KR102358418B1

KR102358418B1 - 스몰 rna 검출 방법

Info

Publication number: KR102358418B1
Application number: KR1020200055429A
Authority: KR
Inventors: 조석근
Original assignee: 주식회사 제노헬릭스
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2022-02-04
Also published as: KR20210107589A; KR20210086410A; AU2021202823A1; CA3116522A1

Abstract

본 발명은 스몰(small) RNA의 분석 및 검출 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 짧은 염기서열의 RNA까지 분석이 가능하면서도 높은 민감도 및 정확도로 정량적 검출까지 가능하여 감염증, 암 등 여러 질환의 진단 용도로도 널리 활용될 수 있다.

Description

스몰 RNA 검출 방법{A METHOD OF DETECTING small RNA}

삶의 질이 향상되면서 질병의 조기 진단에 대한 관심이 커지고 있으며, 분자진단 기술은 질병을 유발하는 병원체의 유전정보 (DNA/RNA)를 직접적으로 검출하기 때문에, 기존의 항원/항체 반응을 기반으로 하여 질병의 간접 인자 (indirect factor)를 검출하는 면역진단 기술의 단점을 해결할 수 있는 기술로서 많은 관심을 받고 있다.

또한, 최근 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)이 크게 유행하면서 전 세계적으로 많은 사망자가 발생하고 WHO에서는 팬데믹 선언까지 하였다. 이러한 RNA 바이러스에 의한 질병의 경우, 높은 돌연변이 발생률에 의해 더욱 큰 피해가 발생되며 감염 여부에 대한 조기 진단이 더욱 요구되고 있다.

한편, miRNA 등 스몰(small) RNA는 생체 내 존재하는 단백질-비 암호화 RNA로, 특정 유전자의 전사 후 과정에 작용하여 해당 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 특히, 세포주기, 분화, 발달, 대사, 발암, 노화와 같은 생물학적 기능을 조절하여 생체의 항상성 유지를 매개하는 중요한 유전적 요소로 인지되며, 특히 이의 비정상적인 네트워크 형성은 세포 생리학적인 측면에서 치명적인 결함을 나타낼 수 있다.

또한, miRNA 등 스몰 RNA의 혈중 내 발현 양상은 암의 초기 단계에서 민감하게 반응하므로 암의 조기, 예측 발견에 있어서 강한 이점을 나타낸다. 또한 단순한 채혈만으로 다양한 암을 검사할 수 있기에 환자로부터 몸에 가해지는 부담이 감소될 수 있다. 나아가, 상기 감염, 암 외에도 알츠하이머, 파킨슨 병 등 여러 난치성 질환의 진단에 있어서 스몰 RNA를 높은 민감도로 신속하게 검출함으로써 조기 진단이 이루어 질 수 있도록 하는 기술 개발에 대한 요구가 증가되고 있다.

Journal of Human Genetics volume　65,　pages61-67(2020) 「Bioinformatics of nanopore sequencing」

본 발명의 목적은 스몰 RNA 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 스몰 RNA 검출용 센서 DNA를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은, a) 검출 대상이 되는 타겟 스몰(small) RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서DNA를 타겟 스몰 RNA와 혼성화하는 단계; b) 상기 센서 DNA의 모듈 영역을 주형으로 하고, 상기 타겟 스몰 RNA를 프라이머로 하여 중합효소로 중합하는 단계; c) 상기 센서 DNA의 모듈 영역 및 b) 단계에서 중합된 가닥에 대응하는 프라이머를 이용하여 증폭하여 앰플리콘을 생성하는 단계; d) 상기 앰플리콘의 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 스몰 RNA 검출 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 센서 DNA는 3' 말단의 아민(amine) 영역이 변형된 것일 수 있다. 이러한 변형을 통해 b) 단계의 중합효소에 의해 중합되는 과정에서 센서 DNA의 중합이 일어나는 것을 방지할 수 있다. 이에 따라, 변형 형태는 센서 DNA의 중합을 방지할 수 있는 형태이면 적용 가능하며, 형태가 제한되는 것은 아니다.

