CN107868849A - 检测对虾ihhnv病毒的引物组及其应用 - Google Patents

检测对虾ihhnv病毒的引物组及其应用 Download PDF

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林克冰
周宸
黄种持
杨章武
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Abstract

本发明公开了检测对虾IHHNV病毒的引物组及其应用，属于生物检测技术领域。本发明提供了根据对虾IHHNV病毒的部分基因序列，如SEQ ID No:1所示核酸序列，设计的引物组，该引物组具有特异性强、灵敏度高等特点，在此基础上，将上述引物组可用于制备成检测对虾IHHNV病毒的试剂盒，并使用LAMP法检测对虾IHHNV病毒具有操作简单、反应迅速、反应结果可视化的特点。

Description

检测对虾IHHNV病毒的引物组及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测对虾IHHNV病毒的引物组及其应用。
背景技术
传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)为世界养虾业主要病毒之一。该病毒感染宿主范围广、危害非常严重；在蓝对虾(Litopenaeus stylirostris)造成高达90％死亡率；而在白对虾(Litopenaeus vannamei)则引起矮小畸形症候群(Runt-deformitysyndrome，简称RDS)，成长缓慢且不齐，额角弯向一侧，第六腹节及尾扇变形或变小，造成高达50％的经济损失。因此，国际兽疫局(OIE)将IHHNV引起的疾病列为必须报告的重要的水生动物病毒性疫病之一。
然而，对于这一疾病尚无有效的治疗方法，只能以预防为主；避免与病毒病原体的接触是最有效的预防措施，而这又主要依赖于早期的快速诊断。因此，建立IHHNV快速高效、灵敏度高、特异性强的检测技术是预防该病害的重要途径。
目前，对于IHHNV的检测方法主要有临床组织病理学方法、免疫学方法以及普通PCR方法等；而这些方法存在操作繁琐、费时、灵敏度低、仪器设备要求高等问题，因此，亟需一种操作简单、检测迅速、灵敏度高、特异性好的IHHNV检测方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测IHHNV病毒的引物组及检测IHHNV病毒的试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
检测对虾IHHNV病毒的引物组，是根据SEQ ID No:1所示核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。
在上述方案的基础上，所述检测对虾IHHNV病毒的引物组，核酸序列为：
F3：5’-GGTGACCACTGGCACATC-3’；
B3：5’-TGGCCAAGACCAAAATACGAA-3’；
FIP：5’-TCTGGCAGCAAAGGTAACTCCC-ACATACTGCGGACACCCA-3’；
BIP：5’-CGAAGCTGAAGCGACTACGGTAC-GCCGTTCAATACCGTATCTGA-3’；
LF：5’-CGAGGATTGTAGCTCTATGTCTGG-3’。
在上述方案的基础上，所述检测对虾IHHNV病毒的引物组，核酸序列为：
F3：5’-AACCCTCCACCAGACAAGA-3’；
B3：5’-TGTAGACATCTGTGTGGGTCT-3’；
FIP：5’-CGGCGCACATGGTTGTCTATGAT-CACCAGCGACGACTTCCT-3’；
BIP：5’-TTCAACAAGAGCAAGCCCAAGGA-CTTGATCCTTCGGCGTGTT-3’；
LF：5’-CTTTTCGTATTCTTGGAAGAGTCCT-3’；
LB：5’-GGAGGGATCCACATAATGAAGACG-3’。
在上述方案的基础上，所述检测对虾IHHNV病毒的引物组，核酸序列为：
F3：5’-GTAGCAGACAAAAGACTGGA-3’；
B3：5’-GTTCTTCGAAGAGAGCGTA-3’；
FIP：5’-GCACCGATGGTAAGAGATTTTCC-CAAAATAAACACTCTTGTACTCC-3’；
BIP：5’-TACTCGGAAAACTGAACACTGGC-GGACTTTCCGATGAGGTT-3’；
LB：5’-TAGTAACAAGAACAGGAGACTCA-3’。
上述引物组在对虾IHHNV病毒检测中的应用。
在上述方案的基础上，用于制备检测对虾IHHNV病毒的试剂盒或检测试剂。
一种含有上述引物组的对虾IHHNV病毒检测试剂盒，所述试剂盒为DNA试剂盒。
一种对虾IHHNV病毒的DNA检测试剂盒，包含上述的至少一组引物组，还包含反应缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
在上述方案的基础上，所述的阳性对照为含有SEQ ID No:1所示核酸序列的T克隆载体。
