CN111172281B - 非小细胞肺癌多重基因突变检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了非小细胞肺癌多重基因突变检测试剂盒及方法，具体的地，本发明公开了一种多重检测非小细胞肺癌热点基因突变的引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，能够同时检测62种突变类型，本发明的方法和试剂盒具有检测过程简单、可检突变类型多、灵敏度高、样本依赖性小等优点。

Description

非小细胞肺癌多重基因突变检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术和肿瘤诊断领域，具体地说，本发明涉及非小细胞肺癌多重基因突变检测试剂盒及方法。
背景技术
肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症，其中非小细胞肺癌(Non-Small CellLung Cancer，NSCLC)约占所有肺癌的80％。NSCLC存在多种基因突变，包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1等。EGFR基因突变约占10-35％，针对EGFR基因的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，能特异性地抑制具有EGFR基因突变的非小细胞肺癌的生长，改善预后，存在KRAS、BRAF、PIK3CA等基因突变的患者，采用该类抑制剂治疗效果不佳。ALK和ROS1融合基因突变在NSCLC中的发生率分别为3-7％、2％，携带ALK或ROS1突变患者可以从ALK/ROS1抑制剂如克唑替尼中明显受益。KRAS突变患者使用西妥昔单抗进行治疗，疗效不佳，可以从MEK抑制剂如曲美替尼中明显受益，BRAF突变患者可以从RAF抑制剂如达拉非尼和MEK抑制剂联合使用中受益。因此，检测EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1等基因的突变状态对非小细胞肺癌患者进行靶向用药具有重要指导意义，同时可进一步提高预测预后的准确性。
目前基因突变常用的检测方法包括：sanger测序法、荧光PCR法、高分辨溶解曲线法、高通量测序法等。
(1)sanger测序法：检测基因突变需要对待测样品扩增、纯化、测序、序列分析，过程操作繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高，并且由于自身的限制导致其灵敏度不高，仅可检测丰度超过20％的突变，假阴性较多。
(2)荧光PCR法：目前常用的基因突变检测方法，检测灵敏度高，可检出样品中含量低至1％的突变基因，且大幅缩短目标产物的长度，可解决石蜡包埋组织样本提取的DNA片段化的难题，从而获得较为准确的检测结果。荧光PCR法操作简单，能极大的避免扩增产物的污染。但该方法多用于检测单基因突变，多重基因检测在检测位点增多的同时设计难度成倍增加，因此虽然荧光PCR法拥有众多优点，但多重基因突变检测产品极少。
(3)高分辨率溶解曲线分析(HRM)：基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物溶解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确认具体位置，最终需要测序确认。
(4)高通量测序法：高通量测序法价格昂贵，读长大约30-250bp，比Sanger测序短，对序列拼接造成了负担，检测结果仍需要Sanger测序验证，并且对于检测外显子与内含子交界区的小片段缺失的准确性不够。高通量测序法操作繁琐，限制了测序速度。
因此，本领域迫切需要开发能够同时有效检测肿瘤患者多个基因位点突变的技术，以满足临床准确、快捷、低成本的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非小细胞肺癌多重检测试剂盒及方法。
在本发明的第一方面，提供了一种用于多重检测非小细胞肺癌基因突变的引物对集，所述引物对集包括：
第一引物对组(12号管)，所述第一引物对组包括如SEQ ID NO.78所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.81所示的反向引物。
在另一优选例中，所述第一引物对组还包括：如SEQ ID NO.79所示的正向引物。
在另一优选例中，所述第一引物对组还包括：如SEQ ID NO.77所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.80所示的反向引物。
在另一优选例中，所述第一引物对组包括：如SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.78和SEQID NO.79所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第二引物对组(11号管)，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.69所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.73所示的反向引物。
在另一优选例中，所述第二引物对组包括：如SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70、SEQID NO.71和SEQ ID NO.72所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第三引物对组(10号管)，所述第三引物对组包括：如SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第四引物对组(9号管)，所述第四引物对组包括：如SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第五引物对组(8号管)，所述第五引物对组包括：如SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.49所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第六引物对组(7号管)，所述第六引物对组包括：如SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的正向引物；以及，如SEQ IDNO.41所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第七引物对组(6号管)，所述第七引物对组包括：如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第八引物对组(5号管)，所述第八引物对组包括：如SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的正向引物；以及，如SEQ IDNO.9所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第九引物对组(4号管)，所述第九引物对组包括：如SEQ ID NO.24所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.25所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第十引物对组(3号管)，所述第十引物对组包括：如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.8所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第十一引物对组(2号管)，所述第十一引物对组包括：如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：第十二引物对组(1号管)，所述第十二引物对组包括：如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的反向引物。