또한 구체적으로, 상기 c) 단계의 프라이머는 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 것일 수 있다. 상기 c) 단계의 프라이머는 증폭 반응을 통해 앰플리콘을 생성하기 위해 이용되는 것으로서, 5' 말단에 결합된 인산을 통해 증폭 대상이 되는 가닥에 결합할 수 있는 것이면 프라이머의 염기 서열은 제한없이 적용될 수 있다. 즉, 검출 대상이 되는 타겟 스몰 RNA 또는 센서 DNA의 모듈 영역에 따라 염기 서열은 변경될 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 c) 단계에서 앰플리콘이 복수 개 생성된 경우, d) 생성된 앰플리콘들을 결찰(ligation)시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다.

이러한 결찰을 통해 짧은 염기 서열을 분석하지 못하는 종래 옥스포드 나노포어 시퀀싱 시스템(Oxford Nano)에서도 스몰 RNA의 염기 서열을 분석할 수 있다.

세부적으로, 상기 앰플리콘의 결찰 후 dATP와 DNA 중합효소(polymerase)를 가하여 3' 말단에 아데닌(adenine, A)를 붙여주는 단계를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 DNA 중합효소는 Taq polymerase를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 구체적으로, 상기 d) 단계는 앰플리콘들을 결찰시킨 후, 상기 결찰된 앰플리콘의 양 말단에 서열 분석을 위한 어댑터(adaptor)를 결합시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 어댑터는 서열 분석 장비가 인식할 수 있도록 하는 것으로서 옥스포드 나노포어 시퀀싱 장비, NGS(next generation sequencing) 장비 등 적용하는 서열 분석 장비에 따라 어댑터를 변경하여 결합시킬 수 있다.

또한, 더욱 구체적으로, 상기 d) 단계 이후 e) 결찰된 앰플리콘의 서열을 분석하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 e) 단계에서 서열 분석은 나노포어 서열 분석인 것일 수 있다.

상기 나노포어 서열 분석은 통상의 '나노포어 시퀀싱(Nanopore sequencing)'을 의미할 수 있다. 상기 '나노포어 시퀀싱'은 DNA 한 가닥을 생물학적 세공(biological pore) 속으로 통과시키면서 전기전도성의 차이를 측정해 다양한 염기를 판별하는 기술을 말한다. 이러한 나노포어 시퀀싱은 포어를 통과시키면서 염기 서열을 분석하기 때문에 짧은 염기 서열은 분석하지 못하는 단점이 있었으며, 이에 따라 스몰 RNA의 검출 및 분석에는 적용될 수 없었다.

본 발명은 앰플리콘들을 결찰함으로써 상기 나노포어 시퀀싱을 통해서도 분석이 가능한 수준의 길이를 제공하여 스몰 RNA를 검출 및 분석할 수 있도록 하였다. 나아가, 본 발명은 서열 분석 기법에 의한 제한없이 적용될 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 센서 DNA는 고유한 바코드(barcode) 영역을 포함하는 것일 수 있다. 상기 바코드 영역은 타겟 스몰 RNA의 종류에 따른 고유한 것으로서, 이러한 바코드 영역의 존재 여부, 검출되는 바코드의 수를 확인하여 타겟 스몰 RNA의 존재 여부 및 수를 대응할 수 있다.

구체적으로, 상기 앰플리콘은 센서 DNA의 바코드 영역이 포함되어 증폭된 것일 수 있다. 센서 DNA에 타겟 스몰 RNA 종류에 다른 고유한 바코드 영역이 존재할 경우, 증폭하여 앰플리콘이 생성되는 과정에서 생성된 각각의 앰플리콘은 모두 센서 DNA에 포함된 고유의 바코드 영역이 포함된 것일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 '검출'은 앰플리콘의 수를 측정함으로써 타겟 스몰 RNA의 수까지 정량적으로 검출 가능한 것일 수 있다.

상세하게는 상기 앰플리콘의 수는 앰플리콘에 포함된 바코드의 수를 측정하여 확인하는 것일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 다수의 타겟 스몰 RNA에 대한 다수의 센서 혼합시에도 높은 정확도와 민감도로 타겟 스몰 RNA를 정량적인 수치로 검출해낼 수 있음을 확인하였으며(도 6), 나아가 혈액에서 추출한 RNA 샘플에서도 확인하고자 하는 타겟 스몰 RNA에 대한 센서 DNA를 도입하여 높은 정확도와 민감도로 타겟 스몰 RNA를 정량적인 수치로 검출해 낼 수 있음을 확인하였다(도 7).

