CN113493860A - 检测2019-nCoV中S基因的RT-LAMP试剂盒及其专用引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测2019‑nCoV中S基因的RT‑LAMP试剂盒及其专用引物和应用。本发明提供的用于检测2019‑nCoV(即新型冠状病毒SARS‑CoV‑2)的引物为引物组，其包括具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的引物，能够实现对2019‑nCoV的特异性检测，本发明提供的RT‑LAMP试剂盒的检测操作简单、特异性强、灵敏度高，可以快速且高效对2019‑nCoV进行检测，可以用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测2019‑nCoV。

Description

检测2019-nCoV中S基因的RT-LAMP试剂盒及其专用引物和 应用

技术领域

本发明是关于生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，具体涉及一种用于检测2019-nCoV(或称为“2019新型冠状病毒”或“新型冠状病毒SARS-CoV-2”)中S基因的RT-LAMP检测专用引物和检测试剂盒及相关应用。

背景技术

2019年12月以来，新型冠状病毒SARS-CoV-2(或称为“2019nCoV”或“2019新型冠状病毒”)感染的肺炎疫情已引起全球重视。针对SARS-CoV-2病毒的监测、检测相关技术已成为应对疫情的紧急重点研究方向之一。

冠状病毒的实验室诊断主要有血清学检测、核酸检测以及病毒分离。血清学检测灵敏度和特异性不如核酸检测高，在一些基层单位无法满足检测需要；病毒分离对环境要求高、周期长且影响因素多，不适宜在基层实验室开展；核酸检测主要有RT-PCR及Real-time RT-PCR，但需要特殊仪器，一些设备条件相对简陋的基层单位无法进行。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供所述引物及试剂盒用于检测检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的相关应用。

一方面，本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物组，其包括具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的引物。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其包含本发明所述的引物组。

本发明提供的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物组，是RT-LAMP专用引物，能够实现高效、快速、高特异性地检测新型冠状病毒SARS-CoV-2，且操作简单，灵敏度高，结果鉴定简便。

根据本发明的具体实施方案，本发明的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒中，还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×Thermopol反应缓冲液、MgSO₄、betaine、dNTP，Bst DNA聚合酶，WarmStart RTx反转录酶。

根据本发明的具体实施方案，本发明的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒中，还包含阳性对照和/或阴性对照；优选地，所述阳性对照包含新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA，所述阴性对照为不含新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA的反应体系。

另一方面，本发明还提供了所述的引物组或所述的试剂盒在检测样品中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2的应用。

根据本发明的具体实施方案，本发明的引物组或试剂盒在检测样品中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2的应用中，所述引物组是用于RT-LAMP反应。优选地，引物组在每25μl反应体系中的使用浓度为：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的引物的终浓度独立地为2-8pmol，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示序列的引物的终浓度独立地为24-36pmol，SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7所示序列的引物的终浓度独立地为12-18pmol。更优选地，引物组在每25μl反应体系中的使用浓度为：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3所示序列的引物的终浓度独立地为8pmol，SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5所示序列的引物的终浓度独立地为32pmol，SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示序列的引物的终浓度独立地为16pmol。

根据本发明的具体实施方案，本发明的引物组或试剂盒在检测样品中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2的应用中，RT-LAMP反应体系还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×Thermopol反应缓冲液2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mMbetaine 4μl、10mMdNTP 3.5μl，Bst DNA聚合酶1μl，WarmStart RTx反转录酶0.5μl，ddH₂O补至25μl。优选地，所述基础反应试剂在25μl反应体系中的使用量为：12.5μl。

根据本发明的具体实施方案，本发明的引物组或试剂盒在检测样品中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2的应用中，检测包括以下步骤：

S1：提取待测样品RNA；

S2：反应体系配制：25μl反应体系包含2μl待测样品RNA、10×Thermopol反应缓冲液2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，Bst DNA聚合酶1μl，WarmStart RTx反转录酶0.5μl，引物加入量为：100μM FIP/BIP引物各0.8μl(终浓度32pmol)，100μM F3/B3所示引物各0.1μl(终浓度4pmol)，100μM LF/LB引物0.4μl(终浓度16pmol)，ddH₂O补至25μl；

S3：将反应体系置62℃-63℃条件下恒温扩增反应45-60min，获得反应液；

S4：结果分析：使用钙黄绿素颜色指示剂或浊度仪对所述反应液进行检测分析。

根据本发明的具体实施方案，本发明的引物组或试剂盒在检测样品中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2的应用中，主要是应用于体外检测。所述样品可以是来自于人或动物的离体样本，也可以是来自自然环境中的空气取样、食物取样、水源取样、人或动物的日常用品或其他接触物表面取样、或人或动物的排泄物等环境样本。

