccat taatgcaaat gttaaacgga 3360
tacggactac gaatttttac gaggcgctta agttcctcgg cttcaaaacc gagttcttca 3420
tcattcataa caagaacagt gtccatgaaa gcactacatt gggagtatga ccaattatcg 3480
gagttgagaa aggtagcccc ccacttctgc aacattgatt gaccttcatc ataattacga 3540
gtggtttgag cggaatagcc ctcccgaaac gaaataagcg gacgagcact ccacatttgc 3600
actgaggcag acgtgtcccc atttgaagaa gctgtagcga ttggtgaggt agtaggagtt 3660
ggatcagctt caatacgagt caacgcatca gagagagcgt taaaatcaac actgcgctct 3720
tgatgcttct tcagaagttc ggcgatataa gtcgagaaaa gaacacggtt attagaaact 3780
acaccattgt acaagttgac aggatacaat tcaaaagcgt cattacacaa acgaatcaaa 3840
tcattagcag aatcgcaatt tgccaattct ccacaaaatt tctgagcatc caattgacga 3900
acaatagcat tttgaccgtt aaagtccaaa ccataatttg gtgcgacaac aacacgatat 3960
gcgaaagtaa tacgacgaac gagtgcggtg gcatcacgca ctttagaaag agcggtttgc 4020
attgacgtca tgtttgaggt tatatttaca aactttgaaa caaacacttc atctttggca 4080
tcgacggcgg ctttattcat agcggcggga atagcgttaa ctaagcgaat tagattggcg 4140
ggatcattac cttcaactga ctgttcaaac tcatccatga caacaaaagg ttgtccgtca 4200
tacccctcaa agaatttatt ttctccaaaa ggcatgacgt aaacatcatg ttgccactct 4260
ttctttccta atttgagctt cagagcgaca atacgcggaa tgagagttgc ggaaagtagg 4320
gacttcccag taccagcatc accacacagg aacgaacaca cgggctgtgg ttgtgcttta 4380
ggagtttgac gcaacttatg caaacgctta taacgagtac gaacgatttc acaaacacgc 4440
atgagattat tgggtatagt catttcaacg gaaagcaaat caagatcacg acacatagtt 4500
gttaaattga cgagaaaagt ccagggagtg gcggcaatag gtttaccggc attgtcctgt 4560
aaagtaagag cggcaagacg cggcaaagtg gtatcttcca tcttctcaaa cgtaaaatat 4620
ccttctccat ccatttctgt aaagatgttg aagagacgca cgtaagagtg tagttgtgca 4680
ctctcccagt tctggttaag aacgtctcca tgaatgagat agagaaaaga atgaaaaaac 4740
aacaacaaaa aagacctgaa gcctgcgtct ttgcagactc cacacgttcg ccggatatat 4800
ttttcatacc cgggtccaag aaagaaacca taaaatccaa gcacactttt aaatagagac 4860
ggaacaacag caccaattcg aaacgaaaaa gggtccactt ctaaatcggc taaattaaac 4920
aaaccttgcg ggcgagcgtc gccctcaaaa gcaggcggct ttccaattaa atcgcctgga 4980
ggaataaacg ctccgaaatc aaccaaatta tcacgcgaat cgacgatatg gcaattaaaa 5040
gcttgtggat ccgaatcact atccacaaaa cgacggcggt cacgttgaat attacaagcg 5100
gcatcggcag cacgatcggc atcgtgctgg tggcgacgag cataacctgg ctcatcatca 5160
gggtccagca aatttacagg cccagcggcg ggcttaatag gatcatcttt tgctctagac 5220
ttggcaaaag catcaaaact accatctgta cacgcggctt ccatccggga aatcaattcc 5280
tctgcttccg catcagaatt gatttcctga tcttcttctt cctcatcgtc attgtgttgt 5340
ttgtcgtgac gaccgacata tttgcgcaag atatttacaa ttgaagcaac ggcaacagtt 5400
ttcatggcga cttcaccata atagaaggta tggacggcgg taataagagg taaaccatcg 5460
tccataagag cagttaaaaa agcaacacac ttatcaaatt ttttagcgag tttttgcttc 5520
aattttgtgg cacctagcgc taaggaagca ccagcagcgg cagcagctgc tgaatcagca 5580
gcaaattttg gtatagcagc gagagttgtc ctaacttgat taaaagcgga aacaatagca 5640
gataaaatat ctgtccaacc ctgaacagtt tcagtgtcag acgcgaaata catttgacga 5700
cgtggtttac gaccacctcg tcgtttaaca aaattacatt cagtatatac aggacgacgc 5760
aagtcacgag aacgagataa atcatcaacg acactatcag aagccgtcac gtcagaaaca 5820
aaagaatcag ttttgtcttt tgctggttcg tgagcaatga aagctttcga atcagcttgt 5880
ggtgtggctt cgacatcagc ggaaatacca aacaacgaca aattagaaaa acgcgaagca 5940
