CN112899404A - 鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对及其应用和检测方法 - Google Patents

鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对及其应用和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鳜蛙虹彩病毒的Nested‑RAA检测引物对及其应用和检测方法，所述检测引物对包括一对外侧引物对和一对内侧引物对。本发明的检测方法在原有一步法RAA的基础上大大提高了检测灵敏度，提高了临床检出率和重复率，最低检测浓度可达3.37×10‑14ng，可在30min内完成检测反应。且与临床常见水生病毒和细菌病未发生交叉反应，在鳜蛙虹彩病毒的快速检测中具有明显的优势，适用于临床快速检测，具有广泛的应用前景。

Description

鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对及其应用和检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA扩增引物对、该扩增引物对在制备检测鳜蛙虹彩病毒的试剂盒中的应用，以及检测方法。
背景技术
鳜鱼(桂花鱼)属传统的高档淡水养殖品种，因其经济回报率高，已成为重点推广鱼种之一。据《中国渔业统计年鉴2020》的数据，广东鳜鱼养殖量10.6万吨，居国内首位。但是鳜鱼的养殖业面临着病害频发的威胁，据不完全统计，因病害造成了鱼种养殖过程中约30％-50％的损耗率。
鳜鱼病毒性疾病包括：鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidneynecrosis virus,ISKNV)、鳜蛙虹彩病毒(Mandarin ranavirus,MRV)、鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)、神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)等病毒。其中，鳜蛙虹彩病毒(MRV)是继ISKNV之后发现的危害鳜鱼养殖的最为严重的病毒。
MRV是虹彩病毒科、蛙虹彩病毒属的DNA病毒，基因大小约100kb。关于该病毒的最早的报道是在2017年广东省杂交鳜上发现，并在鳜MFF-1细胞系上成功分离纯化，该病毒可造成20-60％死亡率，病程可持续2-4个月不等，病鱼多呈偏瘦畸形，体表出血点或溃疡，明显腹水等。
但是到目前为止，MRV还没有商品化疫苗，这就使(早期)快速诊断变得尤为重要。现在MRV的检测主要是针对主要衣壳蛋白(MCP)基因的PCR检测方法，此外还有针对MCP的real-time PCR方法和基于抗MRV多克隆抗体的免疫组化和免疫荧光检测方法。但是PCR、real-time PCR等方法仅适用于实验室检测，对检测条件要求高、反应时间长，限制了其在现场检测中的应用。
重组酶介导等温扩增技术(Recombinase-acidAmplification,RAA)是近年发展起来的，利用重组酶蛋白与引物形成复合物，促进引物与双链DNA的同源靶序列结合，聚合酶进行后续的合成。该技术对模板要求低，整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可，不需要高温变性和低温退火，操作简单，不需要昂贵的仪器，极其适用于基层检验机构、养殖场等快速检测。但是，目前RAA检测绝大部分是利用一对引物实现临床样品的检测，存在灵敏度低、重复性差、检出率低等问题。目前国内外尚无采用RAA技术检测MRV报道。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对，该检测引物对可以实现鳜蛙虹彩病毒的高灵敏性和高检出率。
实现上述目的的具体技术方案如下：
一种鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对，所述引物对为两对，分别为外侧引物对和内侧引物对，
所述外侧引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述内侧引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
在其中一些实施例中，所述外侧引物对和内侧引物对在扩增体系中的浓度为200nM～800nM。
在其中一些实施例中，所述外侧引物对和内侧引物对在扩增体系中的浓度均为200nM。
本发明的另一目的是提供上述Nested-RAA检测引物对在制备检测鳜蛙虹彩病毒的试剂盒中的应用。
在其中一些实施例，所述试剂盒包括有两对Nested-RAA扩增引物对，分别为外侧引物对和内侧引物对，
所述外侧引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述内侧引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