使用权利要求上述试剂盒检测对虾IHHNV病毒的方法，使用LAMP法检测，反应温度为：63℃～65℃，反应时间为60min。
本发明的有益效果
本发明应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermamplification，LAMP)，根据IHHNV病毒基因中的一段序列SEQ ID No:1，采用PrimerExploer V4软件设计5套LAMP特异性引物组合，分别记为IHHNV-1、IHHNV-2、IHHNV-3、IHHNV-4和IHHNV-5，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和环引物(LF和/或LB)。通过筛选，最终确定将IHHNV-1和IHHNV-2用于对虾IHHNV病毒，并对其特异性和灵敏度进行验证，结果显示，IHHNV-1和IHHNV-2对水、NNV核酸、鱼核酸、沙门氏菌、绿脓杆菌、柠檬酸杆菌和等葡萄球菌均无非特异性扩增，IHHNV-1最低检测含量为630ag，IHHNV-2最低检测含量为63ag。
本发明应用LAMP法可以从分子水平上直接、快速、准确的检测对虾IHHNV病毒，并具有如下优点：1、操作简单：在恒温热水浴即可完成操作，不需要对模板进行热变性处理，节省了因温度循环而消耗的时间，对仪器依赖性小；2、反应迅速：在25～33min即可完成反应；3、特异性强：本发明的引物对水、NNV核酸、鱼核酸、沙门氏菌、绿脓杆菌、柠檬酸杆菌和等葡萄球菌均无非特异性扩增；4、鉴定方便：反应中从dNTPs中解离出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，产生副产物焦磷酸镁沉淀，用肉眼即可观察到反应结果，借助浊度仪可获得精确的结果；此外，在反应体系中添加钙黄绿素，有核酸扩增的反应产物在紫外光下可观察到黄绿色荧光；5、灵敏度高：本发明IHHNV-1最低检测含量为630ag，IHHNV-2最低检测含量为63ag，6、本发明试剂盒中的阳性对照为含有IHHNV病毒序列的阳性质粒，稳定性好，浓度高，能够对检测的样品起到定性定量分析的作用。
附图说明
图1五组LAMP引物筛选结果；
图2IHHNV-1引物组的特异性试验结果；
图3紫外光下IHHNV-1引物组的特异性试验结果(1是IHHNV病毒核酸，2是水，3是NNV核酸，4是鱼核酸，5是沙门氏菌，6是绿脓杆菌，7是柠檬酸杆菌，8是葡萄球菌)；
图4IHHNV-2引物组的特异性试验结果；
图5紫外光下IHHNV-2引物组的特异性试验结果(1是IHHNV病毒核酸，2是水，3是NNV核酸，4是鱼核酸，5是沙门氏菌，6是绿脓杆菌，7是柠檬酸杆菌)；
图6IHHNV病毒阳性质粒检测结果(1是IHHNV-1与IHHNV病毒核酸，2是IHHNV-1与IHHNV病毒阳性质粒，3是IHHNV-2与IHHNV病毒核酸，4是IHHNV-2与IHHNV病毒阳性质粒)；
图7不同浓度的IHHNV病毒阳性质粒扩增结果(1是IHHNV病毒阳性质粒原液①，2是IHHNV病毒阳性质粒稀释100倍①，3是IHHNV病毒阳性质粒原液②，4是IHHNV病毒阳性质粒稀释100倍②)；
图8IHHNV-1引物组的灵敏性试验结果；
图9紫外光下IHHNV-1引物组的灵敏性试验结果(1是6.3ng，2是630pg，3是63pg，4是6.3pg，5是630fg，6是63fg，7是6.3fg，8是630ag，9是63ag，10是6.3ag，11是水)；
图10IHHNV-2引物组的灵敏性试验结果；
图11紫外光下IHHNV-2引物组的灵敏性试验结果(1是6.3ng，2是630pg，3是63pg，4是6.3pg，5是630fg，6是63fg，7是6.3fg，8是630ag，9是63ag，10是6.3ag，11是水)。
具体实施方式
本发明中的试样可以采用分离自感染实验等中所用的细胞和其培养液或者来自活体的标本和培养细胞等含病毒的样本，也可以来自于被怀疑感染IHHNV病毒生物的活体样本，这些试样可以进行分离、抽提、浓缩、纯化等预处理。
LAMP法即环介导等温核酸扩增技术，该方法是通过使自身的3’末端退火到作为模版的核苷酸上而作为互补链合成的起点的同时，组合退火到这时形成的环上的引物，可以实现恒温下的互补链合成反应的核酸扩增法。此外，LAMP法是至少使用识别6个区域的4个引物的特异性高的核酸扩增法。
LAMP反应后的核酸扩增产物的检测可以使用公知的技术，例如，可以将反应产物直接进行琼脂糖凝胶电泳而容易的进行检测，通过琼脂糖凝胶电泳，LAMP扩增产物因碱基的长度不同而呈现阶梯状。此外，LAMP法中，由于核酸的合成，底物被大量消耗，作为副产物的焦磷酸离子与共存的镁离子反应而生成焦磷酸镁，反应液白浊至肉眼也可确认的程度。因此，可以进行光学观察或使用浊度仪进行检测。本发明在反应体系中加入钙黄绿素，有核酸扩增的反应产物在黑暗条件下可观察到黄绿色荧光；从而使反应结果更加直观。
使用本发明的引物进行核酸扩增检测时所需的各种试剂可以事先组合而试剂盒化，具体来说，作为本发明的引物或环引物所需的各种寡聚核酸、作为核酸合成底物的4种dNTP、进行核酸合成的DNA聚合酶、具有反转录活性的酶、提供适合于酶反应的条件的缓冲液和盐类、阳性对照核酸、使酶和模板稳定化的保护试剂以及根据需要采用的反应生成物的检测所需的试剂以试剂盒的形式提供。
