CN111187862A

CN111187862A - 一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒

Info

Publication number: CN111187862A
Application number: CN202010166165.1A
Authority: CN
Inventors: 吕孙建; 刘莉; 张海琪; 袁雪梅; 于喆; 刘琼瑶
Original assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2040-03-11
Also published as: CN111187862B

Abstract

本发明公开了一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，包括以下组分：(1)阳性质粒；(2)核酸释放剂；(3)干粉试剂反应管；(4)R buffer；(5)B buffer；(6)胶体金试纸条。本发明灵敏度高，而且操作简便快捷，填补了目前尚无大口黑鲈弹状病毒核酸分子检测方法的空白，适合大口黑鲈弹状病毒的确诊、筛查和预防。

Description

一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及水生动物病毒检测领域，特别涉及一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides)，俗称加州鲈鱼、黑鲈，隶属鲈形目、鲈亚目、太阳鱼科、黑鲈属，原产于北美洲，是一种世界性的游钓鱼类。中国台湾省于上世纪七十年代末从国外引进此鱼，并于1983年人工繁殖获得成功，经过30多年的养殖发展，现已推广到全国20余个省市，主要养殖区域为广东、江西、江苏和浙江等地。大口黑鲈肉质细嫩、无肌间刺，蛋白质丰富，历来深受消费者青睐，在饲养成本基本相同的情况下，与其他常规鱼类相比，市场价格更高，是增加渔民收入的优良品种。2018年全国养殖产量约43万吨，已成为我国重要的养殖品种。

近几年，受养殖规模扩大、养殖密度升高及池塘老化等因素的影响，大口黑鲈绿色疾病防控技术的开发逐渐成为该行业健康可持续发展的瓶颈问题。据已有的文献报道，目前大口黑鲈的主要疾病以病毒性及细菌性疾病为主，其中病毒性病原主要包括弹状病毒(Micropterus salmoides Rhabdovirus，MSRV)和虹彩病毒。大口黑鲈弹状病毒病为新发的病毒性疾病，于2011年在广东地区发现，该病毒属弹状病毒科，目前已知该病毒在大口黑鲈的亲鱼及幼苗中有检测发现，且主要在大口黑鲈的幼苗阶段发病，死亡率高达80％以上，严重时可达100％。携带病毒的苗种很容易在饲养方式改变、投放外塘、天气变化较大等外界因素的影响下，发生爆发性死亡现象，给苗种企业和养殖户带来巨大经济损失。由此可见，提供无病毒的苗种对于提高大口黑鲈养殖成活率具有非常重要的意义。

病原早期诊断检测在防止病原传播上具有极其重大的意义，目前常用的诊断技术包括聚合酶链式反应技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)、核酸探针技术、环介导恒温扩增技术技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、酶联免疫吸附技术以及病原培养法检测技术等。这些诊断技术各有优点和适用范围，对检测条件及操作者都有较高的要求。方便、快速的病原检测技术对于水产养殖基层苗种检疫及及时针对性用药具有重要意义。近几年，已有多种水产养殖重要病原的LAMP快速检测方法被建立并应用，如罗非鱼无乳链球菌、大鲵虹彩病毒、对虾白斑综合征病毒及传染性皮下及造血器官坏死病毒等病原的LAMP快速检测系统。尽管如此，LAMP技术对操作人员仍然有一定的要求，且易出现假阳性。

相比较其他病原诊断技术，重组酶介导的恒温扩增技术(Recombinant enzymemediated isothermal nucleic acid amplification，RAA)是近年发展起来最接近常温(37℃)的核酸恒温扩增新技术，并在人类传染病、动物疫病等领域得到了很好的应用效果。该技术不论是在反应系统还是产物判定上都有很大改进和创新，相比LAMP技术引物设计更加简单，反应更加迅速、检测灵敏度更高，同时结果判定可结合免疫金标试纸条技术，1-2分钟便可完成扩增产物的特异性检测，避免了LAMP等技术利用肉眼观察沉淀可能产生的主观误差。其工作原理是采用从细菌、真菌或病毒中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，一般在37℃或者室温下反应5-15分钟即可得到与传统升降温PCR相同数量级的目的片段。该技术的整个操作可快速提样本DNA、无需任何精密仪器、避免开管进行产物鉴定、可凭肉眼判定结果，并简化步骤、缩短反应时间等优点。该技术应用范围广泛，目前已被尝试开发用于植物、人源或畜禽动物来源病原微生物的检测，检测病原微生物涵盖DNA病毒、RNA病毒、寄生虫及细菌等。