특히, 본 발명의 스몰 RNA 검출 방법 및 검출에 사용되는 센서 DNA의 구성은 검출 한계가 펨토몰(fmol), 아토몰(amol) 수준으로 매우 낮은 바, 종래 스몰 RNA 검출 기술에 비해 민감도 및 정확도가 모두 현저히 우수함을 나타낸다.

본 발명의 다른 측면은 a) 타겟 스몰(small) RNA의 상보적인 서열을 포함하는 스몰 RNA 센싱 영역; b) 상기 스몰 RNA 센싱 영역이 타겟 스몰 RNA를 감지하면, 상기 감지된 타겟 스몰 RNA를 프라이머로 하여 중합될 수 있도록 주형이 되는 모듈 영역; 및 c) 3' 말단의 아민(amine) 영역이 변형된 것인, 스몰 RNA 검출용 센서DNA에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 모듈 영역은 고유한 바코드(barcode) 영역을 포함하는 것일 수 있다. '바코드 영역'은 상기 설명한 바와 같다.

또한 구체적으로, 상기 센서는 나노포어 센서인 것일 수 있다. 상기 '나노포어 센서'는 나노포어(nanopore) 기반의 센서로서, 나노포어 시퀀싱을 적용할 수 있는 것임을 의미한다.

본 발명의 스몰 RNA 검출 방법 및 검출에 사용되는 센서 DNA의 구성은 검출 한계가 펨토몰(fmol), 아토몰(amol) 수준으로 매우 낮은 바, 종래 스몰 RNA 검출 기술에 비해 민감도 및 정확도가 현저히 우수하다.

이에 따라, 본 발명은 미세한 수준에서의 분자 진단이 가능하도록 함으로써인간 등 개체의 질환 발병 유무, 질환의 진행 단계, 잠복기에서의 바이러스 감염 여부 진단 등 기존 기술의 검출 한계를 극복하여 질환의 극 초기, 잠복기에서의 진단에까지도 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 스몰 RNA 검출 방법의 모식도를 나타낸 것이다. 센서 DNA가 타겟 스몰 RNA를 감지하고 결합한 후 스몰 RNA 검출을 위한 서열 분석이 진행된다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 센서 DNA의 구조도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 센서를 이용하여 예시적 검출 대상이 된 miRNA21을 정확히 검출함을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 혈액 샘플에서의 본 발명 센서 DNA를 이용한 스몰 RNA 검출 기술의 민감도 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 1종의 타겟 스몰 RNA에 대한 다수의 센서 혼합시의 정량적 검출능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 다수의 타겟 스몰 RNA에 대한 다수의 센서 혼합시의 정량적 검출능 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 혈액에서 추출한 RNA 샘플에서의 타겟 스몰 RNA의 정량적 검출능 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 센서 DNA를 이용한 중합, 증폭 및 서열 분석

타겟이 되는 스몰(small) RNA와 센서 DNA를 넣어준 후 DNA 중합효소(XenoT-POL)를 이용하여 95 ℃에서 30초, 63 ℃에서 10분간 중합 반응시켰다. 이후 센서 및 RNA를 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용하여 분해하였다. 상기 센서 DNA는 타겟 스몰 RNA와의 상보적인 서열을 포함하는 센싱 영역을 포함하는 것으로서, 상기 센싱 영역은 타겟 스몰 RNA를 감지하여 타겟 스몰 RNA와 혼성화하는 것으로서, 본 발명에서는 '센서 DNA'로 명명하였다. 상기 센서 DNA는 바코드(barcode) 영역을 포함할 수 있고, 바코드 영역만을 카운팅하여 타겟 스몰 RNA의 수를 정량적으로 측정할 수 있다.

이후 상기 센서 DNA의 모듈 영역 및 상기 중합된 가닥의 증폭을 위해 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 앰플리콘(들)을 생성시켰다. 상기 PCR은 통상의 PCR과 같은 방식으로 진행할 수 있으며, PCR의 온도 조건, 사이클 수 등은 상기 중합된 가닥, 이에 결합하는 프라이머 서열에 따라 적절히 변형하여 적용할 수 있다.

이후, 생성된 앰플리콘들을 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 결찰(ligation)시킨 후, 결찰된 앰플리콘들을 서열 분석(sequencing)하였다.

