CN111778363B

CN111778363B - 检测对虾虹彩病毒的引物组及含有该引物组的试剂盒

Info

Publication number: CN111778363B
Application number: CN202010883027.5A
Authority: CN
Inventors: 葛辉; 周宸; 林琪; 吴建绍
Original assignee: Fisheries Research Institute Of Fujian (fujian Aquatic Disease Prevention Center)
Current assignee: Fisheries Research Institute Of Fujian (fujian Aquatic Disease Prevention Center)
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2040-08-28
Also published as: CN111778363A

Abstract

本发明公开了一种检测对虾虹彩病毒的引物组及含有该引物组的试剂盒，属于水产病原生物检测试剂技术领域。本发明检测对虾虹彩病毒的引物组，根据SEQ ID No:1所示核酸序列设计。本发明引物组灵敏度高、特异性好；使用本申请的引物组检测对虾虹彩病毒不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。

Description

检测对虾虹彩病毒的引物组及含有该引物组的试剂盒

技术领域

本发明属于水产病原生物检测试剂技术领域，具体涉及一种检测对虾虹彩病毒的引物组及含有该引物组的试剂盒。

背景技术

对虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV)是2014年在浙江严重死亡的南美白对虾上发现的，感染SHIV的症状表现为失色、肝胰腺断裂、空肠空胃、软壳等；对感染虹彩病毒后对虾组织病理学观察发现，病虾表皮上皮细胞(鳃、胃内层甚至遍布全身)呈现典型的虹彩病毒的感染症状；造血组织，触角腺上皮组织，以及心脏、肌肉、皮下组织、鳃、肝胰腺中的结缔组织细胞和吞噬细胞也被虹彩病毒感染。目前对于该病的传染源和传播途径等尚不清楚；尚无特效药物，盲目使用消毒、杀虫、杀藻等刺激性大的药物反而使病势更猛，病程更长，死亡数更多。

水产病原的快速诊断，对水产养殖的良种选育，疾病预防、进出口检疫、水产品食品安全等方面具有重大意义。当前，水产病原防治中常见的病原检测方法包括组织病理切片观察、病毒分离培养、抗原血清反应、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、核酸杂交技术和一般聚合酶链反应(PCR)技术等。目前的检测方法均存在依赖精密仪器、检测成本高、灵敏性和特异性差，操作程序繁琐，难以推广等缺点；而且常规的病原检测技术大都不适合养殖基层的现场快速检测。

LAMP技术是一种新的DNA扩增方法，该技术依赖于自动循环的链置换反应，通过识别靶序列上6个特异区域的引物和具有链置换的DNA聚合酶，在等温条件下，不到1h就能扩增出10⁹靶序列拷贝，具有特异、灵敏、快速、简便等特点，与普通PCR、荧光定量PCR技术相比，LAMP的优点突出：(1)不需要昂贵的精密仪器，恒温状态即可；(2)扩增效率高，能够获得大量扩增产物；(3)具有高特异性；(4)通过添加Loop引物，可以加快反应，缩短一半的时间；(5)因扩增产生大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀，肉眼即可观察结果。因而，可以检测水产经济动物体内的病原菌、病毒、寄生虫和真菌等病原生物，适合于养殖基层的现场快速检测。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测对虾虹彩病毒的引物组及含有该引物组的试剂盒，用本发明引物组检测对虾虹彩病毒，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本发明引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