由于大口黑鲈病毒性疾病爆发急、死亡率高，而目前其病毒病的诊断还是以常规的PCR检测为主，需要花费大量的时间，检测反馈往往滞后，难以形成有效的防控。该问题对大口黑鲈的苗种影响尤为严重，一是容易导致携带病毒性病原的鱼苗流入市场，二是容易错过病毒防治的最佳时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，该试剂盒特异性强，灵敏度高，而且操作简便快捷，填补了目前尚无大口黑鲈弹状病毒核酸分子检测方法的空白，适合大口黑鲈弹状病毒的确诊、筛查和预防。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，包括以下组分：(1)阳性质粒；(2)核酸释放剂；(3)干粉试剂反应管；(4)R buffer；(5)B buffer；(6)胶体金试纸条；所述干粉试剂反应管内装有含重组酶的反应液，所述含重组酶的反应液包括以下组分：

重组酶200ng/μL，单链DNA结合蛋白220ng/μL，DNA聚合酶100ng/μL，辅助蛋白80ng/μL，核酸内切酶100ng/mL，上游引物10μM，下游引物10μM，探针10μM。

本发明针对大口黑鲈弹状病毒设计特异性扩增引物，以及特定的重组酶扩增体系，使得检测特异性强，灵敏度高，而且操作简便快捷。

阳性质粒选择病毒糖蛋白基因的核酸片段(SEQ ID No.4)用于合成质粒，阳性质粒长度为414bp，连接载体为pUC57，抗性为Amp抗性，使用时1-10pg/μL作为阳性模板。

所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示。

所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。

所述探针的序列如SEQ ID No.3所示。

所述探针的5’端具有荧光素标记，3’端磷酸化修饰。

所述下游引物的5’端具有生物素标记。

所述R buffer包括以下组分：质量百分浓度3％的聚乙二醇，Tris 30mM。

所述B buffer包括以下组分：280mM醋酸镁。

本发明的有益效果是：

本发明在新发现的大口黑鲈弹状病毒特异性核酸序列基础上，应用一种基于重组酶介导等温核酸扩增及胶体金显色检测大口黑鲈弹状病毒，检测结果特异，易于判断，可用于大口黑鲈弹状病毒病的确诊。

本发明的试剂盒特异性强，灵敏度高，而且操作简便快捷，填补了目前尚无大口黑鲈弹状病毒核酸分子检测方法的空白，适合大口黑鲈弹状病毒的确诊、筛查和预防。

附图说明

图1是胶体金试纸条的结构图和操作方法。

图2是不同稀释度MSRV阳性样品核酸扩增的电泳图。M：DL2000 Marker；N：Negative；1为阳性样品稀释至10^-1倍；2为阳性样品稀释至10^-2倍；3为阳性样品稀释至10^-3倍；4为阳性样品稀释至10^-4倍。

图3是不同稀释度MSRV阳性样品核酸扩增的电泳图。M：DL2000 Marker；N：Negative；1为阳性样品稀释至10^-4倍；2为阳性样品稀释至10^-5倍；3为阳性样品稀释至10^-6倍。

图4是不同MSRV阳性样品核酸扩增的试纸条检测图。N：Negative；1为1号阳性样品原核酸提取成品；2为2号阳性样品原核酸提取成品；3为3号阳性样品原核酸提取成品；3-1、3-2、3-3和3-4分别为3号阳性样品核酸提取成品稀释至10^-1、10^-2、10^-3和10^-4倍。红色箭头指示的为阳性检出。

图5是不同稀释度MSRV阳性样品核酸扩增的试纸条检测图。N：Negative；3-5、3-6、3-7、3-8和3-9分别为3号阳性样品核酸提取成品稀释至10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9倍。红色箭头指示的为阳性检出。

图6是不同病毒拷贝数阳性质粒的试纸条检测结果。N：Negative；1为100fg/μL阳性质粒；2为10fg/μL阳性质粒；3为1fg/μL阳性质粒。

图7是不同病毒拷贝数阳性质粒的试纸条检测结果。N：Negative；1为1fg/μL阳性质粒；2为0.1fg/μL阳性质粒；3为0.01fg/μL阳性质粒。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