상기 센서 DNA는 나노포어(nanopore) 기반의 센서로서, 상기 서열 분석은 나노포어를 이용한 서열 분석(나노포어 시퀀싱)을 적용할 수 있다. 구체적으로, 결찰된 앰플리콘들에 나노포어 어댑터를 결합시킨 후, 나노포어 시퀀싱을 진행할 수 있으며, 나노포어 시퀀싱은 공지된 제품을 이용하여 이의 매뉴얼에 따라 진행할 수 있다. 예를 들어, 나노포어 시퀀싱 장비인 Minion 칩에 샘플을 로딩 후 시퀀싱을 진행할 수 있다.

이하 실험예를 통하여 본 발명의 검출 방법의 정확도 및 민감도를 확인하였으며, 예시적으로 miRNA21, miRNA210, miRNA486을 타겟으로 하여 실험을 진행하였다. 상기 타겟 miRNA의 서열은 하기 표 1에 정리된 바와 같다.

서열번호	타겟 miRNA 종류	타겟 miRNA 서열
1	has-miR-21-5p	UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
2	has-miR-210-3p	CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA
3	has-miR-486-5p	UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG

상기 예시적 타겟 miRNA를 검출하기 위한 센서 DNA의 센싱 영역 서열은 하기 표 2에 정리된 바와 같다. 본 센싱 영역의 서열은 필요에 따라 변형할 수 있으며, 본 예시에 제한되는 것은 아니다.

서열번호	타겟 miRNA 종류	센서 DNA의 센싱 영역 서열(5'-3')
4	has-miR-21-5p	TCAACATCAGTCTGATAAGCTA
5	has-miR-210-3p	TCAGCCGCTGTCACACGCACAG
6	has-miR-486-5p	CTCGGGGCAGCTCAGTACAGGA

상기 예시적 타겟 miRNA를 검출하기 위한 센서 DNA의 모듈 영역 서열은 하기 표 3에 정리된 바와 같다. 모듈 영역에 포함되는 바코드 영역 서열은 밑줄로 표시하였다. 본 모듈 영역의 서열은 필요에 따라 변형할 수 있으며, 본 예시에 제한되는 것은 아니다.

서열번호	타겟 miRNA 종류	센서 DNA의 모듈 영역 서열(5'-3')
7	has-miR-21-5p	AACAATACCACGACCACCGACAACTACACGCTACAGTCG CATACGAGAT CGTGAT GTGACTGGAGTTGCTTGGCTCTGG TGTATTGGT
8	has-miR-210-3p	AACAATACCACGACCACCGACAACTACACGCTACAGTCGCATACGAGAT ACATCG GTGACTGGAGTTGCTTGGCTCTGG TGTATTGGT
9	has-miR-486-5p	AACAATACCACGACCACCGACAACTACACGCTACAGTCGCATACGAGAT TTAGGC GTGACTGGAGTTGCTTGGCTCTGG TGTATTGGT

상기 예시적 타겟 miRNA를 검출하기 위한 센서 DNA의 바코드 영역 서열은 하기 표 4에 정리된 바와 같다. 본 바코드 영역의 서열은 필요에 따라 변형할 수 있으며, 본 예시에 제한되는 것은 아니다.

서열번호	타겟 miRNA 종류	센서 DNA의 바코드 영역 서열(5'-3')
10	has-miR-21-5p	CGTGAT
11	has-miR-210-3p	ACATCG
12	has-miR-486-5p	TTAGGC

상기와 같이 모듈 영역은 바코드 영역을 포함하며, 센싱 영역과 연결되어 있음에 따라, 센싱 영역 및/또는 바코드 영역에 의해 구분될 수 있다.

또한 예시적으로, 센서 DNA의 모듈 영역 및 중합된 가닥의 증폭을 위해 사용한 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 프라이머 서열은 아래와 같다. 본 프라이머는 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 것을 특징으로 할 뿐, 프라이머의 서열은 필요에 따라 변형할 수 있으며, 본 예시에 제한되는 것은 아니다.

서열번호	프라이머 종류	프라이머 서열(5'-3')
13	Forward primer	[phosphate] AACAATACCACGACCACCGACAAC
14	Reverse primer	[phosphate] ACCAATACACCAGAGCCAAGCAAC

실험예 1. 본 발명 센서 DNA를 이용한 스몰 RNA 검출 기술의 정확도 확인(센서 DNA 혼합시)

miRNA21을 타겟 스몰 RNA로 하여 miRNA21 20 fmol 및 센서 21(miRNA21 센싱 영역을 포함하는 센서 DNA), 센서 210(miRNA210 센싱 영역을 포함하는 센서DNA)을 각 20 fmol로 혼합한 후, 실시예 1의 방식을 이용하여 여러 종류의 센서 DNA가 혼합된 상태에서도 타겟 miRNA가 정확히 검출되는지 확인하였다.