在另一优选例中，所述第一引物对组、所述第二引物对组、和/或所述第三引物对组还包括第一内标引物对(内标2)，所述第一内标引物对包括：
如SEQ ID NO.86示的正向引物；和，如SEQ ID NO.87所示的反向引物。
在另一优选例中，所述第四引物对组、所述第五引物对组、所述第六引物对组、所述第七引物对组、所述第八引物对组、所述第九引物对组、所述第十引物对组、所述第十一引物对组、和/或所述第十二引物对组还包括第二内标引物对(内标1)，所述第二内标引物对包括：
如SEQ ID NO.83示的正向引物；和，如SEQ ID NO.84所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种多重检测非小细胞肺癌基因突变的探针集，所述探针集包括第一探针组(12号管)，所述探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第二探针组(11号管)，所述第二探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示的突变探针、和核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第三探针组(10号管)，所述第三探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示的突变探针、和核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第四探针组(9号管)，所述第四探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示的突变探针、和核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第五探针组(8号管)，所述第五探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第六探针组(7号管)，所述第六探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示的突变探针、和核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第七探针组(6号管)，所述第七探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的突变探针、和核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第八探针组(5号管和4号管)，所述第八探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第九探针组(3号管)，所述第九探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第十探针组(2号管)，所述第十探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第十一探针组(1号管)，所述第十一探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的突变探针、核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的突变探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的突变探针。
在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.88或SEQ ID NO.85的内控探针。
在另一优选例中，所述突变探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述突变探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述内控探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述内控探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述突变探针标记的荧光报告基团不同于所述内控探针标记的荧光报告基团。
本发明的第三方面，提供了一种多重检测非小细胞肺癌基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器(12号管)，所述第一容器内包含第一引物探针混合液，第一引物探针混合液中包含SEQ ID NO.77-82所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器(11号管)，所述第二容器内包含第二引物探针混合液，第二引物探针混合液中包含SEQ ID NO.69-76所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器(10号管)，所述第三容器内包含第三引物探针混合液，第三引物探针混合液中包含SEQ ID NO.60-68所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第四容器(9号管)，所述第四容器内包含第四引物探针混合液，第四引物探针混合液中包含SEQ ID NO.51-59所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第五容器(8号管)，所述第五容器内包含第五引物探针混合液，第五引物探针混合液中包含SEQ ID NO.44-50所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第六容器(7号管)，所述第六容器内包含第六引物探针混合液，第六引物探针混合液中包含SEQ ID NO.38-43所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第七容器(6号管)，所述第七容器内包含第七引物探针混合液，第七引物探针混合液中包含SEQ ID NO.29-37所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第八容器(5号管)，所述第八容器内包含第八引物探针混合液，第八引物探针混合液中包含SEQ ID NO.26-28、9、12所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第九容器(4号管)，所述第九容器内包含第九引物探针混合液，第九引物探针混合液中包含SEQ ID NO.24、25、12所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第十容器(3号管)，所述第十容器内包含第十引物探针混合液，第十引物探针混合液中包含SEQ ID