检测对虾虹彩病毒的引物组，所述引物组序列为：

F3：5’-CGGGAGATGGTGTTAGATGG-3’；

B3：5’-CGTTGCTTGATCGGCATC-3’；

FIP：5’-GCCCAATACGAATCGTTTCCCGTAGTCATGGATGAACCAAATGC-3’；

BIP：5’-TGTTCCAACGAGGAAAGGAAACGTGCTGGAAGCTTGTTGCA-3’；

LF：5’-CCTTTAACGTTCCCGAACTGA-3’；

或

F3：5’-CCCCAACATTGAAATCAGAG-3’；

B3：5’-TTTGCCTTTTTACCCGTAAT-3’；

FIP：5’-CCTGTCCAAAATAGAATGACCTTGTATTATTTTCTAGATCAGGCCAGT-3’；

BIP：5’-AGAGGGAAATAACGGGAAAACGGGAGATGTGTTGAATTTAATTGCA-3’；

LF：5’-TGTGATTTCCACCAACGAATACA-3’；

LB：5’-CGTTATTTGAGAAAATGTTGGGAA-3’；

或

F3：5’-CCATGGATAAAAATTTCACAGAA-3’；

B3：5’-ACGGTAAAGCTGAGATTTCC-3’；

FIP：5’-TCACACTTCCTGATAGTCTTCCATCCGAAATGGTAAAACCCCT-3’；

BIP：5’-GCCAGAGATTGTAACGGTAGCTAGATGGATACACTGATCTTCGA-3’；

LB：5’-CTTCGTACCGAAACGAAAACGA-3’。

上述引物组在制备对虾虹彩病毒检测试剂中的应用。

一种对虾虹彩病毒检测试剂盒，包含上述的至少一组引物组。

在上述方案的基础上，所述对虾虹彩病毒的检测试剂盒，还包含反应缓冲液、BstDNA聚合酶、钙黄绿素、dNTPs、ddH₂O(RNase-free)和阳性对照。

在上述方案的基础上，所述的阳性对照为含有SEQ ID No:1所示核酸序列的T克隆载体。

在上述方案的基础上，使用上述试剂盒检测对虾虹彩病毒时，反应温度为63℃，反应时间为60min。

本发明的有益效果：

本发明的引物组是根据对虾虹彩病毒基因中的一段序列SEQ ID No:1，采用PrimerExploer V4软件设计的3套LAMP特异性引物组合，分别记为SHIV-1、SHIV-2、SHIV-3，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和一条或两条环引物(LF和/或LB)。

基于上述引物组，本发明采用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisotherm amplification，LAMP)用于检测对虾虹彩病毒，经特异性和灵敏度验证，结果显示，三套引物组对水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、对虾肝肠胞虫、镰刀真菌以及虾核酸均无非特异性扩增，SHIV-1和SHIV-2最低检出限为10ag/μL-100ag/μL，SHIV-3最低检出限为100ag/μL-1fg/μL。

附图说明

图1三组引物初步扩增结果；

图2SHIV-1引物组灵敏性检测结果；

图3SHIV-2引物组灵敏性检测结果；

图4自然光下SHIV-2引物组灵敏性检测结果(从左到右各管内的模板依次为：1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL、水)；

图5紫外光下SHIV-2引物组灵敏性检测结果(从左到右各管内的模板依次为：1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL、水)；

图6SHIV-3引物组灵敏性检测结果；

图7SHIV-1引物组特异性检测结果；

图8SHIV-2引物组特异性检测结果；

图9自然光下SHIV-2引物组特异性检测结果(从左到右各管内的模板依次为：阳性质粒、水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、对虾肝肠胞虫、镰刀真菌、虾核酸)；

图10紫外光下SHIV-2引物组特异性检测结果(从左到右各管内的模板依次为：阳性质粒、水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、对虾肝肠胞虫、镰刀真菌、虾核酸)；

图11SHIV-3引物组特异性检测结果。

具体实施方式

本发明中的试样可以采用分离自感染实验等中所用的细胞和其培养液或者来自活体的标本和培养细胞等含对虾虹彩病毒的样本，也可以来自于被怀疑感染对虾虹彩病毒生物的活体样本，这些试样可以进行分离、抽提、浓缩、纯化等预处理。

使用本发明的引物进行核酸扩增检测时所需的各种试剂可以事先组合而试剂盒化，具体来说，作为本发明的引物或环引物所需的各种寡聚核酸、作为核酸合成底物的4种dNTP、进行核酸合成的DNA聚合酶、提供适合于酶反应的条件的缓冲液和盐类、阳性对照核酸、使酶和模板稳定化的保护试剂以及根据需要采用的反应生成物的检测所需的试剂以试剂盒的形式提供。

实施例1

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

1、引物的设计与合成

根据序列SEQ ID No:1采用PrimerExplorer V4软件设计LAMP引物，具体采用的设计原则为：选取内引物FIP/BIP的Tm值在65℃左右，外引物F3/B3的温度为60℃左右，FIP/BIP的5′端dataG值小于等于-4kcal/mol，F3/B3的3′端dataG值小于等于-4kcal/mol，GC含量在40％-60％之间，引物扩增片段在200bp左右的引物作为初筛引物，在上述设计原则的基础上，本领域技术人员可以根据经验进行取舍；本发明设计了三组引物分别记为SHIV-1、SHIV-2、SHIV-3，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和一条或两条环引物(LF和/或LB)。