在其中一些实施例中，所述外侧引物对和内侧引物对在扩增体系中的浓度均为200nM。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括DNA重组酶蛋白反应buffer、Mg2+溶液、阳性质粒对照品。
本发明的还一目的在于提供鳜蛙虹彩病毒的检测方法。
实现上述目的的具体技术方案如下：
一种鳜蛙虹彩病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)、提取得到待检测样品的DNA；
(2)、配制扩增体系，扩增体系中包括有DNA重组酶蛋白反应buffer、Mg2+溶液、阳性质粒对照品和两对Nested-RAA检测引物对，所述检测引物对为：序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的外侧引物，以及序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内侧引物；
(3)、以外侧引物对为引物，待检测样品的DNA为模板，进行第一次扩增反应；
(4)、以内侧引物对为引物，第一次扩增反应的反应产物为模板，进行第二次扩增反应。
在其中一些实施例中，所述外侧引物对和内侧引物对在扩增体系中的浓度为200nM～800nM。
在其中一些实施例中，所述外侧引物对和内侧引物对在扩增体系中的浓度均为200nM。
在其中一些实施例中，步骤(3)和(4)所述扩增反应的反应温度为35-42℃，反应时间为10min-60min。
在其中一些实施例中，所述扩增反应的反应温度为37℃，反应时间为30min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从3条上游引物和3条下游引物出发，通过不断地组合筛选，筛选到两对对鳜蛙虹彩病毒检测效果很好的引物对(包含外侧引物对SEQ ID NO.1-SEQID NO.2，以及内侧引物对SEQ ID NO.3-SEQID NO.4)，采用Nested-RAA扩增技术，进一步通过优化调整两组引物对在反应体系中的浓度，并优化了扩增反应的反应条件，取得了很好的扩增效果，在原有一步法RAA的基础上大大提高了检测灵敏度，提高了临床检出率和重复率，最低检测浓度可达3.37×10-14ng，可在30min内完成检测反应。且与临床常见水生病毒和细菌病未发生交叉反应，在鳜蛙虹彩病毒的快速检测中具有明显的优势，适用于临床快速检测，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中阳性质粒PCR鉴定结果；
图2为实施例1中引物筛选结果；
图3为实施例2中扩增反应条件摸索结果；
图4为实施例3中的特异性试验结果；
图5为实施例4中的灵敏度试验结果；
图6为现有的一步法RAA的灵敏度试验结果；
图7为实施例5中采用本发明的检测方法对临床样品的检测结果；
图8为实施例5中采用现有的一步法RAA检测方法对临床样品的检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明所涉及的病毒来源：鳜蛙虹彩病毒(MRV)由广东省农业科学院动物卫生研究所水产病害研究室分离并保存，取100μL攻毒细胞上清，利用病毒DNA提取试剂盒提取基因组DNA作为扩增模板。神经坏死病毒(NNV)cDNA、真鲷虹彩病毒(Red Seabreamiridovirus,RSIV)DNA、花鲈虹彩病毒(Lateolabrax maculatus iridovirus，LMIV)DNA、虾虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV)DNA、虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)DNA、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)DNA、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)DNA、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)DNA、鯴鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)DNA由本实验室保存。
为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对的筛选
1、引物设计
根据Nested-RAA引物设计原则，针对MRV主衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因序列设计6条引物(如表1所示)，交生工生物工程(上海)股份有限公司，进行引物合成，并用无菌ddH2O稀释至10μmol/L备用。
表1针对MRV MCP基因序列设计的引物列表
Figure BDA0002979228660000061