NO.22、23、8、11所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第十一容器(2号管)，所述第十一容器内包含第十一引物探针混合液，第十一引物探针混合液中包含SEQ ID NO.13-21所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第十二容器(1号管)，所述第十二容器内包含第十二引物探针混合液，第十二引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1-12所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述第一引物探针混合液、所述第二引物探针混合液、和/或所述第三引物探针混合液还包括第一内标(内标2)，所述第一内标包括：如SEQ ID NO.86-88所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述第四引物探针混合液、所述第五引物探针混合液、所述第六引物探针混合液、所述第七引物探针混合液、所述第八引物探针混合液、所述第九引物探针混合液、所述第十引物探针混合液、所述第十一引物探针混合液、和/或所述第十二引物探针混合液还包括第二内标(内标1)，所述第二内标包括：如SEQ ID NO.83-85所示的反向引物。
在另一优选例中，使用PCR用缓冲液(Buffer)配制所述引物探针混合液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第十三容器，所述第十三容器内包含RNA酶系，所述RNA酶系包括逆转录酶、热启动酶、RNA酶抑制剂、和dNTPs。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第十四容器，所述第十四容器内包含DNA酶系，所述DNA酶系包括热启动酶、UNG酶、和dNTPs。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第十五容器，所述第十五容器内包含阳性质控品。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第十六容器，所述第十六容器内包含阴性质控品。
本发明的第四方面，提供了一种多重检测非小细胞肺癌基因突变的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的总核酸样本；
(2)制备PCR反应体系并进行PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述总核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第一PCR反应体系，所述第一PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第一引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第二PCR反应体系，所述第二PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第二引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第三PCR反应体系，所述第三PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第三引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第四PCR反应体系，所述第四PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第四引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第五PCR反应体系，所述第五PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第五引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第六PCR反应体系，所述第六PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第六引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第七PCR反应体系，所述第七PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第七引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第八PCR反应体系，所述第八PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第八引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第九PCR反应体系，所述第九PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第九引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第十PCR反应体系，所述第十PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第十引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第十一PCR反应体系，所述第十一PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第十一引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括第十二PCR反应体系，所述第十二PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和所述第十二引物探针混合液。
在另一优选例中，所述总核酸样本来自多种类型核酸样本，如血液游离核酸、石蜡包埋组织样本、胸腹水等。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括DNA酶系或RNA酶系。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测肿瘤基因突变。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：1号管EGFR基因5种突变检测灵敏度图；
图2：2号管EGFR基因19号外显子缺失突变检测灵敏度图；
图3：3号管EGFR基因L858R突变检测灵敏度图；
图4：4号管EGFR基因T790M突变检测灵敏度图；
图5：5号管EGFR基因20号外显子插入突变检测灵敏度图；
图6：6号管KRAS基因5种突变检测灵敏度图；
图7：7号管KRAS基因3种突变检测灵敏度图；
图8：8号管BRAF基因5种突变检测灵敏度图；
图9：9号管PIK3CA基因5种突变检测灵敏度图；
图10：10号管ALK基因5种突变检测灵敏度图；
图11：11号管ROS1基因6种突变检测灵敏度图；
图12：12号管ROS1基因3种突变检测灵敏度图；
图13：实例3中临床样本检测结果ROS1基因3种突变典型阳性示例(12号管)；
图14：对照共用下游引物1结果示意图；
图15：对照共用下游引物2结果示意图；