重组酶(重组酶RecA)、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白(重组酶辅助聚集蛋白)、核酸内切酶(核酸内切酶IV)均购自潍坊安普未来生物科技有限公司。

实施例：

一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，包括以下组分：

(1)阳性质粒；

(2)超快速核酸释放剂(通用型，购自潍坊安普未来生物科技有限公司)250μL 1管；

(3)干粉试剂反应管(重组酶200ng/μL，单链DNA结合蛋白220ng/μL，DNA聚合酶100ng/μL，辅助蛋白80ng/μL，核酸内切酶100ng/mL，上游引物10μM，下游引物10μM，探针10μM)48份；

(4)R buffer(质量百分浓度3％的聚乙二醇，Tris 30mM)1.2mL 2管；

(5)B buffer(280mM醋酸镁)150μL 1管；

(6)胶体金试纸条48份(购自潍坊安普未来生物科技有限公司)。

特异性引物设计：

大口黑鲈弹状病毒为单链RNA病毒，根据该病毒基因组信息(Genbank，MK397811)设计引物和探针，经生物信息学方法分析后用primer primier5软件设计1条探针和1对引物，用于病毒核酸扩增和检测，扩增目的条带大小为234bp。探针序列见表1：

表1试剂盒所用引物及探针序列

THF：四氢呋喃，为碱基类似物，作为核酸内切酶的识别位点；C3Spacer：3’端磷酸化修饰，作为3’block，封闭用。5’生物素标记，作为试纸条反应用。

试剂盒使用方法：

1)阳性质粒样品：选择病毒糖蛋白基因以下核酸片段用于合成质粒(北京擎科生物科技有限公司)，质粒长度为414bp，连接载体为pUC57，抗性为Amp抗性，使用时1-10pg/μL作为阳性模板。

5’-3’：

AGTCTTAAAAGGAGGAAAATGTGCAAGTACCGTTTGCCCACTCGAAATGCATGGAGGAATTTGGATACCCAGTGAGGCACCCAGGGAGAGTTGCCAACTGGGCAGCAGCATCACCAGCCACATCAATCCCAACAACGCATCCAGGTTAATATCAGAGGAAAGTTATTTGGTCACAGAGTATCATAGACAACTGCCGTTCTTGGGAGCTTGTAGGATGTCAATGTGCGGAGAGGTGGGAATGAGGTTTAAGTCCGGAGAATGGTACAAAATTGAGTCAAGCGACGGACGGGTGCTGTCCTTTCTCAGTAGTGTTCCAATGTGTGATGGAGAGTTGACTGTCTCCATCCATGACGGCTCAGCTACGTATCACAAATTGAGCCAGGAAATCCTTGATCTGTCCGCACAAATCGCCTG(SEQ ID No.4)。

2)待测样品RNA的提取：将病毒感染的大口黑鲈肝脏、脾脏、肾脏和脑组织混合匀浆，取20-30mg匀浆加入100-200μL PCR-grade H₂O，作为待检样品；取200μL无菌PCR管加入5μL核酸释放剂(超快速核酸释放剂(通用型)，用于提取组织RNA)溶液，再加入20μL待检样本，轻柔混匀；将混合后样本液的PCR管置于金属浴/水浴中：95℃孵育5mins；取出样本在室温平衡3mins，10000rpm室温离心2mins；上清液直接进行后续扩增程序。

3)重组酶介导的恒温扩增：每个干粉反应管加入45μL R buffer，向反应管中依次加入2.5μL步骤2)得到的核酸模板，最后向反应管中加入2.5μL B buffer并充分混匀(对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧，上下颠倒反应管8-10次混匀)；混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中42℃孵育8-12mins。

4)试纸条检测：根据检测数量取出相应的胶体金试纸条，在吸收垫上做好标记，每根试纸条只能做一个检测；取8-10μL步骤3)得到的核酸扩增产物加至含有190μL PCR-grade H₂O的微孔板或离心管中，混匀；将试纸条的样品垫向下插入微孔板或离心管中，3-5分钟后即记录判读区检测结果；记录检测结果后，将试纸条密封后丢弃在安全处。

5)结果判断(图1)：阳性：试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区(ControlLine，C线)，一条位于检测区(Test Line，T线)。阳性结果表明样本中含有待检测的目的核酸片段，其含量大于等于试纸条最低检出量。阴性：试纸条质控区(C线)出现一条红色条带，检测区(T线)没有条带。阴性结果表明样本中不含待检测目的核酸或者其含量低于试纸条最低检出量。无效：试纸条质控区(C线)和检测区(T线)均未出现条带。此结果提示所使用试纸条失效、损坏或操作有误。