acaagatctt catctgcagc cagagaacgt gttgaagtta cacgccactt tggcaatggc 6000
agataaaagt gcggcatcca atcatcatca accataacat ttgcagtaag ggtaacatcg 6060
gggttacgca tggtgtaaaa attaacaaca ccactgtaac ccggcgaaga atgccaacgt 6120
cccataggca catgaacaag attgtgcata ccgggaactt tgaaatcgac actttgatta 6180
ttaactaggt ttacagaagt gcacacattc atcttccgag cggtcgtttc tggctcattc 6240
atccactcaa aagtgttata gtaagaagta agagaaccat tgacagaggc ataaatacga 6300
caagtcccag tggtacaacc cgaagccaag atgcgatatt taaccccacc agaacaatgc 6360
aaataagggc gcaacatccc ggcaaagtct tccgtcatca tactaggcat gatcgcacca 6420
gtttgagcaa tgtgaataaa atcatcgttg gtggcagcag tgaaacgttg actagacagg 6480
tgatggggca tacgcaataa ttctcgcacg tcccagttgt ggtacatgta tcctttctta 6540
cacaaatcat tcttatagaa agaatgtata gaatcacgag ggctttcaac agtaggcccc 6600
agtggacaag aatcagactg aacaacttcg ccataataag atccataaac aggcgttgcg 6660
aattcgaaat caggaccggc acgaatgtat acatttatat caactgtggt tggagcccct 6720
ggagcaaacg taagagggtg gcgagcttga acaatcaaac aaccagtcat ggccaaatta 6780
tcgaacataa caggagcgta gtcagtgggg aaagtccacg gagcacgcac agcaaagaca 6840
tcatcgtttt gtcctatttg atgggaatat tctggcaaat tacgattatt attgtacaag 6900
cttgtcgttc cgttaggatc aaaataaaca gcaagctctc cacgtgtaaa cggcgacgca 6960
ataatttcaa atttatactc gacgcttcca cgccactggg aaaagaaatg tccccaatga 7020
cttagattcg tagactcacg ctcactgttg gcaacagtag cgttgacagg attcacagga 7080
ataatgaaca aattacctga gttatgagtg gaattccact cgaaaatcat aaggcgagac 7140
caaatacgac acatttcatg tatatttgtc aaagaaggcg ttccaaagtg gtttaattgc 7200
ggattaacaa ccattgaatt aaaaggtcga agagcaacta ctctgtgccc ggaatcggca 7260
cacgacatag tctcggactc ttcttcgcga acttcaacac gacgcaaaga attaggcgtg 7320
gcgccattag agcgattgat tccttccaaa aagggaccag tcatggcgac tttggaagat 7380
tgcggcaaag cgttaatagg cactttaata gcaaagttgg gctcgagggg tgttatagta 7440
atgtgaaaat gcttcgttgc ggattcagtg gacggtcgct tcaatttatt ccacacacca 7500
atgcgaagtg acccataaac gataatattg ggagtcacta ttccaaaaga ttgggggata 7560
gaccaaggaa tgtcaagagc acaagctccc gcactaccta atttggcaat aacatgcggc 7620
aaattgagaa cagaaccata cgaaatctga gtggtggcag cggagaaacc agctggttcc 7680
caatacatac acagagcacc gacactatac ggatcattgt taaaacgcaa cgtagcacga 7740
aaaccggttc gaaacgcgaa ataccctttc ttcagataag cggcagacga ataattaagc 7800
aaataggaac caggtagatc aagaaaggcg gcagttccac taacgttagt attaattgac 7860
caatcgaacg gtccgtaagt acattcgcga aacacggcag ccatactggt tgggctgggc 7920
aaatcatcag accaatcact acgctcctcg acatcatcgc acagaacagg tgcgaggtcg 7980
tcgtgcttgg cttctatagc ggaaagcgaa gcaacggggt gagtgtcaga ttgaggagca 8040
gcctcattat tcataaataa atcagtacac aaggcatgac aatgatcatg tgggcgacaa 8100
ttatcaaaca ataaagtatc atggcaacgc ggcgaacaaa acattacacg attgagagtc 8160
caaaagtact ctccacattc aacgcaagca aaattcggga tacgcgaacg agttaaagcg 8220
aaccaagaat cacggcactc agaatcacac caaacttcat acttataaga ctgttcaaaa 8280
ggatctccac actgcacaca agtttgtgcg ttgggagata cgtcgtcatt aatctcggca 8340
ccaaatttaa taggctcagg agcaaatggc atagggaacg ttgaaacgat acaccaacgt 8400
gaacaataat caacggcggt agcagaatag tagtgcatat aacaatattt acattgagaa 8460
tttctcggac caactttggc ttggtgattc cacatgctaa aacaataaga agaacaccaa 8520
