CN116287453A - 一种基于重组酶的十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于重组酶的十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，涉及生物检测技术领域。所述十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒包括一种引物对和探针组合，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑5所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的试剂盒操作简便，检测时间短，特异性好，灵敏度高，仅需普通恒温设备就可以实现十足目虹彩病毒Ⅰ型的快速检测，适用于基础实验室及虾苗养殖场的现场快速检测，可以有效对十足目虹彩病毒Ⅰ型进行早期监控及日常检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种基于重组酶的十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒。
背景技术
虾类疫病的传统检测方法是PCR(polymerase chain reaction)，但该方法需要专用扩增仪器，不适合基层及现场快速检测。近来，愈来愈多操作简便、检测周期短的分子生物检测技术广泛应用于十足目虹彩病毒Ⅰ型(DIV1)，其中，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)发展较为迅速。该技术无需造价高昂的升降温仪器，在恒温条件下10min内即可完成核酸扩增，反应快速而灵敏，扩增产物可以通过构建荧光探针法进行实时定量检测，也可以与DNA芯片、琼脂糖凝胶电泳、侧流层析试纸条等多种检测技术相结合进行检测，适合基层实验室及一线口岸的现场检测。
尹伟力等根据十足目虹彩病毒Ⅰ型的ATP酶基因保守序列设计特异性引物，通过条件优化，建立基于重组酶聚合酶扩增技术的十足目虹彩病毒Ⅰ型检测方法，该方法特异、灵敏，但是需要借助凝胶成像仪观察结果。张徐俞等根据已发表的DIV1的MCP基因保守序列，设计探针和引物，建立了RPA-Cas12a快速检测方法，该方法需要利用荧光定量PCR仪进行扩增。Qian-jun Huang等根据发表的DIV1的MCP基因保守序列，设计探针和引物，建立了RPA快速检测方法，需要荧光定量PCR仪。Tong Guixiang等根据十足目虹彩病毒Ⅰ型的ATP酶基因保守序列设计特异性引物，建立了RPA快速检测方法，该方法需要借助凝胶成像仪观察结果。黄俊等根据MCP基因设计特异性引物和探针，建立RPA快速检测方法，需要用到荧光定量PCR仪。
目前已经公布的基于重组酶的十足目虹彩病毒Ⅰ型检测方法均需借助荧光定量PCR仪或者凝胶成像仪等仪器，不适合基础实验室及虾苗养殖场的现场快速检测。
因此，亟需建立一种操作简便，检测时间短，特异性好，灵敏度高，仅需普通恒温设备的十足目虹彩病毒Ⅰ型检测方法，适用于基础实验室及虾苗养殖场的现场快速检测，从而可以有效对十足目虹彩病毒Ⅰ型进行早期监控及日常检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于重组酶的十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的试剂盒操作简便，检测时间短，特异性好，灵敏度高，仅需普通恒温设备就可以实现十足目虹彩病毒Ⅰ型的快速检测。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种检测十足目虾虹彩病毒Ⅰ型的引物对和探针组合，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述探针的5’端修饰FAM基团，3’端修饰C3Spacer基团，5’端的30bp和31bp碱基由一个THF隔开。
本发明还提供上述的引物对和探针组合在制备十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，包括上述的引物对和探针组合。
进一步地，所述十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒还包括阳性质控质粒。
进一步地，所述阳性质控质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地，所述十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒还包括Abuffer、ddH2O和醋酸镁。
进一步地，所述十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒的反应体系为：Abuffer 29.4μL、10μM上游引物2μL、10μM下游引物2μL、10μM探针0.6μL、ddH2O 11.5μL、模板2μL和醋酸镁2.5μL。
进一步地，所述十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒的反应温度为39℃，反应时间为10min。
本发明公开了以下技术效果：