实施例1
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
1、引物的设计与合成
根据多条对虾IHHNV基因序列，序列号分别为JN616415.1、KF214742.1、KC513422.1、KP733862.1、KP733861.1、AY102034.1，通过https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/网站比对，获得高度保守序列，选取高度保守序列区的一段1447bp的序列(SEQ ID No:1)作为本发明引物设计序列区。
根据序列SEQ ID No:1采用PrimerExplorer V4软件设计LAMP引物，选取内引物FIP/BIP的Tm值在65度左右，外引物F3/B3的温度为60度左右，FIP/BIP的5′端dataG值小于等于-4kcal/mol，F3/B3的3′端dataG值小于等于-4kcal/mol，GC含量在40％-60％之间，引物扩增片段在200bp左右的引物作为初筛引物，并分别记为IHHNV-1、IHHNV-2、IHHNV-3、IHHNV-4和IHHNV-5，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和一条或两条环引物(LF和/或LB)。其核苷酸序列分别如下：
IHHNV-1
F3：5’-GGTGACCACTGGCACATC-3’(SEQ ID No:2)；
B3：5’-TGGCCAAGACCAAAATACGAA-3’(SEQ ID No:3)；
FIP：5’-TCTGGCAGCAAAGGTAACTCCC-ACATACTGCGGACACCCA-3’(SEQ ID No:4)；
BIP：5’-CGAAGCTGAAGCGACTACGGTAC-GCCGTTCAATACCGTATCTGA-3’(SEQ ID No:5)；
LF：5’-CGAGGATTGTAGCTCTATGTCTGG-3’(SEQ ID No:6)。
IHHNV-2
F3：5’-AACCCTCCACCAGACAAGA-3’(SEQ ID No:7)；
B3：5’-TGTAGACATCTGTGTGGGTCT-3’(SEQ ID No:8)；
FIP：5’-CGGCGCACATGGTTGTCTATGAT-CACCAGCGACGACTTCCT-3’(SEQ ID No:9)；
BIP：5’-TTCAACAAGAGCAAGCCCAAGGA-CTTGATCCTTCGGCGTGTT-3’(SEQ ID No:10)；
LF：5’-CTTTTCGTATTCTTGGAAGAGTCCT-3’(SEQ ID No:11)；
LB：5’-GGAGGGATCCACATAATGAAGACG-3’(SEQ ID No:12)。
IHHNV-3
F3：5’-CAACTATGGACCCGTACC-3’(SEQ ID No:13)；
B3：5’-GTCGTTGTTGGCTAACATG-3’(SEQ ID No:14)；
FIP：5’-GCTTTGGTTTGACTTTTTCTTGTTG-AGAGGACAATATAAAGACAAACTCA-3’(SEQ IDNo:15)；
BIP：5’-CAACTGTCACTAATTACAAACCTGC-TCCACTGCATATTGTCGTA-3’(SEQ ID No:16)。
IHHNV-4
F3：5’-GTAGCAGACAAAAGACTGGA-3’(SEQ ID No:17)；
B3：5’-GTTCTTCGAAGAGAGCGTA-3’(SEQ ID No:18)；
FIP：5’-GCACCGATGGTAAGAGATTTTCC-CAAAATAAACACTCTTGTACTCC-3’(SEQ ID No:19)；
BIP：5’-TACTCGGAAAACTGAACACTGGC-GGACTTTCCGATGAGGTT-3’(SEQ ID No:20)；
LB：5’-TAGTAACAAGAACAGGAGACTCA-3’(SEQ ID No:21)。
IHHNV-5
F3：5’-CAAATAACAGTGGACGACTTC-3’(SEQ ID No:22)；
B3：5’-AGAGGCCTTTTATTTGTCTTG-3’(SEQ ID No:23)；
FIP：5’-TCCCATAATTTCTGACTCTTGGTGT-AAACTCCTTTTCGAAGGATCAG-3’(SEQ ID No:24)；
BIP：5’-ACAAGGATATAGACTACTGGGTACC-CAGGTGGAAGGTTTTTGTTC-3’(SEQ ID No:25)；
LB：5’-TCCAGCTGATGGTAAAGCTC-3’(SEQ ID No:26)。
将上述引物序列交由上海生工生物工程有限公司合成。
2、引物的筛选
将IHHNV-1、IHHNV-2、IHHNV-3、IHHNV-4、和IHHNV-5引物组合分别以提取的IHHNV病毒的核酸和水为模板，在63℃下进行LAMP反应60分钟，其中，各引物的用量分别为FIP、BIP 40pmol，F3、B35pmol，环引物20pmol；反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
试验结果如图1所示：
其中，IHHNV-1LAMP引物能够在25分钟左右将IHHNV病毒的核酸扩增出来，对照组水在60分钟内未出现非特异性扩增，所以IHHNV-2引物初步能够使用，需要进一步考察特异性和灵敏度。
IHHNV-2LAMP引物能够在33分钟左右将IHHNV病毒的核酸扩增出来，对照组水在60分钟内未出现非特异性扩增，所以IHHNV-1引物初步能够使用，需要进一步考察特异性和灵敏度。
IHHNV-3LAMP引物在在60分钟内IHHNV病毒的核酸未出现扩增，对照组水在60分钟内也未出现非特异性扩增，所以将IHHNV-3引物舍弃。
IHHNV-4LAMP引物能够在43分钟左右将IHHNV病毒的核酸扩增出来，对照组水在60分钟内未出现非特异性扩增，但是，其对IHHNV病毒的核酸扩增时间较长，会影响试验的速度，因此将IHHNV-4引物舍弃。
IHHNV-5LAMP引物能够在55分钟左右将IHHNV病毒的核酸扩增出来，时间太久，舍弃。
3、特异性试验
3.1IHHNV-1特异性试验
采用IHHNV-1引物组，分别以提取的IHHNV病毒的核酸、水、NNV病毒核酸、鱼核酸、沙门氏菌、绿脓杆菌、柠檬酸杆菌和葡萄球菌为模板，在63℃下进行LAMP反应60分钟，其中，各引物的用量分别为FIP、BIP 40pmol，F3、B35pmol；所述鱼核酸为斜带石斑鱼的总RNA；反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
试验结果如图2和图3所示：只有IHHNV病毒的核酸出现扩增，其他对照病毒、细菌和水均未被检测出，这说明IHHNV-1引物组的特异性良好。
3.2IHHNV-2特异性试验
采用IHHNV-2引物组，分别以提取的IHHNV病毒的核酸、水、NNV病毒核酸、鱼核酸、沙门氏菌、绿脓杆菌和柠檬酸杆菌为模板，在63℃下进行LAMP反应60分钟，其中，各引物的用量分别为FIP、BIP 40pmol，F3、B35pmol；所述鱼核酸为斜带石斑鱼的总RNA；反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
试验结果如图4和图5所示：只有IHHNV病毒的核酸出现扩增，其他对照病毒、细菌和水均未被检测出，这说明IHHNV-2引物组的特异性良好。
4、IHHNV病毒阳性质粒
4.1IHHNV病毒阳性质粒的构建
提取IHHNV病毒的DNA，用以下引物扩增：
F引物：5’-cctgcaggtcgactctagaGGACGGAAGGCGACTGGAAGAG-3’(SEQ ID No:27)；
R引物：5‘-gtgaattcgagctcggtacccgggATTGAGTGCATCACTACGCCTGC-3’(SEQ IDNo:28)；
PCR体系如下：
PCR反应程序如下：98℃2min；(98℃10s；55℃45s；72℃2min)×30Cycles；72℃10min；10℃pause。如果条带不特异，可适当提高退火温度。
PCR反应完成后，纯化后的PCR产物加1μL Easytaq酶和5μL 10×Easytaq buffer进行一下PCR程序：
94℃2min、(98℃10s；55℃45s；72℃2min)×1Cycles、72℃2min、10℃pause。
上述反应完成后，使用TRANSGENE公司的Peasy-T1Simple Cloning Kit将上述产物进行连接与转化。
连接体系为：
PCRProduct 2μL
Peasy-T1Simple Cloning Vector 1μL
轻轻混合，室温(20℃-37℃)反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上后可以进行转化。转化完成后摇菌，筛选阳性克隆并测序；提取筛选到的阳性克隆的质粒即得含有SEQ ID No:1所示序列的阳性克隆质粒。
4.2IHHNV病毒阳性质粒的质量检测
IHHNV-1和IHHNV-2引物组分别以提取的IHHNV病毒核酸、IHHNV病毒阳性质粒和水为模板，进行LAMP反应，在63℃下进行LAMP反应60分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图6所示：提取的IHHNV病毒核酸、IHHNV病毒阳性质粒均在10～16min出现扩增，比提取的IHHNV病毒核酸(36～40min)扩增速度快，这说明本发明制备的IHHNV病毒阳性质粒符合要求。
IHHNV-1引物组分别以IHHNV病毒阳性质粒和稀释100倍的IHHNV病毒阳性质粒模板，进行LAMP反应，每组做2个平行；在63℃下进行LAMP反应60分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图7所示：稀释100倍的IHHNV病毒阳性质粒与未稀释的质粒原液均在16min左右出现扩增，这说明本发明制备的IHHNV病毒阳性质粒浓度高符合要求。
5、灵敏度检测