图16：对照引物对1结果示意图。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种非小细胞肺癌多重基因突变检测试剂盒及方法，能够一次性检测EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1六种肺癌热点基因的62种突变，本发明的方法和试剂盒具有检测过程简单、可检突变类型多、灵敏度高、样本依赖性小等优点。
本发明提供一种高特异性、高灵敏度的多重肺癌基因突变检测的引物、探针、试剂盒及引物分配方式。本发明通过荧光检测技术，利用新鲜组织样本、石蜡包埋组织样本或胸腹水、血浆样本进行基因突变和融合的检测，具有取材便捷、高特异性、高灵敏度、检测结果重复性好、操作快捷简便等优点，一次性检测肿瘤热点基因突变的62种突变，大大缩短检测时间的同时，提高了灵敏性和准确性，提供了可靠便捷的检测方法。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
多重PCR
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
本发明的目的在于提供肺癌6个基因62种突变多重PCR检测试剂盒，采用12联PCR反应管设计，包括DNA基因突变检测和RNA融合基因检测两个部分。DNA突变检测由12联反应管的1-9号管组成，其中1-5号管由EGFR不同突变位点检测试剂和内控检测试剂组成；6-7号管由KRAS不同突变位点检测试剂和内控检测试剂组成；8号管由BRAF突变检测试剂和内控检测试剂组成；9号管由PIK3CA不同突变位点检测试剂和内控检测试剂组成。RNA融合检测由12联反应管的10-12号管组成，其中10号管由ALK融合检测试剂和内控检测试剂组成；11-12号管由ROS1融合检测试剂和内控检测试剂组成。基因突变和融合检测采用FAM信号指示，内控检测采用VIC信号指示。
本试剂盒检测的突变和融合类型如表1：
表1试剂盒检测的所有突变类型信息
*以上基因信息来源于Cosmic数据库。
本试剂盒组成详见表2和表3，可同时检测62种肿瘤热点基因突变，简化操作，大大缩短检测耗时，对非小细胞肺癌个性化治疗具有指导意义。
表2试剂盒组成
试剂盒所需引物、探针序列如表3：
表3引物、探针及序列号
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优选地，引物及探针序列长度为18-30个碱基；融合基因引物跨融合区域序列；GC含量为40-60％，扩增序列长度为100-350bp；Tm值控制在50-60℃。
优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种或组合多种，优选为FAM荧光基团。
优选地，所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3等任意一种或组合多种，优选为MGB淬灭基团。
本发明的引物设计中，基本按照突变基因突变位置位于3'端第一个碱基，在3'端第2-6位适当引入错配，其余碱基与待测碱基互补，能够显著提高引物特异性。
对特异性引物及探针经大量试验筛选(包括引物和探针)，并对其进行组合、优化、验证，最终优选出组合后不会互相干扰、扩增效率高、特异性好的多重检测最优引探组合。
本发明中，设计了共用上游、下游引物或探针，在识别多个突变位点的同时使用最少引物探针，节约成本。
上述序列组合包含肺癌多重基因突变区域检测所需引物和探针，能够一次性完成62个基因位点的检测。
本试剂盒另一方面提供一种用于检测肺癌基因的引物探针、反应体系、质控品：
表4试剂盒其他组分
优选地，Buffer的组成为0.5-2mol/L Tris-Cl pH 8.8、0.5-3mol/L KCl、0.1-1mol/L(NH4)2SO4、0.5-2mol/L MgCl2，10-20％Tween-20，最优选为1mol/L Tris-Cl pH8.8、1mol/L KCl、0.5mol/L(NH4)2SO4、1mol/L MgCl2、20％Tween-20。
优选地，RNA酶系的组成为逆转录酶2-40U/μL、热启动酶5-40U/μL、RNA酶抑制剂0.1-1μL、dNTPs 5-25mM，最优选为逆转录酶20U/μL、热启动酶15U/μL、RNA酶抑制剂0.5μL、dNTPs 15mM。
本发明所述试剂盒用于判定检测有效标准为：
每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。
本发明所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)提取检测样本中的总核酸，包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、胸腹水或血浆等组织中2-100ng/μL的总核酸。
(2)将酶系加入PCR反应管中，依次加入阴性质控品、检测样本核酸、阳性质控品。
(3)实时荧光PCR反应，程序如下：
第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；
第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；
根据实时荧光PCR扩增仪显示的阳性质控品信号最高荧光值1/20作为阈值线，结合Ct值及荧光曲线判断检测结果。
优选地，仅根据Ct及荧光曲线判断检测结果，简化判定方法。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明适用于新鲜组织、石蜡包埋组织、胸腹水及血浆等多种样本类型，并采用总核酸作为检测样本，相比分别提取DNA及RNA的传统方法，更加简便快捷，易于操作。
(2)试剂采用预分装单管单人份12联管，操作简单，直接添加酶系、样本便可进行检测。
(3)采用特异性引物和新型探针技术，通过双荧光通道检测模式，设定内控基因检测VIC信号，可以在检测突变和融合的同时监控样本核酸质量，提高判定准确性。
(4)将88条序列(包括引物和探针)分组，分装于12联管中，作为12组多重检测体系，使得不同组引物探针之间不会互相干扰。
(5)设计共用的下游引物和探针，使得识别同样多的突变位点的同时，减少引物、探针的数量，有效节约成本。
(6)涵盖EGFR、BRAF、PIK3CA、KRAS四个突变基因，ALK、ROS1两个融合基因，共62种不同突变和融合(见表1)，包括常见基因突变和部分稀有基因突变。相比其他同类产品，本产品检测位点更全，适合的样本类型更多。根据各基因突变和融合的发生率，本发明检测位点覆盖大部分非小细胞肺癌患者。
(7)采用12联管及实时荧光PCR技术，同时检测多种单碱基突变、缺失、插入及融合位点，且各管扩增程序一致，优化后的扩增体系仅需两个阶段共110分钟即可完成，易于操作的同时有效缩短检测时长。
(8)特异性强，100ng/μL野生型核酸不会产生非特异性信号。
(9)灵敏度高，可以检出2ng/μL中1％的基因突变和100ng/μL中10拷贝/μL的融合基因。
(10)判定方法简便，根据实时荧光PCR扩增仪显示的阳性质控品最高荧光值1/20作为阈值线，结合Ct值及荧光曲线判断检测结果，易于理解，易于判定。
(11)各反应管扩增效率相当，阈值统一，方便判读。
本发明适用于肿瘤患者62个肿瘤基因突变位点的检测，是探索非小细胞肺癌高效治疗的一条可行途径，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在新药研发过程中，使用本发明的检测方法获得用作中间结果的基因突变信息，这些基因突变信息可以作为公众健康管理之需，也可以用于肿瘤热点基因突变的研究及靶向新药研发。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