tgatcaggag atgttccgtc acctacctta gtacgacacc aaacacattg tccttgcgga 8580
actagaacac gactaaaatc atcagtttca actggcacct caatagaagt acgatcttca 8640
tcttgaggcc agccgtgacg gcatggatca caaatgttgg cagcatcggg atctttacga 8700
acaaaagtat aattacaaac gaagcattta actaaagcgt ttacatcagt caaacccatc 8760
tggggtgttg cagcaatcat gtcacgggcg gcagagagtc gaacgggtgg agtgacatta 8820
acctcaattt gtgaggcacg tgcaggaagt tgcgaacgaa atcgttctcc agtttgtcga 8880
gaacgttcct gctctctatg ccaaacgtaa tcagcaaaag tacgcttaat agcacggaac 8940
gcgataacag gaaaacaaga cgagcaataa aatcgaactt catacgacgg cacgtcgagg 9000
ggagattgaa attcttctcc atcaacgcgt atacatatgc aattcttgcg acaattaaaa 9060
caagaatcac gagttttact agtgcgcgaa aacttagtcc acaagtgatg ctggatagcg 9120
caggcaaatt cagcttcact tatctcgacg tctttaagga catcaaggtt aacgatggta 9180
tagactggtg tgtcaagaaa gaaagttacg tttgtggttt ccatcatatt ttgagtgcgg 9240
gtacttcctg cgcgacgcag cgaactacga cgtcaacagt aggaacccaa gaaaagttca 9300
acgaacaaga aatcccactt aagggcgtcg acgggggtga aactgctcat attaaaatca 9360
ataggatcac actgtattct gtcctacggc tctgacttga cctagaatgt ctagtttagg 9420
cccgttttaa aaggccagtt catcgggttg acagccgaca tagtcacaat cagaatcttc 9480
gggatcccta gaggggagtt accggtccta cagaacataa gtgatcacca atcgcttaat 9540
ataggtttcc ttctggactt acctccagaa tggtggtgct gagcagactc agcgcgtaca 9600
aaacattaaa taagccaggt aagaaatggg tcagataaag ctaattgctt caaagaggtg 9660
ccaatatggg gcacggttaa gaagattagc aaaatctaat gccttcctag gcgaggggtc 9720
gagaacgacc atggctcatt ggatcatacg atcagtcttc tctctcgagg agagggggaa 9780
gggctcagag aaactcacag gggaatggtg agtgccgc 9818
<210> 2
<211> 717
<212> DNA
<213> 罗氏沼虾小RNA病毒-4(Macrobrachium rosenbergii picorna virus 4)
<400> 2
gcgagcggat aagttcttaa tagaattatg cgaaatggat ttcaggacca agacggataa 60
aagaaattga aaatttgtga acgaagcgtt aaaatgttta tattatgcga gactacttaa 120
tactaagcgc aaaacctatc actaggaaaa agcgcgaacg aaaattaaaa tgataggcat 180
acaacaataa caactataat aaacaacaaa tattcaaaca agaaaaatga attgttattg 240
agggcaggtt ttgagaaaac attgcaaaac gaaaattggg tactagcttg cttaaagtcg 300
tgcgacgact caacccagag aaaaagaatg acacgtactc aattacagca cgagtcgtag 360
gagacgaact tcctttgaag gtcgtaaatc tcgtttctca cggtgttgta attaaccgtg 420
agccacgagc ggggaacttt tgaaccaaac ttccacttga agtctctgag agcatcagga 480
ccgtgatgac aaatgaaacg ctgcactact tggaaacgca attgcaggtc actttcgtca 540
tcaatgaatt gtttaggacg gtatttgagc tccttgagaa tgtcaggcat gggcaaaggt 600
gcccaccaga cactatcacg gcaaacaaaa ggtgacttca agaaagtcat ctggtcaaaa 660
gtaaggtggt gttccatctc aacagcttta agagctgagg tgacttcata tccaagg 717
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccttggatat gaagtcacct cag 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgagcggat aagttcttaa taga 24
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatggaacac caccttac 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaattacag cacgagtc 18
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctgttgaga tggaacacca cctt 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctccttgag aatgtcaggc atgg 24

Claims (4)