Figure BDA0002979228660000071
2、阳性对照品制备
根据MRV NH-1609株基因组序列(GenBankNo.MG941005.1)，设计MCP基因ORF扩增引物(MRV MCP-F：5’-ATGTCTTCTGTTACGGGTTCTG-3’,SEQ ID NO.7)；MRV MCP-R:5’-TTACAGGATGGGGAAACCCATG-3’,SEQ ID NO.8)。以制备的MRV基因组DNA为模板，擎科高保真Taq酶配制如下扩增体系：2×高保真酶buffer 25μL，MRV基因组DNA 2μL,正向引物(SEQ IDNO.7)1μL，反向引物(SEQ ID NO.8)1μL,ddH2O 21μL，在98℃预变性5min；98℃变性10s,55℃退火10s,72℃延伸30s,35个循环；72℃延伸5min条件下，PCR扩增MRV MCP基因全序。PCR产物在1％琼脂糖凝胶跑胶，结果扩增到1392bp的目的片段(图1)。切胶回收目的片段，与pMD18-T载体16℃连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布Amp+LA平板，37℃倒置培养，待长出单菌落，PCR方法挑选阳性单克隆菌落。送北京擎科生物技术有限公司测序验证，提取阳性质粒，命名为MCP-T质粒，测序质粒浓度，将质粒DNA进行梯度稀释，作为后续试验的DNA模板及其阳性对照品。
3、引物筛选
以提取的阳性质粒为模板，利用表1的引物，采用杭州众测生物科技有限公司RAA基础扩增试剂盒进行MRVNested-RAA扩增。
扩增体系参照试剂盒说明书，第一轮扩增反应：50μL体系加入41.5μLDNA重组酶蛋白反应buffer，2.5μLMg2+溶液，2μL上游引物(SEQ ID NO.1)，2μL下游引物(SEQ ID NO.2)，2μLMCP-T质粒，37℃反应10min。
第一轮扩增反应产物取2μL作为第二轮反应的模板，第二轮扩增反应：50μL体系加入41.5μLDNA重组酶蛋白反应buffer，2.5μLMg2+溶液，2μL上游引物(SEQ ID NO.3)，2μL下游引物(SEQ ID NO.4)，2μL模板，37℃反应30min。
扩增结果如图2所示，其中，M：DNAMarker 2,000；泳道1:以F911(SEQ ID NO.1)/R1079(SEQ ID NO.6)为外侧引物，F911(SEQ ID NO.1)/R1052(SEQ ID NO.4)为内侧引物扩增结果；泳道2:以F911(SEQ ID NO.1)/R1079(SEQ ID NO.6)为外侧引物，F911(SEQ IDNO.1)/R1066(SEQ ID NO.2)为内侧引物扩增结果；泳道3:以F911(SEQ ID NO.1)/R1079(SEQ ID NO.6)为外侧引物，F918(SEQ ID NO.5)/R1079(SEQ ID NO.6)为内侧引物扩增结果；泳道4:以F911(SEQ ID NO.1)/R1079(SEQ ID NO.6)为外侧引物，F947(SEQ ID NO.3)/R1079(SEQ ID NO.6)为内侧引物扩增结果；泳道5:以F911(SEQ ID NO.1)/R1066(SEQ IDNO.2)为外侧引物，F911(SEQ ID NO.1)/R1052(SEQ ID NO.4)为内侧引物扩增结果；泳道6:以F911(SEQ ID NO.1)/R1066(SEQ ID NO.2)为外侧引物，F918(SEQ ID NO.5)/R1066(SEQID NO.2)为内侧引物扩增结果；泳道7:以F911(SEQ ID NO.1)/R1066(SEQ ID NO.2)为外侧引物，F947(SEQ ID NO.3)/R1066(SEQ ID NO.2)为内侧引物扩增结果；泳道8:以F911(SEQID NO.1)/R1066(SEQ ID NO.2)为外侧引物，F918(SEQ ID NO.5)/R1052(SEQ ID NO.4)为内侧引物扩增结果；泳道9:以F911(SEQ ID NO.1)/R1066(SEQ ID NO.2)为外侧引物，F947(SEQ ID NO.3)/R1052(SEQ ID NO.4)为内侧引物扩增结果；泳道10:以F918(SEQ IDNO.5)/R1066(SEQ ID NO.2)为外侧引物，F918(SEQ ID NO.5)/R1052(SEQ ID NO.4)为内侧引物扩增结果；泳道11:以F918(SEQ ID NO.5)/R1066(SEQ ID NO.2)为外侧引物，F947(SEQID NO.3)/R1066(SEQ ID NO.2)为内侧引物扩增结果；泳道12:以F918(SEQ ID NO.5)/R1066(SEQ ID NO.2)为外侧引物，F947(SEQ ID NO.3)/R1052(SEQ ID NO.4)为内侧引物扩增结果。