本发明提出一种肺癌多重基因突变和融合检测的方法、引物、探针及试剂盒。具体实施步骤如下：
(1)待测样本核酸模板提取
中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(组织样本可使用粤穗械备20170666号；胸腹水、血浆样本可使用粤穗械备20180628号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取。组织样本提取后的核酸稀释为浓度2-100ng/μL(胸腹水、血浆提取的核酸浓度不少于2ng/μL，可用于检测DNA突变)，纯度应满足A260/A280比值范围在1.7-2.3之间。模板可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。
(2)加样
取DNA酶系3μL依次加入12联PCR反应管的1-9号管中。取RNA酶系3μL依次加入10-12号管中。瞬时离心15s。
分别取5μL阴性质控品、步骤1制备样本核酸模板、阳性质控品，按照表5顺序，依次加入到反应管中。盖紧PCR反应管管盖，充分混匀，瞬时离心10s。
表5荧光PCR加样布局
注：阴控为阴性质控品；阳控为阳性质控品
(3)实时荧光PCR扩增：
设置实时荧光PCR扩增仪同时检测FAM信号和VIC信号。
实时荧光PCR反应程序如下：
第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；
第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；
本发明所述试剂盒判定检测有效标准为：每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。每管VIC通道有明显荧光扩增曲线，且以阳性质控品VIC信号最高荧光值1/20作为阈值线，Ct值小于38，表明核酸模板质量良好。
根据实时荧光PCR扩增仪显示的阳性质控品FAM信号最高荧光值1/20作为阈值线，调整Baseline Start Cycle 3，End Cycle 15，并结合Ct值和荧光曲线判断结果：
a.Ct值小于37，且有明显荧光扩增曲线，则判断为阳性；
b.Ct值大于等于37，或无明显荧光扩增曲线，则判断为阴性。
本实施例提供的多重基因检测试剂盒的组成成分、包装如表6：
表6试剂盒的组成成分、包装及数量
实施例2灵敏度及准确性检测
1-9号反应管灵敏度参考品：总核酸浓度2ng/μL的灵敏度参考品由各检测基因位点质粒DNA或细胞株核酸，与野生型细胞株核酸分别按一定比例混合，混合液的基因突变率为1％。
10-12号反应管灵敏度参考品：总核酸浓度100ng/μL的灵敏度参考品由检测基因位点质粒或细胞株，与野生型细胞株核酸分别按一定比例混合，100ng/μL混合液中含有10拷贝/μL融合基因。
(1)加样
取DNA酶系3μL依次加入12联PCR反应管1-9管中。取RNA酶系3μL依次加入10-12管中。瞬时离心15s。
分别取5μL阴性质控品、灵敏度参考品、阳性质控品，按照表5顺序，依次加入到反应管中。盖紧PCR反应管管盖，充分混匀，瞬时离心10s。
每种灵敏度参考品，5个重复试验。
(2)实时荧光PCR扩增：
设置实时荧光PCR扩增仪同时检测FAM信号和VIC信号。
实时荧光PCR反应程序如下：
第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；
第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；
检测结果的判断：
a.每管VIC通道有明显荧光扩增曲线，且以阳性质控品VIC信号最高荧光值1/20作为阈值线，Ct值小于38，表明核酸模板质量良好。
b.根据实时荧光PCR扩增仪显示的阳性质控品FAM信号最高荧光值1/20作为阈值线，调整Baseline Start Cycle 3，End Cycle 15，并结合Ct值和荧光曲线判断结果。五次检测结果符合率100％。具体检测结果参见图1-图12。
检测结果表明，本发明的非小细胞肺癌检测体系可以一次性准确检测核酸浓度2ng/μL的1％基因突变或100ng/μL中10拷贝/μL融合。
实施例3临床样本检测
检测样本核酸的提取：
(1)临床待测样本核酸模板提取
采集100例临床阴性样本，将已知阳性突变的62例临床样本(每个阳性突变1例)随机混入其中，用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(组织样本可使用粤穗械备20170666号；胸腹水、血浆样本可使用粤穗械备20180628号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取，组织样本提取后的核酸稀释为浓度2-100ng/μL(胸腹水、血浆提取的核酸浓度不少于2ng/μL，可用于检测DNA突变)，纯度应满足A260/A280比值范围在1.7-2.3之间。模板可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。
(2)加样
取DNA酶系3μL依次加入12联PCR反应管1-9号管中。取RNA酶系3μL依次加入10-12号管中。瞬时离心15s。
分别取5μL阴性质控品、步骤1制备样本核酸模板、阳性质控品，按照表5顺序，依次加入到反应管中。盖紧PCR反应管管盖，充分混匀，瞬时离心10s。
(3)实时荧光PCR扩增
设置实时荧光PCR扩增仪同时检测FAM信号和VIC信号。
实时荧光PCR反应程序如下：
第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；
第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；
本发明所述试剂盒用于判定检测有效标准为：每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。每管VIC通道有明显荧光扩增曲线，且以阳性质控品VIC信号最高荧光值1/20作为阈值线，Ct值小于38，表明核酸模板质量良好。
根据实时荧光PCR扩增仪显示的阳性质控品FAM信号最高荧光值1/20作为阈值线，调整Baseline Start Cycle 3，End Cycle 15，并结合Ct值和荧光曲线判断结果。
在所检测的162例的临床样本中(含62例已知阳性基因突变的临床样本)，共检出62例突变，典型阳性示例(12号管)如图13所示。
结果表明本发明检测体系的符合率达到了100％，进一步证明了本发明体系检测的准确性。
本发明取材便捷、高特异性、高灵敏度、准确性高，可满足肺癌基因的快速检测。
对比例1
本发明人在研究过程中，针对各突变位点目标序列筛选了数十对PCR共用引物。这些引物常出现特异性差或扩增效率低等问题。经过多轮筛选，最终筛选出灵敏度和特异性能够满足临床检测需求的引物、探针组合。
例如，针对12号管中ROS1融合基因突变位点，本发明人设计的部分典型引物序列如下：
对照共用下游引物1：TGGAAGAGTATGTATTGC(SEQ ID NO.:89)；
对照共用下游引物2：CTCAGCCAACTCTTTGTCTT(SEQ ID NO.:90)；
具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，分别结合上游引物对及探针进行检测测试。
使用对照共用下游引物1的检测结果如图14所示，检测结果表明该引物对特异性较差。使用对照共用下游引物2的检测结果如图15所示，检测结果表明该引物扩增效率低。