根据本发明的具体实施方案，本发明的引物组或试剂盒在检测样品中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2的应用中，步骤S3中将反应体系置63℃条件下恒温扩增反应60min。

根据本发明的具体实施方案，本发明的引物组或试剂盒在检测样品中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2的应用中，步骤S4中所述结果分析的具体方法为：

当使用钙黄绿素颜色指示剂进行检测时，在反应液中添加1μl的钙黄绿素颜色指示剂，呈现绿色表示待测样品中存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阳性)，呈现橙色表示待测样品中不存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阴性)；

当使用浊度仪进行检测时，浊度上升(>0.1)表示待测样品中存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阴性)。

具体而言，本发明的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-LAMP专用引物、检测试剂盒及相关应用具有以下特点：

1)本发明的引物可以对新型冠状病毒SARS-CoV-2靶序列的特异区域进行特异性识别，保证了RT-LAMP或LAMP扩增的高度特异性；

2)本发明具有灵敏度高等特点，检测灵敏度比普通PCR高10倍；

3)本发明操作简便、快速且高效，只需将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入63℃恒温水浴锅中60分钟后就可以判断结果，因此不需要大型仪器设备和专业人员，更加适用于基层检测；

4)本发明结果鉴定简便，可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；

综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到新型冠状病毒SARS-CoV-2，不需要复杂仪器，为新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测新型冠状病毒SARS-CoV-2，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

附图说明

图1为实施例1中用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物筛选的部分结果；

图2为实施例2中用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-LAMP检测方法的反应温度的部分筛选结果；

图3为实施例3中用于新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的特异性实时浊度仪结果；

图4为实施例3中用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性钙黄绿素染色结果；

图5为实施例3中用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的灵敏度实时浊度仪结果；

图6为实施例3中用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的灵敏度钙黄绿素染色结果；

图7为实施例3中采用普通PCR检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的灵敏度结果。

具体实施方式

本发明设计了适用于新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的六条专用引物，并基于开发的引物制备了适用于快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒和检测方法，该试剂盒和方法在60℃至65℃的等温条件下即可进行检测反应，不需要专门的或昂贵的设备和专业人员，并且由于热变化没有时间损失，该技术的放大效率非常高，可实现在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，非常适合于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心临场快速检测。

以下结合具体实施例对本发明作进一步描述。

下文公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方面。本发明提供了各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未详细注明的操作方法，按照所属领域中的常规操作或仪器厂家的说明书建议条件进行。

除特殊注明外，各实施例中所用生物材料来自首都儿科研究所细菌研究室。

实施例1：用于对新型冠状病毒SARS-CoV-2进行RT-LAMP/LAMP检测的引物设计

本发明从GenBank等数据库获得103条新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组序列，并根据如SEQ ID NO:1所示的序列(属于新型冠状病毒SARS-CoV-2的S基因)，用软件Primerdesign V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计出五组用于对新型冠状病毒SARS-CoV-2进行RT-LAMP检测的引物，各组引物的核苷酸序列如下表1所示。

新型冠状病毒SARS-CoV-2的S基因序列SEQ ID NO:1：

ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACATAA

表1：新型冠状病毒SARS-CoV-2通用检测引物的核苷酸序列信息

分别利用上述五组检测引物对新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性质粒pUC57-nCoV-S(将用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性保守靶基因序列即SEQ ID NO:1全长序列克隆至pUC57载体上获得，该克隆步骤由生工生物工程有限公司完成)进行LAMP扩增反应。反应结束后，直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化。

检测结果如图1所示，可见相对于Set-1、Set-4、Set-3和Set-5引物组，Set-2引物组的扩增效果最好，其反应前后的浊度变化最为明显，并且出现浊度变化所耗费的时间也最短，因此，本发明确定使用Set-2引物组作为以下实施例中检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的最佳引物组。

实施例2：新型冠状病毒SARS-CoV-2RT-LAMP检测方法的建立

该实施例在相同的反应体系下，分别在60-65℃条件下使用实施例1的Set-2引物组对新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA(市售SARS-CoV-2假病毒)进行LAMP检测。具体包括以下步骤：