各扩增体系均有单一目的条带。考虑第9泳道，以F911(SEQ ID NO.1)/R1066(SEQID NO.2)为外侧引物，F947(SEQ ID NO.3)/R1052(SEQ ID NO.4)为内侧引物条带特异，且产物量高，后续以F911(SEQ ID NO.1)/R1066(SEQ ID NO.2)为外侧引物，F947(SEQ IDNO.3)/R1052(SEQ ID NO.4)为内侧引物建立MRVNested-RAA检测方法。
实施例2鳜蛙虹彩病毒的检测方法中不同反应条件的摸索
1、引物浓度
采用杭州众测生物科技有限公司RAA基础扩增试剂盒，利用步骤3筛选到最佳反应引物，以步骤3配制一扩体系，取一扩产物2μL为二扩反应模板，50μL体系分别加入4μL终浓度800nM的上下游引物(SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4)、2μL终浓度400nM的上下游引物(SEQID NO.3及SEQ ID NO.4)、1μL终浓度200nM的上下游引物(SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4)，37℃进行Nested-RAA扩增30min，扩增产物经PCR清洁后，取7μL清洁后的PCR产物于2％琼脂糖凝胶跑胶，观察结果如图3所示，其中M：DNAMarker DL2,000；泳道1：50μL体系加4μL引物；泳道2：50μL体系加2μL引物；泳道3：50μL体系加1μL引物；泳道4：50μL体系加0.5μL引物；结果显示加入终浓度200nM内侧引物F947(SEQ ID NO.3)/R1052(SEQ ID NO.4)仍能扩增到特异性高亮条带，因此MRV Nested-RAA检测方法选择200nM引物对浓度最为MRV Nested-RAA体系最佳引物浓度条件。
2反应时间摸索
采用杭州众测RAA基础扩增试剂盒，利用步骤3筛选到最佳反应引物，50μL体系，在37℃条件下，Nested-RAA分别扩增10min、20min、30min、60min，取7μL清洁后的PCR产物于2％琼脂糖凝胶跑胶，观察结果如图3所示。其中，M：DNAMarker DL2,000；泳道5：50μL体系加2μL引物，反应10min；泳道6：50μL体系加2μL引物，反应20min；泳道7：50μL体系加2μL引物，反应30min；泳道8：50μL体系加2μL引物，反应60min；结果显示扩增10min后就能扩增到目的条带，随着时间延长，扩增条带逐一变亮，扩增产物越多。因此Nested-RAA37℃反应10min及以上，就能扩增到目的产物，30min为MRV Nested-RAA检测方法的最佳反应时间。
3反应温度摸索
采用杭州众测Nested-RAA基础扩增试剂盒，利用步骤3筛选到最佳反应引物，50μL体系，分别在35℃、37℃、38℃、42℃进行Nested-RAA扩增30min，扩增产物经PCR清洁后，取7μL清洁后的PCR产物于2％琼脂糖凝胶跑胶，观察结果如图3所示，其中，M：DNAMarker DL2,000；泳道9：50μL体系加2μL引物,35℃反应30min；泳道10：50μL体系加2μL引物,37℃反应30min；泳道11：50μL体系加2μL引物,38℃反应30min；泳道12：50μL体系加2μL引物,42℃反应30min。结果显示35℃、37℃、42℃进行Nested-RAA扩增均能扩增到特异性条带，其中37℃条件下Nested-RAA扩增条带最亮，因此选择37℃反应条件为MRVNested-RAA检测方法的最佳反应温度。
综上，本发明的鳜蛙虹彩病毒的检测方法中，采用200nM引物对浓度，37℃反应30min，效果最佳。
实施例3特异性试验
以水生动物常见病毒：神经坏死病毒(NNV)cDNA、真鲷虹彩病毒(Red Sea breamiridovirus,RSIV)DNA、花鲈虹彩病毒(Lateolabrax maculatus iridovirus，LMIV)DNA、虾虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV)DNA、虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)DNA、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)DNA为模板，进行MRVNested-RAA检测方法的交叉反应特异性检验，以实施例1筛选到的最佳引物，50μL扩增体系加入2μL扩增模板，最佳反应条件进行Nested-RAA扩增，扩增产物经PCR清洁后，取7μL清洁后的PCR产物于2％琼脂糖凝胶跑胶，观察结果如图4所示。其中，泳道1:RSIV；泳道2:KHV；泳道3:EHP；泳道4:SHIV；泳道5:NNV；泳道6:LMIV；+:MRV MCP-T质粒；-:阴性对照；结果显示与6种病毒DNA均没有交叉性反应。
以水生动物常见细菌：嗜水气单胞菌(A.hydrophila)DNA、无乳链球菌(S.agalactiae)DNA、鯴鱼诺卡氏菌(N.seriolae)DNA为模板，进行MRVNested-RAA检测方法的交叉反应特异性检验，以实施例1筛选到的最佳引物，50μL扩增体系加入2μL扩增模板，最佳反应条件进行Nested-RAA扩增，扩增产物经PCR清洁后，取7μL清洁后的PCR产物于2％琼脂糖凝胶跑胶，观察结果如图4所示。其中，泳道7:嗜水气单胞菌；泳道8:鯴鱼诺卡氏菌；泳道9:无乳链球菌；+:MRVMCP-T质粒；-:阴性对照；结果显示与3种细菌DNA均没有交叉性反应。
实施例4灵敏度对比试验
本发明检测方法的灵敏度试验
以提取阳性质粒为模板，测定质粒浓度为168.5ng/μL，10倍梯度稀释模板质粒，50μL扩增体系加入2μL稀释质粒作为模板，进行不同稀释质粒模板的RAA一扩扩增，以一扩产物2μL为模板，利用实施例1筛选到最佳扩增体系，进行Nested-RAA扩增，扩增产物经PCR清洁后，取7μL清洁后的PCR产物于2％琼脂糖凝胶跑胶，观察结果如图5所示。其中，M：DL2,000；泳道1：稀释至-10-6倍；泳道2：-10-7倍；泳道3：-10-8倍；泳道4：-10-9倍；泳道5：-10-10倍；泳道6：-10-11倍；泳道7：-10-12倍；泳道8：-10-13倍；泳道9：-10-14倍；泳道10：-10-15倍；泳道11：-10-16倍。结果显示稀释10-16倍时，仍能扩增到明显的特异性条带。最低灵敏度可达3.37×10-14ng。
现有技术的一步法RAA检测方法灵敏度试验
以提取阳性质粒为模板，测定质粒浓度为168.5ng/μL，10倍梯度稀释模板质粒，50μL体系加入41.5μLDNA重组酶蛋白反应buffer，2.5μL Mg2+溶液，2μL上游引物(SEQ ID NO.9(MCP 280-F:5’-GCCAACCAGTTTAACAATGACGGTACCATCAG-3’)，2μL下游引物(SEQ ID NO.10)(MCP 530-R:5’-GCGGGCAGGACCCTAGCTCCTGCTTGACCGGT-3’)，2μL梯度稀释模板质粒，1.5μLddH2O，37℃反应30min进行RAA扩增。扩增产物经PCR清洁后，取7μL清洁后的PCR产物于2％琼脂糖凝胶跑胶，观察结果如图6所示。其中，M：DL2,000；泳道1：稀释至-10-1倍；泳道2：-10-2倍；泳道3：-10-3倍；泳道4：-10-4倍；泳道5：-10-5倍；泳道6：-10-6倍；泳道7：-10-7倍；泳道8：-10-8倍；泳道9：-10-9倍。结果显示稀释10-9倍时，仍能扩增到明显的特异性条带。最低灵敏度达3.37×10-7ng。
综上，本发明建立的Nested-RAA检测方法比现有的一步法RAA方法的灵敏度高107数量级。
实施例5临床样品检测的检出率对比
取15份阳性MRV攻毒感染加州鲈后提取的组织DNA，采用本发明的检测试剂盒和检测方法进行检测，检测结果如图7所示，检出阳性样品15份，检出率为100％，与PCR方法的符合率为100％。
取7份阳性MRV攻毒感染加州鲈后提取的组织DNA和8份MRV接毒细胞上清提取细胞毒上清DNA。采用现有的一步法RAA检测方法进行检测，结果如图8所示，其中7份阳性组织DNA均未能检测到特异性条带，8份细胞毒DNA均能检测到特异性条带，检出率为53.33％。
综上所述，本发明建立的Nested-RAA检测方法比现有的一步法RAA方法明显具有更高的检出率。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
　　　　　序列表
　　　<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
　　　<120> 鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对及其应用和检测方法
　　　<160> 10
　　　<170> SIPOSequenceListing 1.0
　　　<210> 1
　　　<211> 33
　　　<212> DNA
　　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)
　　　<400> 1
　　　cgctcatgtt tatggtgcaa aacgtcactc aca 33
　　　<210> 2
　　　<211> 33
　　　<212> DNA
　　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)
　　　<400> 2
　　　ggaatagtac tctacgctca tgtctggaag cct 33
　　　<210> 3
　　　<211> 33
　　　<212> DNA
　　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)
　　　<400> 3
　　　ctgtgggttc caactacact tgcgtcactc ctg 33
　　　<210> 4
　　　<211> 33
　　　<212> DNA
　　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)
　　　<400> 4
　　　cgctcatgtc tggaagcctg gtagtgtttt cgt 33
　　　<210> 5
　　　<211> 31
　　　<212> DNA
　　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)
　　　<400> 5
　　　gtttatggtg caaaacgtca ctcacaagtc t 31
　　　<210> 6
　　　<211> 32
　　　<212> DNA
　　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)
　　　<400> 6
　　　gggctgcacc agggaatagt actctacgct ca 32
　　　<210> 7
　　　<211> 22
　　　<212> DNA
　　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)
　　　<400> 7
　　　atgtcttctg ttacgggttc tg 22
　　　<210> 8
　　　<211> 22
　　　<212> DNA
　　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)
　　　<400> 8
　　　ttacaggatg gggaaaccca tg 22
　　　<210> 9
　　　<211> 32
　　　<212> DNA
　　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)
　　　<400> 9
　　　gccaaccagt ttaacaatga cggtaccatc ag 32
　　　<210> 10
　　　<211> 32
　　　<212> DNA
　　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)
　　　<400> 10
　　　gcgggcagga ccctagctcc tgcttgaccg gt 32

Claims (10)

1.一种鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对，其特征在于，所述引物对为两对，分别为外侧引物对和内侧引物对，
所述外侧引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述内侧引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对，其特征在于，所述外侧引物对和内侧引物对在扩增体系中的浓度为200nM～800nM。
3.根据权利要求2所述的鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对，其特征在于，所述外侧引物对和内侧引物对在扩增体系中的浓度均为200nM。
4.权利要求1～3任一项所述的Nested-RAA检测引物对在制备检测鳜蛙虹彩病毒的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括有两对Nested-RAA扩增引物对，分别为外侧引物对和内侧引物对，
所述外侧引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述内侧引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述外侧引物对和内侧引物对在扩增体系中的浓度均为200nM。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA重组酶蛋白反应buffer、Mg2+溶液、阳性质粒对照品。
8.一种鳜蛙虹彩病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、提取得到待检测样品的DNA；
(2)、配制扩增体系，扩增体系中包括有DNA重组酶蛋白反应buffer、Mg2+溶液、阳性质粒对照品和两对Nested-RAA检测引物对，所述检测引物对为：序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的外侧引物，以及序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内侧引物；
(3)、以外侧引物对为引物，待检测样品的DNA为模板，进行第一次扩增反应；
(4)、以内侧引物对为引物，第一次扩增反应的反应产物为模板，进行第二次扩增反应。
9.根据权利要求8所述的鳜蛙虹彩病毒的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)所述扩增反应的反应温度为35-42℃，反应时间为10min-60min。
10.根据权利要求9所述的鳜蛙虹彩病毒的检测方法，其特征在于，所述扩增反应的反应温度为37℃，反应时间为30min。
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