不仅如此，实验中发现部分引物仅能检测组织样本，无法检测胸腹水、血浆样本。
例如，针对3号管中EGFR L858R突变位点，本发明人设计的部分典型引物序列如下：
对照上游引物:1：CAAGATCACAGATTGTGGACG(SEQ ID NO.:91)。
对照下游引物1：AACAATACAGCTAGTGGGAAGG(SEQ ID NO.:92)。
具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，分别结合上游引物对及探针进行检测测试。
使用对照引物对1检测EGFR L858R突变位点的结果如图16所示。检测结果表明该引物对能检测到组织样本，但检测胸腹水、血浆提取的低浓度总核酸时，出现漏检。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学达安基因股份有限公司
<120> 非小细胞肺癌多重基因突变检测试剂盒及方法
<130> 000054
<160> 92
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
aacttgtggt agttggagca t 21
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
caagatttac ctctattgtt ggat 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
aatcattttg tggacgaa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
ccttgacgat acagctaatt cag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
ggtgattttg gtctaggtac aca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgattttggt ctagcgacac aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggtgattttg gtctacctac gaa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
gtgattttgg tctagccaca cac 23
<210> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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aggtgatttt ggtctaggta cacat 25
<210> 49
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<212> DNA
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<400> 49
tagtaactca gcagcatctc agg 23
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<212> DNA
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tcagtttgaa cagttgtctg gat 23
<210> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ctacacgaga tcctctctct aga 23
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<212> DNA
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atcctctctc tgaaatcacg a 21
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<212> DNA
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tcctctctct gaaatcactg ct 22
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<212> DNA
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atgaaacaaa tgaatgatgc tct 23
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gaaacaaatg aatgatgctc g 21
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taatgtgcca actaccaatg 20
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caggtaagtg ctaaaatgga 20
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gcattgaact gaaaagataa ctg 23
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tcttactgga gactcaggtg ga 22
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ggtccccaga caacaagtat 20
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tgatagccgt aataaattgt cg 22
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<211> 22
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ctttgtcaga tgagaaatgg ga 22
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actgtgctaa aggcggct 18
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ggtcactgat ggaggaggtc 20
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agttggggtt gtagtcggtc 20
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gcagagccct gagtacaagc 20
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cctgagtaca agctgagcaa g 21
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gagccctacc agacgat 17
<210> 70
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ttacttctcg gatttctcta ct 22