1)以新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA(终浓度＝1ng/μl)为模板，25μl RT-LAMP反应体系包括：阳性质粒模板2μl、2.5μl 10×ThermoPol反应缓冲液(New EnglandBiolabs Inc.,Massachusetts,USA,1×ThermoPol反应缓冲液包括20.0mM Tris-HCl(pH8.8),10.0mM KCl,2.0mM MgSO₄,10.0mM(NH₄)₂SO₄,0.1％Triton X-100)、5mM betaine(Sigma-Aldrich Inc.,St Louis,USA)4μl、100mM MgSO₄(New England Biolabs Inc.,Massachusetts,USA)1.5μl、10mM dNTP(TaKaRa Bio Inc.,Clontech Laboratories,Inc.,Dalian,China)3.5μl、Bst DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.,Massachusetts,USA)1μl、WarmStart RTx反转录酶(New England Biolabs Inc.,Massachusetts,USA，模板为RNA时添加，即RT-LAMP时添加；当使用新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性质粒pUC57-nCoV-S为模板时，无需添加)0.5μl，引物加入量为：100μM FIP/BIP引物各0.8μl(终浓度32pmol)，100μMF3/B3所示引物各0.1μl(终浓度4pmol)，100μM LF/LB引物各0.4μl(终浓度16pmol)，ddH₂O补至25μl。

2)扩增条件为：分别置60-65℃条件下恒温60min。

3)反应结束后进行结果判定：直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，检测结果如图2所示。

根据图2中的检测结果，可见当反应温度为62℃-63℃时，反应液反应前后的浊度变化相对于其他温度条件较为明显，并且出现浊度变化所用的时间也相对较短，其中以反应温度为63℃的反应前后浊度变化最为明显，出现浊度变化所用的时间也最短，因此，本发明确定使用反应温度为63℃作为新型冠状病毒SARS-CoV-2RT-LAMP检测方法的最佳反应温度。

实施例3：新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-LAMP检测方法的特异性、灵敏度

该实施例使用实施例1获得的Set-2引物组，采用实施例2的最佳反应温度下的新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-LAMP检测方法对新型冠状病毒SARS-CoV-2进行检测，以验证该方法的特异性和灵敏度。

3.1、特异性检测

该步骤分别以新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性质粒pUC57-nCoV-S及假病毒，本实验室保存的常见的呼吸道病毒冠状病毒HCoV-OC43、冠状病毒HCoV-NL63、冠状病毒HCoV-229E、冠状病毒HCoV-HKU1，急性呼吸窘迫综合征冠状病毒SARS-CoV(假病毒)、中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV(假病毒)，流感病毒influenzaA-H3N2,H1N1,influenza B,副流感病毒parainfluenza viruses(PIV)type 1/2/3/4,腺病毒adenoviruses(ADV)type 1/2/3/4/5/6/7,呼吸道合胞病毒respiratory syncytial virus(RSV)type A/B,人偏肺病毒human metapneumovirus(HMPV),人博卡病毒humanbocavirus(BoV),鼻病毒rhinovirus(Rh)type A/B/C,肺炎支原体标准株M129/FH、肺炎克雷伯菌ATCC2146、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌为模板，Nuclease-free水为阴性对照，以检测上述实施例2确定的最佳的新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-LAMP检测方法(反应温度为63℃，反应体系参见实施例2)的特异性。

反应结束后进行结果判定：在反应液中添加1μl的(终反应体系为26μl)含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰的钙黄绿素颜色指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果(原理为：钙黄绿素是金属离子指示剂，钙黄绿素与试剂中的Mn²⁺结合处于淬灭状态，当扩增反应发生释放出的焦磷酸与Mn²⁺结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光)，绿色表示待测样品中存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阳性)，橙色表示待测样品中不存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阴性)，如图4所示；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果(原理为：LAMP反应的过程中会产生释放焦磷酸，焦磷酸与体系中的Mg²⁺结合为焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应)，浊度上升(>0.1)表示待测样品中存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阴性)，如图3所示。

如图3和图4所示，S1:positive control；S2:negative control；S3:HCoV-229E-1；S4:HCoV-229E-2；S5:HCoV-NL63-1；S6:HCoV-NL63-2；S7:HCoV-OC43-1；S8:HCoV-OC43-2；S9:HCoV-HKU1-1；S10:HCoV-HKU1-2；；S11:SARS-CoV；S12:MERS-CoV；S13:H3N2-1；S14:H3N2-2；S15:H3N2-3；S16:H1N1-1；S17:H1N1-2；S18:influenza B-1；S19:influenza B-2；S20:influenza B-3；S21:PIV-1-1；S22:PIV-1-2；S23:PIV-2-1；S24:PIV-2-2；S25:PIV-3-1；S26:PIV-3-2；S27:PIV-4-1；S28:PIV-4-2；S29:ADV-1-1；S30:ADV-1-2；S31:ADV-2-1；S32:ADV-2-2；S33:ADV-3-1；S34:ADV-3-2；S35:ADV-4-1；S36:ADV-5-1；S37:ADV-5-2；S38:ADV-6-1；S39:ADV-7-1；S40:ADV-7-2；S41:RSV A-1；S42:RSV A-2；S43:RSV B-1；S44:RSVB-2；S45:HMPV-1；S46:HMPV-2；S47:BoV-1；S48:BoV-2；S49:Rh A-1；S50:RhA-2；S51:Rh B-1；S52:RhB-2；S53:Rh C-1；S54:MP-FH；S55:MP-M129；S56:流感嗜血杆菌；S57:金黄色葡萄球菌；S58:肺炎克雷伯菌；S59:肺炎链球菌；S60:铜绿假单胞菌。图中：“+”为阳性，“-”为阴性。根据图3和图4结果，可见只有样本1(新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性质粒pUC57-nCoV-S)发生了LAMP反应，其余均未发生，而且钙黄绿素指示剂染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-LAMP检测方法具有较高的特异性。

3.2、灵敏度检测

该步骤比较上述实施例2提供的RT-LAMP检测方法与普通PCR方法检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的灵敏度，方法为：使用实施例1获得的新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性质粒pUC57-nCoV-S，对其以10倍梯度进行稀释，再以经梯度稀释的质粒(浓度分别为1ng/μl、10^{- 1}ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl、10^-6ng/μl、10^-7ng/μl、10^-8ng/μl)为模板，分别用实施例2的LAMP检测方法与普通PCR方法(PCR检测引物序列为nCoV-F：5’-CTTCCCTCAGTCAGCACCTC-3’(SEQ ID NO:27)，nCoV-R：5’-AACCAGTGTGTGCCATTTGA-3’(SEQID NO:28))对上述梯度稀释的新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性质粒进行检测，以比较两者的检测灵敏度。

结果判定如上述步骤3.1所述，采用在反应液中添加钙黄绿素颜色指示剂以及采用浊度仪两种方法进行检测判定。检测结果如图5-图7所示，其中图5为浊度仪检测结果，图6为钙黄绿素指示剂颜色反应检测结果，图7为普通PCR法的灵敏度检测结果。图5中：1-9分别为1ng/μl、10^-1ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl、10^-6ng/μl、10^-7ng/μl、10^-8ng/μl；图6、图7中：1-8分别为10^-1ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl、10^-6ng/μl、10^-7ng/μl、10^-8ng/μl；“+”为阳性，“-”为阴性；M：DNA marker D2000。可见上述实施例2提供的RT-LAMP检测方法的最低检测浓度为10^-6ng/μl，而普通PCR方法最低检测浓度为10^-5ng/μl，而且钙黄绿素指示剂染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明用RT-LAMP方法检测新型冠状病毒SARS-CoV-2比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。

实施例4：新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-LAMP检测试剂盒

本实施例提供一种用于新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的RT-LAMP检测试剂盒，具体包括：

用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的专用特异性引物组(即实施例1获得的nCoV-2引物组，包括引物F3/B3、FIP/BIP和LF/LB)；

具体地，用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-LAMP检测试剂盒包括以下用于25μl反应体系的试剂：2.5μl 10×ThermoPol反应缓冲液(1×ThermoPol反应缓冲液包括20.0mM Tris-HCl(pH 8.8),10.0mM KCl,2.0mM MgSO₄,10.0mM(NH₄)₂SO₄,0.1％Triton X-100)、5mM betaine 4μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、10mM dNTP 3.5μl、BstDNA聚合酶1μl、WarmStart RTx反转录酶(模板为RNA时添加，即RT-LAMP时添加；当使用新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性质粒pUC57-nCoV-S为模板时，无需添加)0.5μl，引物加入量为：100μM FIP/BIP引物各0.8μl(终浓度32pmol)，100μM F3/B3所示引物各0.1μl(终浓度4pmol)，100μM LF/LB所示引物各0.4μl(终浓度16pmol)；使用时，向25μl反应体系中添加的模板(待测样品的基因组RNA，终浓度>1ng/μl)的量为2μl，ddH₂O补至25μl；

为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA(实施例1中所述)，所述阴性对照为不含新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)；

为方便检测，试剂盒中还可包括记载实施例2获得的RT-LAMP检测方法和实施例3所述的结果检测判定方法的说明书或其他载体，其中检测方法包括反应条件：置62℃-63℃(优选63℃)恒温45-60min(优选60min)。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京金沃夫生物工程科技有限公司