5.1IHHNV-1的灵敏度检测
用浓度为315ng/μL(5.29×1010copies/μL)的IHHNV病毒阳性质粒为试验模板，按10倍梯度稀释，做灵敏度试验。
采用IHHNV-1引物组，分别以浓度为：3.15ng/μL、315pg/μL、31.5pg/μL、3.15pg/μL、315fg/μL、31.5fg/μL、3.15fg/μL、315ag/μL、31.5ag/μL、3.15ag/μL的IHHNV病毒阳性质粒作为模板；每个体系中加入2μL的模板，水作为阴性对照组，在63℃下进行LAMP反应60分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图8和图9所示：IHHNV病毒阳性质粒含量在6.3ng～630ag均能检测到扩增，阴性对照未见扩增，可见IHHNV-1引物组的最低检测限为630ag，约106copies。
5.2IHHNV-2的灵敏度检测
用浓度为315ng/μL(5.29×1010copies/μL)的IHHNV病毒阳性质粒为试验模板，按10倍梯度稀释，做灵敏度试验。
分别以浓度为：3.15ng/μL、315pg/μL、31.5pg/μL、3.15pg/μL、315fg/μL、31.5fg/μL、3.15fg/μL、315ag/μL、31.5ag/μL、3.15ag/μL的IHHNV病毒阳性质粒作为模板；每个体系中加入2μL的模板，水作为阴性对照组，在63℃下进行LAMP反应60分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图10和图11所示：IHHNV病毒阳性质粒含量在6.3ng～63ag均能检测到扩增，阴性对照未见扩增，可见IHHNV-2引物组的最低检测限为63ag，约10.6copies。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）
<120> 检测对虾IHHNV病毒的引物组及其应用
<130> 2017
<141> 2017-12-01
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1447
<212> DNA
<213> Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus partial
<400> 1
caaacttcac cattacagat catggtgacc actggcacat cacatactgc ggacacccaa 60
ccaataagac cagacataga gctacaatcc tcgcctattt gggagttacc tttgctgcca 120
gagccgaagc tgaagcgact acggtacttg ttagaaatat caagagatgg atactctatc 180
ttatcagata cggtattgaa cggctttcgt attttggtct tggccacgcc atttttaaac 240
gaatcatcaa atacttccaa caatacagaa gagacgaaga cgcagtagac ggaccatgtc 300
catatatgac tactacaaga gaagaccgcg ctgaagaaaa acctaaagaa aatagtgcag 360
aatatgacta cctccaacac ttagtcaaaa ccaagtcagc aagaacagta caagaacttg 420
tcaataaact tgacgatgaa gaatataaac aactatggac ccgtaccaga ggacaatata 480
aagacaaact cagaggaata ttaacatact acaacaacaa gaaaaagtca aaccaaagcc 540
aactgtcact aattacaaac ctgcagaata tatcaaaaag aaaaccagac tacgacaata 600
tgcagtggat aaaatacatg ttagccaaca acgacatccg tgtaccagaa atcttagctt 660
ggataatcat cgtagcagac aaaagactgg acaaaataaa cactcttgta ctccaaggac 720
caacaggaac aggaaaatct cttaccatcg gtgcactact cggaaaactg aacactggcc 780
tagtaacaag aacaggagac tcaaacacct tccatctaca aaacctcatc ggaaagtcct 840
acgctctctt cgaagaaccc agaatcagtc aaataacagt ggacgacttc aaactccttt 900
tcgaaggatc agacttagaa gtaaacataa aacaccaaga gtcagaaatt atgggacgaa 960
taccaatctt catatcaaca aacaaggata tagactactg ggtacctcca gctgatggta 1020