1. 一种用于检测马来西亚大虾病毒MrPV-4的引物组，其特征在于，所述引物组以SEQID NO.2所示核苷酸序列为靶基因；所述引物组为巢氏PCR引物或荧光定量PCR引物，所述巢氏PCR引物的引物序列依次如SEQ ID NO.3～6所示，所述荧光定量PCR引物的引物序列依次如SEQ ID NO.7～8所示；所述马来西亚大虾病毒MrPV-4的基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 权利要求1所述引物组在制备检测MrPV-4的产品中的应用，其特征在于，所述马来西亚大虾病毒MrPV-4的基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
3. 一种马来西亚大虾病毒MrPV-4的检测试剂盒，其特征在于，含有检测SEQ ID NO.2所示靶基因的引物组；所述引物组为巢氏PCR引物或荧光定量PCR引物，所述巢氏PCR引物的引物序列依次如SEQ ID NO.3～6所示，所述荧光定量PCR引物的引物序列依次如SEQ IDNO.7～8所示；所述马来西亚大虾病毒MrPV-4的基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
4. 根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含含有SEQ ID NO.2所示靶基因序列的阳性重组质粒作为阳性对照。
CN202111089485.2A 2021-09-16 2021-09-16 马来西亚大虾病毒的检测试剂盒 Active CN114369683B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111089485.2A CN114369683B (zh) 2021-09-16 2021-09-16 马来西亚大虾病毒的检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111089485.2A CN114369683B (zh) 2021-09-16 2021-09-16 马来西亚大虾病毒的检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114369683A CN114369683A (zh) 2022-04-19
CN114369683B true CN114369683B (zh) 2023-07-25

Family

ID=81137919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111089485.2A Active CN114369683B (zh) 2021-09-16 2021-09-16 马来西亚大虾病毒的检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114369683B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003272230A1 (en) * 2002-08-20 2004-03-11 University Of Maryland Method using real-time pcr
CN108531657A (zh) * 2018-05-09 2018-09-14 鲁东大学 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的荧光定量pcr检测引物组及检测试剂盒
CN109536642A (zh) * 2018-12-19 2019-03-29 长江大学 一种通用型猪丁型冠状病毒巢式rt-pcr检测方法
CN109735659A (zh) * 2019-02-20 2019-05-10 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种利用rpa检测克氏原螯虾小rna病毒的引物及试剂盒与检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114369683A (zh) 2022-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108893551B (zh) 一种检测花生高油酸含量的分子标记方法及应用
CN112048572B (zh) 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒
CN111321248A (zh) 非洲猪瘟病毒mgf-505r基因荧光pcr检测试剂、试剂盒及其应用
CN113736923A (zh) 一种用于猫Chapparvovirus实时荧光定量PCR检测的引物及试剂盒
CN110724762B (zh) 一种非洲猪瘟病毒的lamp检测引物及检测方法
CN113789413B (zh) 一种同时检测百合五种病毒的引物对、探针、试剂盒以及方法
CN111471776A (zh) 虾肝肠胞虫检测试剂盒及其检测方法
CN113755565A (zh) 一种用于鉴别非洲猪瘟野毒与疫苗毒株的四重定量荧光探针引物组合、试剂盒及鉴别方法
CN114369683B (zh) 马来西亚大虾病毒的检测试剂盒
CN110396558B (zh) 一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式pcr扩增引物及试剂盒
CN112011647A (zh) 一种lamp法检测水产病原用内参质控引物组及其应用
CN111118130B (zh) 快速鉴别罗氏沼虾性别的方法
CN112029868B (zh) 三疣梭子蟹微卫星标记及在生长性状关联分析中的应用
CN114369681B (zh) 一种用于检测双顺反子病毒-3的产品及方法
CN114369682B (zh) 淡水长臂大虾小rna病毒的检测方法
CN114369608B (zh) 一种白脚虾小rna病毒基因及其应用
CN113278707A (zh) 一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物及其应用
CN112195257A (zh) 一种检测副溶血弧菌的引物组、试剂、试剂盒及检测方法
CN114369607B (zh) 一种用于检测罗氏沼虾病毒MrPV-1的靶基因、引物及其应用
CN113249504B (zh) 牛源大肠杆菌检测引物探针组合、试剂盒及应用
CN117737298B (zh) 同时鉴别不同基因型禽传染性支气管炎病毒的多重pcr引物、检测试剂、方法及应用
CN116804225B (zh) 一种齐氏罗非鱼性染色体特异分子标记、检测引物、试剂盒及其用途
CN113322353B (zh) 一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的rpa试剂盒
CN108165640B (zh) 一种与哺乳仔猪腹泻抗性或易感性相关的snp位点及分子标记检测和应用
CN112725459B (zh) 与中国对虾耐高pH相关的SNP标记的核心序列、引物及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant