KR20210158368A

KR20210158368A - Rna 검출 방법

Info

Publication number: KR20210158368A
Application number: KR1020210183007A
Authority: KR
Inventors: 조석근
Original assignee: 주식회사 제노헬릭스
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2021-12-30
Also published as: US20210381034A1; KR20220160129A; AU2021203460B2; CA3119385A1; EP3919628A1; JP2021192604A; KR102493424B1; AU2021203460A1; KR102468839B1; JP2023071966A; KR20210150041A

Abstract

본 발명은 RNA의 분석 및 검출 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 특히, 본 발명은 짧은 염기서열의 RNA까지 분석이 가능하면서도 높은 민감도 및 정확도로 정량적 검출까지 가능하여 감염증, 암 등 여러 질환의 진단 용도로도 널리 활용될 수 있다.

Description

RNA 검출 방법{A METHOD OF DETECTING RNA}

삶의 질이 향상되면서 질병의 조기 진단에 대한 관심이 커지고 있으며, 분자진단 기술은 질병을 유발하는 병원체의 유전정보 (DNA/RNA)를 직접적으로 검출하기 때문에, 기존의 항원/항체 반응을 기반으로 하여 질병의 간접 인자 (indirect factor)를 검출하는 면역진단 기술의 단점을 해결할 수 있는 기술로서 많은 관심을 받고 있다.

또한, 최근 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)이 크게 유행하면서 전 세계적으로 많은 사망자가 발생하고 WHO에서는 팬데믹 선언까지 하였다. 이러한 RNA 바이러스에 의한 질병의 경우, 높은 돌연변이 발생률에 의해 더욱 큰 피해가 발생되며 감염 여부에 대한 조기 진단이 더욱 요구되고 있다.

한국공개특허 제10-2010-0075524호에서는 RNA로부터 DNA 프라이머를 이용하여 이중사슬 DNA를 합성하여 상기 이중사슬 DNA를 검출하는 기술을 개시하고 있으나, 형광강도로 이중사슬 DNA의 존재정도를 확인할 뿐, 매우 낮은 농도에서 구체적인 수치까지 검출하는 기술에 대해서는 개시하고 있지 않다.

RNA의 발현 양상은 감염, 암 등의 초기 단계에서 민감하게 반응하므로 조기예측, 발견에 있어서 강한 이점을 나타낸다. 또한 단순한 채혈만으로 다양한 암을 검사할 수 있기에 환자로부터 몸에 가해지는 부담이 감소될 수 있다. 나아가, 상기 감염, 암 외에도 알츠하이머, 파킨슨 병 등 여러 난치성 질환의 진단에 있어서 RNA를 높은 민감도로 신속하게 검출함으로써 조기 진단이 이루어 질 수 있도록 하는 기술 개발에 대한 요구가 증가되고 있다.

본 발명의 목적은 RNA 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 RNA 검출용 센서 DNA를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은, a) 검출 대상이 되는 타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서DNA를 타겟 RNA와 혼성화하는 단계; b) 상기 타겟 RNA를 주형으로 하고, 상기 센서DNA를 프라이머로 하여 중합효소로 중합하는 단계; c) 상기 b) 단계에서 중합된 가닥에 대응하는 프라이머를 이용하여 증폭하여 앰플리콘을 생성하는 단계; d) 상기 앰플리콘의 서열을 분석하는 단계를 포함하는, RNA 검출 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 센서 DNA는 3' 말단의 아민(amine) 영역이 변형된 것일 수 있다. 이러한 변형을 통해 b) 단계의 중합효소에 의해 중합되는 과정에서 센서 DNA의 중합이 일어나는 것을 방지할 수 있다. 이에 따라, 변형 형태는 센서 DNA의 중합을 방지할 수 있는 형태이면 적용 가능하며, 형태가 제한되는 것은 아니다.

또한 구체적으로, 상기 c) 단계의 프라이머는 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 것일 수 있다. 상기 c) 단계의 프라이머는 증폭 반응을 통해 앰플리콘을 생성하기 위해 이용되는 것으로서, 5' 말단에 결합된 인산을 통해 증폭 대상이 되는 가닥에 결합할 수 있는 것이면 프라이머의 염기 서열은 제한없이 적용될 수 있다. 즉, 검출 대상이 되는 타겟 RNA 또는 센서 DNA의 모듈 영역에 따라 염기 서열은 변경될 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 c) 단계에서 앰플리콘이 복수 개 생성된 경우, d) 생성된 앰플리콘들을 결찰(ligation)시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다.

이러한 결찰을 통해 짧은 염기 서열을 분석하지 못하는 종래 옥스포드 나노포어 시퀀싱 시스템(Oxford Nano)에서도 짧은 길이의 RNA 염기 서열까지 분석할 수 있다. 즉, 본 발명의 기술을 통해 RNA의 길이에 제한되지 않고 정확히 분석할 수 있다.

세부적으로, 상기 앰플리콘의 결찰 후 dATP와 DNA 중합효소(polymerase)를 가하여 3' 말단에 아데닌(adenine, A)를 붙여주는 단계를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 DNA 중합효소는 Taq 중합효소(polymerase)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 구체적으로, 상기 d) 단계는 앰플리콘들을 결찰시킨 후, 상기 결찰된 앰플리콘의 양 말단에 서열 분석을 위한 어댑터(adaptor)를 결합시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 어댑터는 서열 분석 장비가 인식할 수 있도록 하는 것으로서 옥스포드 나노포어 시퀀싱 장비, NGS(next generation sequencing) 장비 등 적용하는 서열 분석 장비에 따라 어댑터를 변경하여 결합시킬 수 있다.

또한, 더욱 구체적으로, 상기 d) 단계 이후 e) 결찰된 앰플리콘의 서열을 분석하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 e) 단계에서 서열 분석은 나노포어 서열 분석인 것일 수 있다.

상기 나노포어 서열 분석은 통상의 '나노포어 시퀀싱(Nanopore sequencing)'을 의미할 수 있다. 상기 '나노포어 시퀀싱'은 DNA 한 가닥을 생물학적 세공(biological pore) 속으로 통과시키면서 전기전도성의 차이를 측정해 다양한 염기를 판별하는 기술을 말한다. 이러한 나노포어 시퀀싱은 포어를 통과시키면서 염기 서열을 분석하기 때문에 짧은 염기 서열은 분석하지 못하는 단점이 있었으며, 이에 따라 짧은 길이의 RNA의 검출 및 분석에는 적용될 수 없었다.

본 발명은 앰플리콘들을 결찰함으로써 상기 나노포어 시퀀싱을 통해서도 분석이 가능한 수준의 길이를 제공하여 길이에 관계없이 RNA를 검출 및 분석할 수 있도록 하였다. 본 발명은 서열 분석 기법에 의한 제한없이 적용될 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 a) 단계 이전, 상기 타겟 RNA 내 고유한 바코드(barcode) 영역을 지정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 바코드 영역은 타겟 RNA의 종류에 따라 적절히 지정할 수 있으며, 타겟 RNA를 주형으로 진행되는 DNA 중합과정을 통해 상기 바코드 영역의 상보적인 서열이 중합된 DNA 가닥에 포함될 수 있다. 이후, 이러한 바코드의 상보적인 서열 영역의 존재 여부, 검출되는 바코드의 상보적인 서열 영역의 수를 확인하여 타겟 RNA의 존재 여부 및 수를 대응할 수 있다.

구체적으로, 상기 앰플리콘은 상기 앰플리콘은 타겟 RNA의 바코드 영역에 대한 상보적인 서열이 포함되어 증폭된 것일 수 있다. 타겟 RNA 종류에 따른 각각의 고유한 바코드 영역이 존재할 경우, 증폭을 통해 앰플리콘이 생성되는 과정에서 생성된 각각의 앰플리콘은 모두 각 앰플리콘 내 타겟 RNA의 바코드와 상보적인 서열 영역이 포함된 것일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 '검출'은 앰플리콘의 수를 측정함으로써 타겟 RNA의 수까지 정량적으로 검출 가능한 것일 수 있다.

상세하게는 상기 앰플리콘의 수는 앰플리콘에 포함된 타겟 RNA의 바코드 영역에 대한 상보적인 서열의 수를 측정하여 확인하는 것일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 COVID-19에 감염되지 않은 인간의 혈액 및 COVID-19에 감염된 인간의 혈액을 각각 샘플로 이용하여 검출되는 RNA를 분석하였다. COVID-19에 감염되지 않은 인간의 혈액으로부터 추출한 총 RNA에 여러 종류의 센서를 각각 1 fmol씩 혼합한 경우, 통상의 인체 내 존재하는 RNA는 다수 검출된 반면, COVID-19의 ORF7 은 검출되지 않음을 확인하였다(도 4). 또한, COVID-19에 감염된 인간의 혈액으로부터 추출한 총 RNA에 여러 종류의 센서를 각각 500 amol 씩 혼합한 경우, COVID-19 ORF7, COVID-19 N gene 및 COVID-19 RdRp 의 정량적 수치가 나타남을 확인하였다(도 5). 특히 코로나바이러스 유전자 부위에 따라 바이러스 유전자 부위에 따라 정량적으로 검출되는 양이 달라짐을 확인하였는 바, 유전자 부위의 발현 정도를 파악하여 감염 수준까지 진단하는 것에 적용될 수 있다. RNA 바이러스의 유전자 부위 발현 정도를 측정함으로써 감염 수준까지 판단할 수 있는 기술은 종래 보고된 바 없다.

나아가, 본 발명의 RNA 검출 방법 및 검출에 사용되는 센서 DNA의 구성은 검출 한계가 펨토몰(fmol), 아토몰(amol) 수준으로 매우 낮은 바, 종래 RNA 검출 기술에 비해 민감도 및 정확도가 모두 현저히 우수함을 나타낸다.

본 발명의 다른 측면은 타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 RNA 센싱 영역; 및 3' 말단의 아민(amine) 영역이 변형된 구조를 포함하는, RNA 검출용 센서DNA에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 센서는 RNA 검출을 위한 DNA 중합과정에 있어서, 프라이머로 이용되는 것일 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 센서는 나노포어 센서인 것일 수 있다. 상기 '나노포어 센서'는 나노포어(nanopore) 기반의 센서로서, 나노포어 시퀀싱을 적용할 수 있는 것임을 의미한다.

본 발명의 RNA 검출 방법 및 검출에 사용되는 센서 DNA의 구성은 검출 한계가 펨토몰(fmol), 아토몰(amol) 수준으로 매우 낮은 바, 종래 RNA 검출 기술에 비해 민감도 및 정확도가 현저히 우수하다.

이에 따라, 본 발명은 미세한 수준에서의 분자 진단이 가능하도록 함으로써인간 등 개체의 질환 발병 유무, 질환의 진행 단계, 잠복기에서의 바이러스 감염 여부 진단 등 기존 기술의 검출 한계를 극복하여 질환의 극 초기, 잠복기에서의 진단에까지도 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 검출 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 RNA 검출 과정에서 생성된 앰플리콘의 존재를 확인한 결과를 나타낸 것이다(COVID-19에 감염되지 않은 인간의 혈액 샘플).
도 3은 본 발명의 RNA 검출 과정에서 생성된 앰플리콘들이 결찰된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다(COVID-19에 감염되지 않은 인간의 혈액 샘플).
도 4는 COVID-19에 감염되지 않은 인간의 혈액 샘플에서의 본 발명 RNA 검출 기술의 정확도 및 민감도를 정량적 수치 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 RNA 검출 과정에서 생성된 앰플리콘의 존재를 확인한 결과를 나타낸 것이다(COVID-19에 감염된 인간의 혈액 샘플).
도 6은 본 발명의 RNA 검출 과정에서 생성된 앰플리콘들이 결찰된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다(COVID-19에 감염된 인간의 혈액 샘플).
도 7은 COVID-19에 감염된 인간의 혈액 샘플에서의 본 발명 RNA 검출 기술의 정확도 및 민감도를 정량적 수치 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 센서 DNA를 이용한 중합, 증폭 및 서열 분석

타겟 RNA와 센서 DNA를 혼합한 후, 센서 DNA가 타겟이 되는 RNA를 센싱(sensing)하고, 타겟 RNA에 결합함으로써 타겟 RNA 와 센서 DNA가 혼성화(hybridization)되도록 하였다.

센서 DNA는 타겟 RNA와의 상보적인 서열을 포함하는 센싱 영역을 포함하는 것으로, 상기 센싱 영역은 타겟 RNA를 감지하여 타겟 RNA와 혼성화하는 것으로서, 본 발명에서는 '센서 DNA'로 명명하였다.

타겟 RNA 와 센서 DNA가 혼성화되도록 한 후, 타겟 RNA를 주형으로 하고, 센서 DNA를 프라이머로 하여 DNA 중합효소(XenoT-PoL)를 이용하여 95도에서 30초, 63도에서 10분간 중합반응시켰다. 이후 센서 및 RNA를 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용하여 분해하였다

타겟이 되는 RNA의 특정 서열을 바코드(barcode)로 지정하여 명명할 수 있고, 이에 따라, 센서 DNA를 프라이머로 하여 중합된 가닥은 바코드에 상보적인 영역을 포함할 수 있다. 이후 검출에 있어서 중합된 가닥 내 타겟 RNA 바코드에 상보적인 영역의 수를 카운팅하여 타겟 RNA의 수를 정량적으로 측정할 수 있다.

이후 상기 중합된 가닥의 증폭을 위해 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 앰플리콘(들)을 생성시켰다. 상기 PCR은 통상의 PCR과 같은 방식으로 진행할 수 있으며, PCR의 온도 조건, 사이클 수 등은 상기 중합된 가닥, 이에 결합하는 프라이머 서열에 따라 적절히 변형하여 적용할 수 있다.

이후, 생성된 앰플리콘들을 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 결찰(ligation)시킨 후, 결찰된 앰플리콘들을 서열 분석(sequencing)하였다.

서열 분석의 예시로서, 상기 센서 DNA는 나노포어(nanopore) 기반의 센서로서, 상기 서열 분석은 나노포어를 이용한 서열 분석(나노포어 시퀀싱)을 적용할 수 있다. 구체적으로, 결찰된 앰플리콘들에 나노포어 어댑터를 결합시킨 후, 나노포어 시퀀싱을 진행할 수 있으며, 나노포어 시퀀싱은 공지된 제품을 이용하여 이의 매뉴얼에 따라 진행할 수 있다. 예를 들어, 나노포어 시퀀싱 장비인 Minion 칩에 샘플을 로딩 후 시퀀싱을 진행할 수 있다.

이하 실험예를 통하여 본 발명의 검출 방법의 정확도 및 민감도를 확인하였으며, 예시적으로 Hs_RNaseP, Hs-U6, COVID-19 ORF7, COVID-19 N gene, COVID-19 RdRp를 검출 대상 타겟 RNA로 하여 실험을 진행하였다. 상기 예시적 타겟 RNA를 검출하기 위한, 타겟 RNA에 상보적인 서열을 포함하는 센서 DNA의 서열은 하기 표 1에 정리된 바와 같다. 본 센서 DNA의 서열은 필요에 따라 변형할 수 있으며, 본 예시에 제한되는 것은 아니다.

상기 예시적 타겟 RNA의 정량적 검출을 위하여 타겟 RNA 내 지정한 바코드 영역을 지정하고, 타겟 RNA를 주형으로 하여 중합된 DNA 가닥 내 포함된 바코드 영역의 상보적 서열은 하기 표 2에 정리된 바와 같다. 중합된 DNA 가닥 내 포함된 바코드 영역의 상보적 서열의 수를 카운팅함으로써 타겟 RNA를 정량적으로 검출할 수 있다. 특히, 바코드 영역의 상보적 서열은 정량적 검출에 있어 카운팅 되는 부분으로서 앰플리콘들의 결찰 단계에서 역의 방향으로 결찰되는 가닥이 존재할 수 있는 가능성을 고려하여 정방향 및 역방향, 2가지 경우의 상보적 서열이 카운팅되도록 하였다. 상기와 같이 방향성까지 고려함으로써 역방향으로 결찰되더라도 누락되지 않고 검출될 수 있도록 하여 정량적 검출의 정확도가 더욱 유지될 수 있도록 하였다.

상기 바코드 영역의 서열은 필요에 따라 변형할 수 있으며, 이에 따라 검출되는 타겟 RNA 바코드의 상보적인 서열 역시 바코드 영역 서열에 맞추어 변형될 수 있고, 본 예시에 제한되는 것은 아니다.

또한 예시적으로, 타겟 RNA를 주형으로 하고 센서 DNA를 프라이머로 하여중합된 가닥의 증폭을 위해 사용한 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 프라이머 서열은 하기 표 3에 정리된 바와 같다. 본 프라이머는 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 것을 특징으로 할 뿐, 프라이머의 서열은 필요에 따라 변형할 수 있으며, 본 예시에 제한되는 것은 아니다.

실험예 1. 인간 혈액에서의 본 발명 RNA 검출 기술의 정확도 확인

COVID-19에 감염되지 않은 인간의 혈액에서 FavorPrep™Blood/Cultured Cell Total RNA Mini Kit 을 사용하여 RNA를 추출하였다. 상기 실시예 1의 방식을 이용하여 타겟 RNA가 정확히 검출되는지 확인하였다.

상기와 같이 추출한 총 RNA 1 μg 및 Hs-RNaseP, Hs-U6, COVID-19 ORF7 각각에 대한 3 종류의 센서 DNA를 각각 1 fmol씩 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 100 mM KCl, 20 mM MgSO₄, 1% Triton X-100, (pH 8.8 at 25°C)), 1 ㎕의 10 mM dNTP 및 2 unit XenoT-POL을 넣고 혼합하였다. 상기 혼합물을 95 ℃에서 30초 간 가열한 후 63 ℃ 에서 10 분간 인큐베이션(incubation)하여 중합가닥이 생성되도록 하였다.

이후 MEGAquick-spin™ Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업(clean up)하고, 60 ㎕의 증류수로 용리(elution)하였다. 상기 중합된 3종의 DNA 가닥의 증폭을 한 개의 튜브에서 관찰하기 위해서 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 각 유전자를 증폭할 수 있는 5’ 말단이 인산화(phosphate)된 프라이머들을 이용하였다. 98 ℃ 2 분 1사이클, 98 ℃ 10초, 62 ℃ 10초 35 사이클의 조건으로 PCR을 진행하였다. PCR 산물을 10% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel(19:1))에 전기영동 후 젤닥(Gel Doc)을 이용하여 PCR 산물인 앰플리콘의 존재를 확인하였다(도 2).

이후, 상기 PCR 산물을 MEGAquick-spin™ Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하였다. 이후 클린업 된 앰플리콘들을 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 결찰(ligation)시켰다. 500 ng의 앰플리콘 30 ㎕와 결찰 반응용 완충용액(66 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl_2,1 mM ATP, 1 mM DTT, 7.5% Polyethylene glycol (PEG 6000)) 35 ㎕, DNA 리가아제 100 unit, 1 ㎕ 을 섞은 후, 25°C에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 결찰 산물을 10% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel(29:1))에 전기영동 후 젤닥(Gel Doc)을 이용하여 결찰된 앰플리콘을 확인하였다(도 3).

상기와 같이 결찰된 앰플리콘 가닥들을 클린업 하고, 60 ㎕의 증류수로 용리하였다.

용리된 앰플리콘 DNA 가닥 40 ㎕, 1 mM dATP 1㎕, taq DNA 중합효소(polymerase) 1 ㎕ (5 unit), 5 ㎕ 반응용 완충용액(200 mM Tris-HCl/pH 8.8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 100 mM　β-mercaptoethanol) 및 증류수를 혼합하여 50 ㎕에 혼합물을 만든 후 72℃에서 20 분 동안 인큐베이션 하여 3’ 말단에 dATP를 테일링(tailing) 시켰다. dATP 테일링 된 DNA 산물을 MEGAquick-spin™ Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하였다. 이후 나노포어 시퀀싱을 위한 어댑터 결합(adaptor ligation, SQK-LSK109), AMPure XP 비드를 이용한 클린업, 유세포 프라이밍(priming the flow cell) 및 유세포 로딩(loading the flow cell) 과정은 나노포어 시퀀싱 프로토콜에 따라 수행하였다. 이후 수득된 나노포어 시퀀싱 파일에서 Hs-RNaseP, Hs-U6, COVID-19 ORF7 각 타겟 RNA를 기초로 생성된 앰플리콘 영역 내의 타겟 RNA 바코드의 상보적인 서열인 10 base의 뉴클레오타이드 서열을 카운팅하여 검출 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 10,292개의 Hs_U6, 58,811개의 Hs_RNaseP 가 카운팅되었고 음성대조군(negative control, NTC)로 사용된 COVID-19의 ORF7 은 검출되지 않았다.

상기와 같은 결과는 센서의 농도가 1 fmol 로 현저히 낮음에도 불구하고 RNA의 종류를 구분하여 감지할 수 있음을 나타낸 것인 바, 본 발명의 센서 DNA를 이용한 RNA 검출 기술의 검출 한계가 매우 낮으며 높은 민감도를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

실험예 2. 바이러스 감염된 인간 혈액에서의 본 발명 RNA 검출 기술의 정확도 확인

COVID-19에 감염된 human cell line에서 추출된 RNA(NCCP no. 43326)를 국가병원체은행에서 분양 받아 본 실험을 진행하였으며, 상기 실시예 1의 방식을 이용하여 타겟 RNA가 정확히 검출되는지 확인하였다.

총 RNA 500 ng 및 Hs-RNaseP, COVID-19 ORF7, COVID-19 N gene 및 COVID-19 RdRp 각각에 대한 4 종류의 센서 DNA를 각각 500 amol씩 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 100 mM KCl, 20 mM MgSO₄, 1% Triton X-100, (pH 8.8 at 25°C)), 1 ㎕의 10 mM dNTP 및 2 unit XenoT-POL을 넣고 혼합하였다. 상기 혼합물을 95 ℃에서 30초 간 가열한 후 63 ℃ 에서 10 분간 인큐베이션(incubation)하여 중합가닥이 생성되도록 하였다.

이후 MEGAquick-spin™ Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업(clean up)하고, 60 ㎕의 증류수로 용리(elution)하였다. 상기 중합된 4 종의 DNA 가닥의 증폭을 한 개의 튜브에서 관찰하기 위해서 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 각 유전자를 증폭할 수 있는 5’ 말단이 인산화(phosphate)된 프라이머들을 이용하였다. 98 ℃ 2 분 1사이클, 98 ℃ 10초, 62 ℃ 10초 35 사이클의 조건으로 PCR을 진행하였다. PCR 산물을 10% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel(19:1))에 전기영동 후 젤닥(Gel Doc)을 이용하여 PCR 산물인 앰플리콘의 존재를 확인하였다(도 5).

이후, 상기 PCR 산물을 MEGAquick-spin™ Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하였다. 이후 클린업 된 앰플리콘들을 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 결찰(ligation)시켰다. 300 ng의 앰플리콘 19 ㎕와 결찰 반응용 완충용액(66 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl_2,1 mM ATP, 1 mM DTT, 7.5% Polyethylene glycol (PEG 6000)) 35 ㎕, DNA 리가아제 100 unit, 1 ㎕ 을 섞은 후, 25°C에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 결찰 산물을 10% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel(29:1))에 전기영동 후 젤닥(Gel Doc)을 이용하여 결찰된 앰플리콘을 확인하였다(도 6).