<120> 检测2019-nCoV中S基因的RT-LAMP试剂盒及其专用引物和应用

<130> GAI20CN1896

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3822

<212> DNA

<213> 2019-nCoV的S基因

<400> 1

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

tctattgcca tacccacaa 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

ggtgttttgt aaatttgttt gac 23

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

cattcagttg aatcaccaca aatgtgtgtt accacagaaa ttctacc 47

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

gttgcaatat ggcagttttt gtacattggg tgtttttgtc ttgtt 45

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

actgatgtct tggtcataga cact 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 7

taaaccgtgc tttaactgga atagc 25

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 8

ttggtgcagg tatatgcg 18

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 9

acattgtaca atctactgat gtc 23

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 10

taggcaatga tggattgact agctattatc agactcagac taattctcc 49

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 11

taactctatt gccataccca caaatttggt catagacact ggtag 45

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 12

caggaacaaa tacttctaac ca 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 13

tgtcacactc atatgagttg t 21

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 14

ttgatctgca tgaatagcaa caggggttgc tgttctttat cagga 45

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 15

tactcctact tggcgtgttt attcgacatg ttcagcccct at 42

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 16

taatgttttt caaacacgtg caggc 25

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 17

acaatttggc agagacattg 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 18

ccaagtagga gtaagttgat ct 22

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 19

gacaccacca aaagaacatg gtgcactact gatgctgtcc g 41

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 20

aggaacaaat acttctaacc aggttgcatg aatagcaaca ggga 44

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 21

agaatctcaa gtgtctgtgg atca 24

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 22

tatcaggatg ttaactgcac agaag 25

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 23

tttggtggtg tcagtgtt 18

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 24

actcatatga gttgttgaca tg 22

<210> 25

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 25

agggacttct gtgcagttaa catcaccagg aacaaatact tctaacc 47

<210> 26

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 26

gatcaactta ctcctacttg gcgagcccct attaaacagc c 41

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 27

cttccctcag tcagcacctc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 28

aaccagtgtg tgccatttga 20

Claims (10)

1.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物组，其包括具有SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的引物。

2.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其包含权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×Thermopol反应缓冲液、MgSO₄、betaine、dNTP，Bst DNA聚合酶，WarmStart RTx反转录酶。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其中还包含阳性对照和/或阴性对照；优选地，所述阳性对照包含新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA，所述阴性对照为不含新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA的反应体系。

5.权利要求1所述的引物组或权利要求2-4任一项所述的试剂盒在体外检测样品中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述引物组是用于RT-LAMP反应；

优选地，引物组在每25μl反应体系中的使用浓度为：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的引物的终浓度独立地为2-8pmol，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示序列的引物的终浓度独立地为24-36pmol，SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示序列的引物的终浓度独立地为12-18pmol；

更优选地，引物组在每25μl反应体系中的使用浓度为：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的引物的终浓度独立地为8pmol，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示序列的引物的终浓度独立地为32pmol，SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示序列的引物的终浓度独立地为16pmol。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，RT-LAMP反应体系还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×Thermopol反应缓冲液2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，Bst DNA聚合酶1μl，WarmStart RTx反转录酶0.5μl，ddH₂O补至25μl；

优选地，所述基础反应试剂在25μl反应体系中的使用量为：12.5μl。

8.根据权利要求6所述的应用，其中，检测包括以下步骤：

S1：提取待测样品RNA；

S2：反应体系配制：25μl反应体系包含2μl待测样品RNA、10×Thermopol反应缓冲液2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，Bst DNA聚合酶1μl，WarmStart RTx反转录酶0.5μl，引物加入量为：100μM FIP/BIP引物各0.8μl(终浓度32pmol)，100μM F3/B3所示引物各0.1μl(终浓度4pmol)，100μM LF/LB引物0.4μl(终浓度16pmol)，ddH₂O补至25μl；

S3：将反应体系置62℃-63℃条件下恒温扩增反应45-60min，获得反应液；

S4：结果分析：使用钙黄绿素颜色指示剂或浊度仪对所述反应液进行检测分析。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，步骤S3中将反应体系置63℃条件下恒温扩增反应60min。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其中，步骤S4中所述结果分析的具体方法为：当使用钙黄绿素颜色指示剂进行检测时，在反应液中添加1μl的钙黄绿素颜色指示剂，呈现绿色表示待测样品中存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阳性)，呈现橙色表示待测样品中不存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阴性)；

当使用浊度仪进行检测时，浊度上升(>0.1)表示待测样品中存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阴性)。

Images