本发明根据十足目虹彩病毒Ⅰ型保守序列ATP酶基因设计了一对特异性引物，基于重组酶聚合酶扩增技术，建立了一种操作简便，检测时间短，特异性好，灵敏度高，仅需普通恒温设备的十足目虹彩病毒Ⅰ型的检测试剂盒，该检测试剂盒适用于基础实验室及虾苗养殖场的现场快速检测，可以有效对十足目虹彩病毒Ⅰ型进行早期监控及日常检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为阴性验证结果；其中，1-8为8个重复；A为引物SHIV-F1、SHIV-R1和探针SHIV-PB组合；B为引物SHIV-F1、SHIV-R2和探针SHIV-PB组合；C为引物SHIV-F1、SHIV-R3和探针SHIV-PB组合；
图2为特异性实验结果；其中，1～8分别为白斑综合征病毒(WWSV)、致急性肝胰腺坏死病弧菌(VAHPND)、虾肝肠胞虫(EHP)、传染性皮下造血器官坏死病毒病(IHHNV)、罗氏沼虾双顺反子病毒(MrTV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、罗氏沼虾黄病毒(MrFV)；A为引物组(1)；B为引物组(2)；C为引物组(3)；
图3为灵敏性试验结果；其中，1～10分别为109～100copies/μL的阳性质粒，N为阴性对照；A为引物组(2)；B为引物组(3)；
图4为重组酶聚合酶扩增技术检测攻毒后不同时间点实验虾肝胰腺中SHIV结果；1～5分别为攻毒后12、24、48、72、96h的DNA，N为阴性对照。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1.引物设计
根据GenBank已发表的十足目虹彩病毒Ⅰ型的ATP酶基因(KY681040)保守序列，参照重组酶聚合酶扩增技术引物设计要求，用primerprimier5软件设计上、下游引物各3条以及探针1条，用于病毒核酸的扩增及检测，探针序列见表1：
表1试剂盒所用引物及探针序列
2.阴性验证
引物及探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成引物探针首先进行阴性测试，选取一条上游引物SHIV-F1与3条下游引物及探针进行组合试验，每组重复8个反应，以排除因引物探针的原因形成假阳性。
反应体系如下：每个干粉反应管(潍坊安普未来生物科技有限公司)加入29.4μL反应缓冲液(质量百分浓度3％的聚乙二醇；Tris 30mM；)，2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针(引物和探针浓度为10μM)，13.5μL ddH2O，最后向反应管中加入2.5μL醋酸镁(magnesium acetate，280mM)，充分混合后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中39℃孵育10min；反应结束后，取10μL加入含有190μL ddH2O的离心管中，混合均匀后，将胶体金试纸条的样品端插入离心管中平衡，5min内观察质控线与检测线判读结果(图1)。结果显示上游引物SHIV-F1、下游引物SHIV-R1与探针SHIV-PB组合进行阴性试验，结果为阴性，其余2组组合出现假阳性，因此挑选下游引物SHIV-R1分别与3条上游引物及探针进行后续试验。
3.阳性质控质粒的制备
选择病毒ATP酶基因部分核酸片段用于合成质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，片段长度为586bp(SEQ ID NO.8)，连接载体为pUC57(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，抗性为Amp抗性，用NanoDrop 1000超微量分光光度计测定质粒浓度，并进行十倍梯度稀释，得到109～100copies/μL 10个浓度，随后保存于-20℃备用。
SEQ ID NO.8(5’-3’)：
GATCGCATTCAAGAACGGTGTATACGATTTCGAAAATGATGTTTTCAGGGATGGAAGTCCAGAAGATTATCTTTCAGTTAAACTCCCAATCGATTACATTGACTACGGCACGATTGATCATCCCGAAGTTATCGCAGTAGACAACTTTTTCCAAAAGGTATTCCCCAACATTGAAATCAGAGATTATTTTCTAGATCAGGCCAGTTTTGTATTCGTTGGTGGAAATCACAACAAGGTCATTCTATTTTGGACAGGAGAGGGAAATAACGGGAAAACGGTAACTCAAACGTTATTTGAGAAAATGTTGGGAAAGTTTGCAATTAAATTCAACACATCTCTGATTACGGGTAAAAAGGCAAACATGGGAGCTGCAAGTCCCGAATTGGCCAGGGCGGGAGATGGTGTTAGATGGGCAGTCATGGATGAACCAAATGCTGACGAAATCATCAGTTCGGGAACGTTAAAGGGTCTCACGGGAAACGATTCGTATTGGGCTCGAGATTTGTTCCAACGAGGAAAGGAAACGAAAGAAATTATACCCTTTTTCAAATTACACATGATTTGCAACAAGCTTCCAGCAATCAAG。
4.特异性试验