용리된 앰플리콘 DNA 가닥 40 ㎕, 1 mM dATP 1㎕, taq DNA 중합효소(polymerase) 1 ㎕ (5 unit), 5 ㎕ 반응용 완충용액(200 mM Tris-HCl/pH 8.8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 100 mM　β-mercaptoethanol) 및 증류수를 혼합하여 50 ㎕에 혼합물을 만든 후 72℃에서 20 분 동안 인큐베이션 하여 3’ 말단에 dATP를 테일링(tailing) 시켰다. dATP 테일링 된 DNA 산물을 MEGAquick-spin™ Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하였다. 이후 나노포어 시퀀싱을 위한 어댑터 결합(adaptor ligation, SQK-LSK109), AMPure XP 비드를 이용한 클린업, 유세포 프라이밍(priming the flow cell) 및 유세포 로딩(loading the flow cell) 과정은 나노포어 시퀀싱 프로토콜에 따라 수행하였다. 이후 수득된 나노포어 시퀀싱 파일에서 Hs-RNaseP, COVID-19 ORF7, COVID-19 N gene 및 COVID-19 RdRp 각 타겟 RNA를 기초로 생성된 앰플리콘 영역 내의 타겟 RNA 바코드의 상보적인 서열인 10 base의 뉴클레오타이드 서열을 카운팅하여 검출 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 2,253개의 N gene(COVID-19), 42,613개의 RdRP(COVID-19), 220개의 ORF7(COVID-19), 10,092개의 Hs_RNaseP 가 카운팅되었다.

상기와 같은 결과는 센서의 농도가 500 amol 로 현저히 낮음에도 불구하고 RNA의 종류를 구분하여 감지할 수 있을 뿐 아니라, 바이러스 감염 여부까지 진단해낼 수 있음을 나타낸 것이다. 이로부터, 본 발명의 센서 DNA를 이용한 RNA 검출 기술은 RNA 바이러스 감염 여부까지 매우 낮은 검출 한계로부터 높은 민감도로 진단해낼 수 있음을 확인하였다. 특히 본 발명의 RNA 검출 기술은 단순히 존재 유무의 파악을 넘어서 바이러스 유전자 부위에 따라 정량적으로 검출되는 양이 달라짐을 확인하였는 바, 유전자 부위의 발현 정도를 파악하여 감염 수준까지 진단하는 것에 적용될 수 있다.

상기와 같은 결과는, 본 발명의 기술은 바이러스, 세균 등에 의한 감염증, 암 등의 지표가 되는 RNA의 존재를 단순 검출이 아닌 정량적인 수준에서의 측정까지 함에 따라 정상, 질병이 시작되고 있는 단계, 잠복기, 발병기 등을 분자 수준에서 빠르게 진단할 수 있음을 나타내는 것이다.

특히, 본 발명의 RNA 검출 방법 및 검출에 사용되는 센서 DNA의 구성은 검출 한계가 펨토몰(fmol), 아토몰(amol) 수준으로 매우 낮은 바, 종래 RNA 검출 기술에 비해 민감도 및 정확도가 모두 현저히 우수함을 나타낸다.

상기와 같이 본 발명은 미세한 수준에서의 분자 진단이 가능하도록 함으로써인간 등 개체의 질환 발병 유무, 질환의 진행 단계, 잠복기에서의 바이러스 감염 여부 진단 등 기존 기술의 검출 한계를 극복하여 질환의 극 초기, 잠복기에서의 진단에까지도 적용될 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Xenohelix. Co., Ltd. <120> A METHOD OF DETECTING RNA <130> 21PP31199 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hs-RNaseP sensor DNA <400> 1 aagggagtgc tgacagagac tg 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hs-U6 sensor DNA <400> 2 atatggaacg cttcacgaat ttgc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 ORF7 sensor DNA <400> 3 tacgccgtca ggacaagcaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 N gene sensor DNA <400> 4 tgcgcgacat tccgaagaac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 RdRp gene sensor DNA <400> 5 atttgttcgc gtggtttgcc 20 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of Hs-RNaseP barcode region <400> 6 ttgtcttcca 10 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of Hs-RNaseP barcode region <400> 7 tggaagacaa 10 <210> 8 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of Hs-U6 barcode region <400> 8 tactaaaatt 10 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of Hs-U6 barcode region <400> 9 aattttagta 10 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of COVID-19 ORF7 barcode region <400> 10 attcaccatt 10 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of COVID-19 ORF7 barcode region <400> 11 aatggtgaat 10 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of COVID-19 N gene barcode region <400> 12 ccagaacaaa 10 <210> 13 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of COVID-19 N gene barcode region <400> 13 tttgttctgg 10 <210> 14 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of COVID-19 RdRp gene barcode region <400> 14 tggtggacag 10 <210> 15 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of COVID-19 RdRp gene barcode region <400> 15 tggtggacag 10 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hs_RNaseP Forward primer <400> 16 cggccatcag aaggagatga aga 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hs_RNaseP Reverse primer <400> 17 aagggagtgc tgacagagac tg 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hs_U6 Forward primer <400> 18 tgctcgcttc ggcagcacat a 21 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hs_U6 Reverse primer <400> 19 atatggaacg cttcacgaat ttgc 24 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 ORF7 Forward primer <400> 20 tcttctggaa catacgaggg ca 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 ORF7 Reverse primer <400> 21 tacgccgtca ggacaagcaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 N gene Forward primer <400> 22 aagctttcgg cagacgtggt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 N gene Reverse primer <400> 23 tgcgcgacat tccgaagaac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 RdRp gene Forward primer <400> 24 agctcatggg acacttcgca 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 RdRp gene Reverse primer <400> 25 atttgttcgc gtggtttgcc 20