Lamp引物组核苷酸序列分别如下：

SHIV-1

F3：5’-CGGGAGATGGTGTTAGATGG-3’(SEQ ID No:2)；

B3：5’-CGTTGCTTGATCGGCATC-3’(SEQ ID No:3)；

FIP：5’-GCCCAATACGAATCGTTTCCCGTAGTCATGGATGAACCAAATGC-3’(SEQ ID No:3)；

BIP：5’-TGTTCCAACGAGGAAAGGAAACGTGCTGGAAGCTTGTTGCA-3’(SEQ ID No:5)；

LF：5’-CCTTTAACGTTCCCGAACTGA-3’(SEQ ID No:6)；

SHIV-2

F3：5’-CCCCAACATTGAAATCAGAG-3’(SEQ ID No:7)；

B3：5’-TTTGCCTTTTTACCCGTAAT-3’(SEQ ID No:8)；

FIP：5’-CCTGTCCAAAATAGAATGACCTTGTATTATTTTCTAGATCAGGCCAGT-3’(SEQ ID No:9)；

BIP：5’-AGAGGGAAATAACGGGAAAACGGGAGATGTGTTGAATTTAATTGCA-3’(SEQ ID No:10)；

LF：5’-TGTGATTTCCACCAACGAATACA-3’(SEQ ID No:11)；

LB：5’-CGTTATTTGAGAAAATGTTGGGAA-3’(SEQ ID No:12)；

SHIV-3

F3：5’-CCATGGATAAAAATTTCACAGAA-3’(SEQ ID No:13)；

B3：5’-ACGGTAAAGCTGAGATTTCC-3’(SEQ ID No:14)；

FIP：5’-TCACACTTCCTGATAGTCTTCCATCCGAAATGGTAAAACCCCT-3’(SEQ ID No:15)；

BIP：5’-GCCAGAGATTGTAACGGTAGCTAGATGGATACACTGATCTTCGA-3’(SEQ ID No:16)；

LB：5’-CTTCGTACCGAAACGAAAACGA-3’(SEQ ID No:17)。

本发明的引物组序列均是由上海生工生物工程有限公司合成。

2、对虾虹彩病毒阳性质粒的构建

本发明中的阳性质粒是将SEQ ID No:1所示核酸序列构建到克隆载体pMD18-T中，转化、筛选获得的。

3、引物的初步筛选

将SHIV-1、SHIV-2、SHIV-3引物组合分别以制备的对虾虹彩病毒的阳性质粒、虾血细胞虹彩病毒和水为模板，在63℃下进行LAMP反应60分钟，其中，各引物的用量分别为FIP、BIP 40pmol，F3、B3 5pmol，环引物20pmol；反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。

LAMP反应体系(25μL)为：

其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。

结果如图1所示：加入FD的三套引物均可检测出阳性质粒和虾血细胞虹彩病毒，对阴性对照水没有扩增；其中SHIV-2引物组在大约10min时，对阳性质粒有扩增，在大约15min时对虾血细胞虹彩病毒具有扩增；SHIV-1引物组在大约15min时，对阳性质粒有扩增，在大约25min时对虾血细胞虹彩病毒具有扩增；SHIV-3引物组在大约15min时，对阳性质粒有扩增，在大约25min时对虾血细胞虹彩病毒具有扩增；SHIV-2引物组可以在更短的时间内扩增出阳性质粒和虾血细胞虹彩病毒，接下来对三套引物组进行特异性和灵敏性的检测。

4、灵敏度检测

将上述合成的SHIV阳性质粒依次稀释为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL等浓度梯度，用作灵敏度试验。

分别采用SHIV-1、SHIV-2、SHIV-3引物组，分别以1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL浓度的虾血细胞虹彩病毒的阳性质粒为模板，水作为阴性对照；25μL体系中加入模板2μL，在LAMP实时浊度仪上63℃反应60分钟。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。

试验结果如图2-6所示：

对于SHIV-1和SHIV-2引物组，当阳性质粒含量在1ng/μL～100ag/μL均能检测到扩增，阴性对照未见扩增，可见SHIV-1和SHIV-2引物组的最低检测限为100ag/μL～10ag/μL，即最低检出限为23.8copies/μL-2.38copies/μL。

对于SHIV-3引物组，当阳性质粒含量在1ng/μL～1fg/μL均能检测到扩增，阴性对照未见扩增，可见SHIV-3引物组的最低检测限为1fg/μL～100ag/μL，即最低检出限为238copies/μL-23.8copies/μL。

5、特异性试验

分别采用SHIV-1、SHIV-2、SHIV-3引物组，在添加FD的条件下，分别以对阳性质粒、水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、对虾肝肠胞虫、镰刀真菌、虾核酸为模板，在63℃下进行LAMP反应60分钟。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。

结果如图7-11所示：SHIV-1、SHIV-2和SHIV-3引物组对阳性质粒能够有效检测出，而对水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、对虾肝肠胞虫、镰刀真菌、虾核酸等都未检测出，特异性良好。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）