aagctctaca aacaagaaca aaaaccttcc acctgacaag acaaataaaa ggcctctcag 1080
acaggatgaa cagccagtac gatatcaacc ctccaccaga caagatcacc agcgacgact 1140
tcctaggact cttccaagaa tacgaaaagg aaatcgacga catcatagac aaccatgtgc 1200
gccgattcaa caagagcaag cccaaggaaa agatccagga gggatccaca taatgaagac 1260
gaagaacacg ccgaaggatc aagtggacca gacccacaca gatgtctaca attcaatact 1320
ggagactcaa tacatattac tttccaaaca agaagatact tcgaattcga cgctgccaat 1380
gatggaaact tcgacggaaa aaatttatac tgcctcccac tacattggat gaacttatat 1440
ctctatg 1447
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ggtgaccact ggcacatc 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tggccaagac caaaatacga a 21
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tctggcagca aaggtaactc ccacatactg cggacaccca 40
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
cgaagctgaa gcgactacgg tacgccgttc aataccgtat ctga 44
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cgaggattgt agctctatgt ctgg 24
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
aaccctccac cagacaaga 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
tgtagacatc tgtgtgggtc t 21
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
cggcgcacat ggttgtctat gatcaccagc gacgacttcc t 41
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
ttcaacaaga gcaagcccaa ggacttgatc cttcggcgtg tt 42
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
cttttcgtat tcttggaaga gtcct 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ggagggatcc acataatgaa gacg 24
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
caactatgga cccgtacc 18
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
gtcgttgttg gctaacatg 19
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gctttggttt gactttttct tgttgagagg acaatataaa gacaaactca 50
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
caactgtcac taattacaaa cctgctccac tgcatattgt cgta 44
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
gtagcagaca aaagactgga 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
gttcttcgaa gagagcgta 19
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
gcaccgatgg taagagattt tcccaaaata aacactcttg tactcc 46
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
tactcggaaa actgaacact ggcggacttt ccgatgaggt t 41
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
tagtaacaag aacaggagac tca 23
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
caaataacag tggacgactt c 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
agaggccttt tatttgtctt g 21
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
tcccataatt tctgactctt ggtgtaaact ccttttcgaa ggatcag 47
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
acaaggatat agactactgg gtacccaggt ggaaggtttt tgttc 45
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
tccagctgat ggtaaagctc 20
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
cctgcaggtc gactctagag gacggaaggc gactggaaga g 41
<210> 28
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
gtgaattcga gctcggtacc cgggattgag tgcatcacta cgcctgc 47

Claims (10)

1.检测对虾IHHNV病毒的引物组，其特征在于：根据SEQ ID No:1所示核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。
2.根据权利要求1所述检测对虾IHHNV病毒的引物组，其特征在于：核酸序列为：
F3：5’-GGTGACCACTGGCACATC-3’；
B3：5’-TGGCCAAGACCAAAATACGAA-3’；
FIP：5’-TCTGGCAGCAAAGGTAACTCCC-ACATACTGCGGACACCCA-3’；
BIP：5’-CGAAGCTGAAGCGACTACGGTAC-GCCGTTCAATACCGTATCTGA-3’；
LF：5’-CGAGGATTGTAGCTCTATGTCTGG-3’。
3.根据权利要求1所述检测对虾IHHNV病毒的引物组，其特征在于：核酸序列为：
F3：5’-AACCCTCCACCAGACAAGA-3’；
B3：5’-TGTAGACATCTGTGTGGGTCT-3’；
FIP：5’-CGGCGCACATGGTTGTCTATGAT-CACCAGCGACGACTTCCT-3’；
BIP：5’-TTCAACAAGAGCAAGCCCAAGGA-CTTGATCCTTCGGCGTGTT-3’；
LF：5’-CTTTTCGTATTCTTGGAAGAGTCCT-3’；
LB：5’-GGAGGGATCCACATAATGAAGACG-3’。
4.根据权利要求1所述检测对虾IHHNV病毒的引物组，其特征在于：核酸序列为：
F3：5’-GTAGCAGACAAAAGACTGGA-3’；
B3：5’-GTTCTTCGAAGAGAGCGTA-3’；
FIP：5’-GCACCGATGGTAAGAGATTTTCC-CAAAATAAACACTCTTGTACTCC-3’；
BIP：5’-TACTCGGAAAACTGAACACTGGC-GGACTTTCCGATGAGGTT-3’；
LB：5’-TAGTAACAAGAACAGGAGACTCA-3’。
5.权利要求1～4任一项所述引物组在对虾IHHNV病毒检测中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：用于制备检测对虾IHHNV病毒的试剂盒或检测试剂。
7.一种含有权利要求1～4任一项所述引物组的对虾IHHNV病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为DNA试剂盒。
8.一种对虾IHHNV病毒的DNA检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1～4任一项所述的至少一组引物组，还包含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
9.根据权利要求8所述对虾IHHNV病毒的DNA检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为含有SEQ ID No:1所示核酸序列的T克隆载体。
10.使用权利要求8或9所述试剂盒检测对虾IHHNV病毒的方法，其特征在于：使用LAMP法检测，反应温度为：63℃，反应时间为60min。
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