Claims

a) 검출 대상이 되는 타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서DNA를 타겟 RNA와 혼성화하는 단계;
b) 상기 타겟 RNA를 주형으로 하고, 상기 센서DNA를 프라이머로 하여 중합효소로 중합하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 중합된 가닥에 대응하는 프라이머를 이용하여 증폭하여 앰플리콘을 생성하는 단계;
d) 상기 앰플리콘의 서열을 분석하는 단계를 포함하고,
상기 c) 단계에서 앰플리콘이 복수 개 생성된 경우,
d') 생성된 앰플리콘들을 결찰(ligation)시키는 단계를 더욱 포함하며,
상기 d') 단계 이후 e) 결찰된 앰플리콘의 서열을 분석하는 단계를 포함하는, RNA 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 센서 DNA는 3' 말단의 아민(amine) 영역이 변형된 것인, RNA 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 c) 단계의 프라이머는 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 것인, RNA 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 d') 단계는 앰플리콘들을 결찰시킨 후, 상기 결찰된 앰플리콘의 양 말단에 서열 분석을 위한 어댑터(adaptor)를 결합시키는 것을 추가로 포함하는 것인, RNA 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 d) 또는 e) 단계에서 서열 분석은 나노포어 서열 분석인 것인, RNA 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 a) 단계 이전, 상기 타겟 RNA내 고유한 바코드(barcode) 영역을 지정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, RNA 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 앰플리콘은 타겟 RNA의 바코드 영역에 대한 상보적인 서열이 포함되어 증폭된 것인, RNA 검출 방법.
제7항에 있어서,
상기 검출은 앰플리콘의 수를 측정함으로써 타겟 RNA의 수까지 정량적으로 검출 가능한 것인, RNA 검출 방법.
제8항에 있어서,
상기 앰플리콘의 수는 앰플리콘에 포함된 타겟 RNA의 바코드 영역에 대한 상보적인 서열의 수를 측정하여 확인하는 것인, RNA 검출 방법.
타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 RNA 센싱 영역; 및
3' 말단의 아민(amine) 영역이 변형된 구조를 포함하는, RNA 검출용 센서DNA로서,
상기 RNA 검출은,
a) 검출 대상이 되는 타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서DNA를 타겟 RNA와 혼성화하는 단계;
b) 상기 타겟 RNA를 주형으로 하고, 상기 센서DNA를 프라이머로 하여 중합효소로 중합하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 중합된 가닥에 대응하는 프라이머를 이용하여 증폭하여 앰플리콘을 생성하는 단계;
d) 상기 앰플리콘의 서열을 분석하는 단계를 포함하고,
상기 c) 단계에서 앰플리콘이 복수 개 생성된 경우,
d') 생성된 앰플리콘들을 결찰(ligation)시키는 단계를 더욱 포함하며,
상기 d') 단계 이후 e) 결찰된 앰플리콘의 서열을 분석하는 단계를 포함하는 것인, RNA 검출용 센서DNA.
제10항에 있어서,
상기 센서는 RNA 검출을 위한 DNA 중합과정에 있어서, 프라이머로 이용되는 것인, RNA 검출용 센서 DNA.
제11항에 있어서,
상기 센서는 나노포어 센서인 것인, RNA 검출용 센서 DNA.