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<211> 17
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caccattggc tcctgtt 17
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agttgatgct gcggct 16
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gctttctccc actgtattg 19
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<212> DNA
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cactgtcacc ccttcctt 18
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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taaaccaggc attccca 17
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tctggttgtt acaatcccac 20
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ttgataggca tggaccaatg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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aaagacacaa gtggggaaat 20
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<212> DNA
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<400> 79
caggtgctgg atttttctta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cagccaactc tttgtcttcg t 21
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tttcaatctc ctcttgggtt 20
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gccaaggaag gggtgaca 18
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aggctgtggg caaggtc 17
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ggagtgggtg tcgctgtt 18
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gtggacctga cctgccgt 18
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ctttccgtac cagccactac 20
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ggtggttctt gtccctacg 19
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tgtgaccgct atgggattgt 20
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tggaagagta tgtattgc 18
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ctcagccaac tctttgtctt 20
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caagatcaca gattgtggac g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 92
aacaatacag ctagtgggaa gg 22

Claims (10)

1.一种多重检测非小细胞肺癌基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对集和探针集；所述引物对集包括：
第一引物对组、第二引物对组、第三引物对组、第四引物对组、第五引物对组、第六引物对组、第七引物对组、第八引物对组、第九引物对组、第十引物对组、第十一引物对组、第十二引物对组；
所述第一引物对组包括：如SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.78和SEQ ID NO.79所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示的反向引物；
所述第二引物对组包括：如SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71和SEQ IDNO.72所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74所示的反向引物；
所述第三引物对组包括：如SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.63和SEQ ID NO.64所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66所示的反向引物；
所述第四引物对组包括：如SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ IDNO.54和SEQ ID NO.55所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57所示的反向引物；
所述第五引物对组包括：如SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ IDNO.47和SEQ ID NO.48所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.49所示的反向引物；
所述第六引物对组包括：如SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.41所示的反向引物；
所述第七引物对组包括：如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.32和SEQ ID NO.33所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的反向引物；
所述第八引物对组包括：如SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.9所示的反向引物；
所述第九引物对组包括：如SEQ ID NO.24所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.25所示的反向引物；