<120> 检测对虾虹彩病毒的引物组及含有该引物组的试剂盒

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213> 对虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 1

atggtagaat ctcaggaagt gttttacaat ccagaatttt acaacttgtt aaataaaaat 60

cccaatttga tcgcattcaa gaacggtgta tacgatttcg aaaatgatgt tttcagggat 120

ggaagtccag aagattatct ttcagttaaa ctcccaatcg attacattga ctacggcacg 180

attgatcatc ccgaagttat cgcagtagac aactttttcc aaaaggtatt ccccaacatt 240

gaaatcagag attattttct agatcaggcc agttttgtat tcgttggtgg aaatcacaac 300

aaggtcattc tattttggac aggagaggga aataacggga aaacggtaac tcaaacgtta 360

tttgagaaaa tgttgggaaa gtttgcaatt aaattcaaca catctctgat tacgggtaaa 420

aaggcaaaca tgggagctgc aagtcccgaa ttggccaggg cgggagatgg tgttagatgg 480

gcagtcatgg atgaaccaaa tgctgacgaa atcatcagtt cgggaacgtt aaagggtctc 540

acgggaaacg attcgtattg ggctcgagat ttgttccaac gaggaaagga aacgaaagaa 600

attataccct ttttcaaatt acacatgatt tgcaacaagc ttccagcaat caaggatgcc 660

gatcaagcaa cgtggaatcg aatcagggtt attccattcg aaagtacatt caaacatgaa 720

aacgattgcc ccgttgaatt tgaagaacaa atgaaacaga aaacattccc catggataaa 780

aatttcacag aaaagattcc cgaaatggta aaacccctgg cttggtatct tattcagaga 840

tggaagacta tcaggaagtg tgaaattgta gagccagaga ttgtaacggt agctacatct 900

tcgtaccgaa acgaaaacga tatttacaag caattcgaag atcagtgtat ccatcaagag 960

aaaaatggaa atctcagctt taccgtttta tattcagtat tcaaggattg gttcaaagaa 1020

gagtatccta atatgaccat cccaatcaga caaacgatca gaaaacattt catttccaaa 1080

tttggacaac ttgagagagg tagatggaag aactttatat gcaagaagga cgaagacgac 1140

tttggtcggg atagtgatga agatggtgac gatgttgtga atcccgctct tttagtttaa 1200

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 2

cgggagatgg tgttagatgg 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 3

cgttgcttga tcggcatc 18

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 4

gcccaatacg aatcgtttcc cgtagtcatg gatgaaccaa atgc 44

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 5

tgttccaacg aggaaaggaa acgtgctgga agcttgttgc a 41

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 6

cctttaacgt tcccgaactg a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 7

ccccaacatt gaaatcagag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 8

tttgcctttt tacccgtaat 20

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 9

cctgtccaaa atagaatgac cttgtattat tttctagatc aggccagt 48

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 10

agagggaaat aacgggaaaa cgggagatgt gttgaattta attgca 46

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 11

tgtgatttcc accaacgaat aca 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 12

cgttatttga gaaaatgttg ggaa 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 13

ccatggataa aaatttcaca gaa 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 14

acggtaaagc tgagatttcc 20

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 15

tcacacttcc tgatagtctt ccatccgaaa tggtaaaacc cct 43

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 16

gccagagatt gtaacggtag ctagatggat acactgatct tcga 44

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)

<400> 17

cttcgtaccg aaacgaaaac ga 22

Claims

1.检测对虾虹彩病毒的引物组，其特征在于，所述引物组序列为：

F3：5’-CGGGAGATGGTGTTAGATGG-3’；

B3：5’-CGTTGCTTGATCGGCATC-3’；

FIP：5’-GCCCAATACGAATCGTTTCCCGTAGTCATGGATGAACCAAATGC-3’；

BIP：5’-TGTTCCAACGAGGAAAGGAAACGTGCTGGAAGCTTGTTGCA-3’；

LF：5’-CCTTTAACGTTCCCGAACTGA-3’；

或

F3：5’-CCCCAACATTGAAATCAGAG-3’；

B3：5’-TTTGCCTTTTTACCCGTAAT-3’；

FIP：5’-CCTGTCCAAAATAGAATGACCTTGTATTATTTTCTAGATCAGGCCAGT-3’；

BIP：5’-AGAGGGAAATAACGGGAAAACGGGAGATGTGTTGAATTTAATTGCA-3’；

LF：5’-TGTGATTTCCACCAACGAATACA-3’；

LB：5’-CGTTATTTGAGAAAATGTTGGGAA-3’。

2.权利要求1所述引物组在制备对虾虹彩病毒检测试剂中的应用。

3.一种对虾虹彩病毒检测试剂盒，包含权利要求1所述的至少一组引物组。

4.根据权利要求3所述对虾虹彩病毒的检测试剂盒，其特征在于，还包含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、钙黄绿素、dNTPs、ddH₂O(RNase-free)和阳性对照。

5.根据权利要求4所述对虾虹彩病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为含有SEQ ID No:1所示核酸序列的T克隆载体。