具体样品检测实例，实施方法参考上述使用方法，其中本次测试用的病毒阳性质粒用PCR-grade H₂O稀释成100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL和0.01fg/μL 5个病毒拷贝浓度梯度后进行扩增和检测；1号、2号和3号样品分别为不同采集日期的MSRV阳性病样(2018年4月19日、2018年4月21日和2019年5月5日采集自浙江湖州某养殖场)，样品RNA提取参考步骤2进行；3号样品提取的RNA用PCR-grade H₂O稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-66个浓度梯度后进行扩增和检测。

检测结果：

图2为实例中不同稀释度病毒核酸扩增的电泳检测结果。结果显示，引物对MSRV-F和MSRV-R在对稀释至10^-1、10^-2、10^-3和10^-4的样品检测时均能扩增出目的条带。

图3为实例中不同稀释度病毒核酸扩增的电泳检测结果。结果显示，MSRV-F和MSRV-R引物对基础实验可扩增出条带的模板极限浓度为样本稀释至10^-4倍，10^-5和10^-6稀释度下未能检测到阳性反应。

图4为实例中不同阳性样品病毒核酸扩增的试纸条检测结果。引物MSRV-F和MSRV-R与探针MSRV-PB均可检出3份不同的阳性样本，且3号样品稀释至10^-4浓度时仍然可检测到。

图5为实例中3号阳性样品不同稀释度病毒核酸扩增的试纸条检测结果。引物MSRV-F和MSRV-R与探针MSRV-PB可检测到该样品稀释至10^-7浓度。

图6为实例中不同病毒拷贝数阳性质粒的试纸条检测结果。结果显示引物对MSRV-F1和MSRV-R2与探针MSRV-PB可检测出1fg/μL浓度的合成质粒。

图7为实例中不同病毒拷贝数阳性质粒的试纸条检测结果。结果显示引物对MSRV-F1和MSRV-R2与探针MSRV-PB可检测出1fg/μL浓度的合成质粒。未能检出0.1fg/μL和0.01fg/μL病毒拷贝数的阳性质粒。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省淡水水产研究所

<120> 一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒

<130> 2020.02

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ttgcccactc gaaatgcatg gaggaatttg 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

ttgtaccatt ctccggactt aaacctcatt c 31

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

ccaggttaat atcagaggaa agttatttgg tccagagtat catagac 47

<210> 4

<211> 414

<212> DNA

<213> 大口黑鲈弹状病毒（Micropterus salmoides Rhabdovirus）

<400> 4

agtcttaaaa ggaggaaaat gtgcaagtac cgtttgccca ctcgaaatgc atggaggaat 60

ttggataccc agtgaggcac ccagggagag ttgccaactg ggcagcagca tcaccagcca 120

catcaatccc aacaacgcat ccaggttaat atcagaggaa agttatttgg tcacagagta 180

tcatagacaa ctgccgttct tgggagcttg taggatgtca atgtgcggag aggtgggaat 240

gaggtttaag tccggagaat ggtacaaaat tgagtcaagc gacggacggg tgctgtcctt 300

tctcagtagt gttccaatgt gtgatggaga gttgactgtc tccatccatg acggctcagc 360

tacgtatcac aaattgagcc aggaaatcct tgatctgtcc gcacaaatcg cctg 414

Claims

1.一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：(1)阳性质粒；(2)核酸释放剂；(3)干粉试剂反应管；(4)R buffer；(5)B buffer；(6)胶体金试纸条；

所述干粉试剂反应管内装有含重组酶的反应液，所述含重组酶的反应液包括以下组分：

2.根据权利要求1所述的一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述探针的序列如SEQ ID No.3所示。

5.根据权利要求1所述的一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述探针的5’端具有荧光素标记，3’端磷酸化修饰。

6.根据权利要求1所述的一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述下游引物的5’端具有生物素标记。

7.根据权利要求1所述的一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述R buffer包括以下组分：质量百分浓度3％的聚乙二醇，Tris 30mM。

8.根据权利要求1所述的一种基于重组酶的大口黑鲈弹状病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述B buffer包括以下组分：280mM醋酸镁。