利用DNA提取试剂盒(QIAGEN，160037560)分别提取白斑综合征病毒(WWSV)、致急性肝胰腺坏死病弧菌(VAHPND)、虾肝肠胞虫(EHP)和传染性皮下造血器官坏死病毒病(IHHNV)的DNA；利用RNA提取试剂盒(QIAGEN，74104)分别提取罗氏沼虾双顺反子病毒(MrTV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)和罗氏沼虾黄病毒(MrFV)的病毒RNA，并反转录为cDNA。以上述DNA和cDNA作为模板，3条上游引物分别与下游引物SHIV-R1进行组合(如表2所示)，进行检测，检测体系为：每个干粉反应管加入29.4μL A buffer，2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针(引物和探针浓度为10μM)，11.5μL ddH2O，2μL模板，最后向反应管中加入2.5μL醋酸镁。反应程序及结果判断方法参照“2.阴性验证”部分。
特异性实验结果见图2，结果显示，引物组(1)扩增上述模板会出现假阳性，引物组(2)及引物组(3)扩增上述模板未出现假阳性，表明引物组(2)和引物组(3)特异性好。
表2
| 引物组 | 组合 |
| 引物组(1) | SHIV-F1、SHIV-R1与探针SHIV-PB |
| 引物组(2) | SHIV-F2、SHIV-R1与探针SHIV-PB |
| 引物组(3) | SHIV-F3、SHIV-R1与探针SHIV-PB |
5.灵敏性试验
以“3.阳性质控质粒的制备”中倍比稀释的重组质粒作为模板，分别使用引物组(2)和引物组(3)进行重组酶聚合酶扩增技术反应，以确定该方法的灵敏性。反应体系及程序参照“4.特异性试验”，其中模板使用量为1μL。结果显示(图3)，引物组(2)的检测下限为105copies，引物组(3)的检测下限是10copies，因此选择引物组(3)，即SHIV-F3、SHIV-R1与探针SHIV-PB的组合。
6.临床样品的检测
用十足目虹彩病毒Ⅰ型对罗氏沼虾进行攻毒，分别于攻毒后12、24、48、72、96h取实验虾的肝胰腺组织，提取组织DNA，测定DNA浓度，并用ddH2O将DNA浓度调整至100ng/μL，分别采用荧光定量PCR方法(Qiu L，Chen M M，Wan X Y，et al.Detection andquantification of Shrimp hemocyte iridescent virus by TaqMan probe basedreal-timePCR，Journal of Invertebrate Pathology(2018)，doi：https：//doi.org/10.1016/j.jip.2018.04.005)及本发明建立的重组酶聚合酶扩增技术对各DNA模板进行检测。
本发明重组酶聚合酶扩增反应体系为：每个干粉反应管加入29.4μL Abuffer，2μL上游引物SHIV-F3、2μL下游引物SHIV-R1和0.6μL探针SHIV-PB(引物和探针浓度为10μM)，11.5μL ddH2O，2μL模板，最后向反应管中加入2.5μL醋酸镁，反应程序及结果观察方法同“2.阴性验证”。结果显示(表3和图4)，用两种方法在5个时间点实验虾肝胰腺组织中均检出DIV1阳性。
表3荧光定量PCR方法检测攻毒后不同时间点实验虾肝胰腺中DIV1结果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种检测十足目虾虹彩病毒Ⅰ型的引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的引物对和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰FAM基团，3’端修饰C3Spacer基团，5’端的30bp和31bp碱基由一个THF隔开。
3.一种如权利要求1或2所述的引物对和探针组合在制备十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒中的应用。
4.一种十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物对和探针组合。
5.根据权利要求4所述的十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒还包括阳性质控质粒。
6.根据权利要求5所述的十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
7.根据权利要求4所述的十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒还包括Abuffer、ddH2O和醋酸镁。
8.根据权利要求7所述的十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒的反应体系为：Abuffer29.4μL、10μM上游引物2μL、10μM下游引物2μL、10μM探针0.6μL、ddH2O11.5μL、模板2μL和醋酸镁2.5μL。
9.根据权利要求8所述的十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒的反应温度为39℃，反应时间为10min。
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