所述第十引物对组包括：如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
所述第十一引物对组包括：如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20所示的反向引物；
所述第十二引物对组包括：如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQID NO.9所示的反向引物；
所述探针集包括第一探针组、第二探针组、第三探针组、第四探针组、第五探针组、第六探针组、第七探针组、第八探针组、第九探针组、第十探针组、第十一探针组；
所述第一探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示的突变探针；
所述第二探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示的突变探针、和核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示的突变探针；
所述第三探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示的突变探针、和核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示的突变探针；
所述第四探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示的突变探针、和核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示的突变探针；
所述第五探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示的突变探针；
所述第六探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示的突变探针、和核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示的突变探针；
所述第七探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的突变探针、和核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的突变探针；
所述第八探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的突变探针；
所述第九探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的突变探针；
所述第十探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的突变探针；
所述第十一探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的突变探针、核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的突变探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的突变探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含第一引物探针混合液，第一引物探针混合液中包含SEQ ID NO.77-82所示的多核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含第二引物探针混合液，第二引物探针混合液中包含SEQ ID NO.69-76所示的多核苷酸序列；和/或
所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含第三引物探针混合液，第三引物探针混合液中包含SEQ ID NO.60-68所示的多核苷酸序列；和/或
所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含第四引物探针混合液，第四引物探针混合液中包含SEQ ID NO.51-59所示的多核苷酸序列；和/或
所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含第五引物探针混合液，第五引物探针混合液中包含SEQ ID NO.44-50所示的多核苷酸序列；和/或
所述试剂盒还包括第六容器，所述第六容器内包含第六引物探针混合液，第六引物探针混合液中包含SEQ ID NO.38-43所示的多核苷酸序列；和/或
所述试剂盒还包括第七容器，所述第七容器内包含第七引物探针混合液，第七引物探针混合液中包含SEQ ID NO.29-37所示的多核苷酸序列；和/或
所述试剂盒还包括第八容器，所述第八容器内包含第八引物探针混合液，第八引物探针混合液中包含SEQ ID NO.26-28、9、12所示的多核苷酸序列；和/或
所述试剂盒还包括第九容器，所述第九容器内包含第九引物探针混合液，第九引物探针混合液中包含SEQ ID NO.24、25、12所示的多核苷酸序列；和/或
所述试剂盒还包括第十容器，所述第十容器内包含第十引物探针混合液，第十引物探针混合液中包含SEQ ID NO.22、23、8、11所示的多核苷酸序列；和/或
所述试剂盒还包括第十一容器，所述第十一容器内包含第十一引物探针混合液，第十一引物探针混合液中包含SEQ ID NO.13-21所示的多核苷酸序列；和/或
所述试剂盒还包括第十二容器，所述第十二容器内包含第十二引物探针混合液，第十二引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1-12所示的多核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一引物探针混合液、所述第二引物探针混合液、和/或所述第三引物探针混合液还包括第一内标，所述第一内标包括：如SEQID NO.86-88所示的多核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第四引物探针混合液、所述第五引物探针混合液、所述第六引物探针混合液、所述第七引物探针混合液、所述第八引物探针混合液、所述第九引物探针混合液、所述第十引物探针混合液、所述第十一引物探针混合液、和/或所述第十二引物探针混合液还包括第二内标，所述第二内标包括：如SEQ ID NO.83-85所示的反向引物。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，使用PCR用缓冲液(Buffer)配制所述引物探针混合液。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第十三容器，所述第十三容器内包含RNA酶系，所述RNA酶系包括逆转录酶、热启动酶、RNA酶抑制剂、和dNTPs。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第十四容器，所述第十四容器内包含DNA酶系，所述DNA酶系包括热启动酶、UNG酶、和dNTPs。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第十五容器，所述第十五容器内包含阳性质控品。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第十六容器，所述第十六容器内包含阴性质控品。
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