먼저 20 fmol 농도의 센서 21, 센서 210 센서를 실험 조건에 맞게 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 100 mM KCl, 20 mM MgSO₄, 1% Triton X-100, (pH 8.8 at 25°C)), 1 ㎕의 10 mM dNTP 및 2 unit XenoT-POL을 넣어준 후 95 ℃에서 30초 간 가열한 후 63 ℃ 에서 10 분간 인큐베이션(incubation)하였다. 반응 샘플(reaction sample)을 MEGAquick-spin™Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업(clean up)하고, 60 ㎕의 증류수로 용리(elution)하였다. 20 ㎕의 샘플을 뉴클레아제 혼합물(40 mM 소듐아세테이트(sodium acetate, pH 4.5 at 25 °C), 300 mM NaCl, 2 mM ZnSO₄ 및 200 unit S1 뉴클레아제(nuclease))을 섞어주고 37 °C에서 11 분간 인큐베이션 하였다. 이후, 상기 혼합물을 MEGAquick-spin™Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하고, 60 ㎕의 증류수로 용리하였다. 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 프라이머들을 이용하여 98 ℃ 2 분 1사이클, 98 ℃ 10초, 64.5 ℃ 10초 30 사이클의 조건으로 PCR을 진행하였다. PCR 산물을 15% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel(19:1))에 전기영동 후 젤닥(Gel Doc)을 이용하여 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 타겟 스몰 RNA에 대응되지 않는 센서 DNA가 혼합되어 있더라도, 타겟 스몰 RNA인 miRNA21을 이에 대한 센서 21이 정확히 감지하여 검출해 낼 수 있음을 확인하였으며 센서 210과의 비특이적 반응은 나타나지 않음을 확인하였다.

이러한 결과는 본 발명의 센서 DNA를 이용한 스몰 RNA 검출 기술이 여러 종류의 센서가 혼합되어 있더라도 정확도를 유지할 수 있음을 나타내는 것이다.

실험예 2. 혈액 샘플에서의 본 발명 센서 DNA를 이용한 스몰 RNA 검출 기술의 민감도 확인

인간 혈액 샘플로부터 miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen)을 사용하여 RNA를 정제 및 추출하였다. 상기 실시예 1의 방식을 이용하여 타겟 miRNA가 정확히 검출되는지 확인하였다.

구체적으로, 혈액에서 정제한 RNA 800 ng과 센서 21, 센서 210 및 센서 486(miRNA486 센싱 영역을 포함하는 센서 DNA)을 각 200 amol로 혼합한 후, 2 ㎕의 반응용 완충용액(200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 100 mM KCl, 20 mM MgSO₄, 1% Triton X-100, (pH 8.8 at 25°C), 1 ㎕의 10 mM dNTP 및 2 unit XenoT-POL을 넣어준 후 95 ℃에서 30초 간 가열한 후 63 ℃에서 10분간 인큐베이션 하였다. 반응 샘플을 MEGAquick-spin™Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하고, 60 ㎕의 증류수로 용리하였다. 20 ㎕의 샘플을 뉴클레아제 혼합물(40 mM 소듐아세테이트(sodium acetate, pH 4.5 at 25 °C), 300 mM NaCl, 2 mM ZnSO₄, 및 200 unit S1 뉴클레아제)을 넣어주고 37 ℃에서 11 분간 인큐베이션 하였다. 이후, 상기 혼합물을 MEGAquick-spin™Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하고, 60 ㎕의 증류수로 용리하였다. 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 프라이머들을 이용하여 98 ℃ 2분 1사이클, 98 ℃ 10초, 64.5 ℃ 10초 30사이클의 조건으로 PCR 진행하였다. PCR 산물을 15% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel(19:1))에 전기영동 후 젤닥(Gel Doc)을 이용하여 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 센서의 농도가 200 amol로 현저히 낮음에도 불구하고 스몰 RNA가 존재하는 경우 이를 감지함을 확인하였는 바, 검출 한계가 매우 낮으며 높은 민감도를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

실험예 3. 본 발명 센서 DNA를 이용한 스몰 RNA 검출 기술의 정량적 검출 능 확인

3-1. 1종의 타겟 스몰 RNA에 대한 다수의 센서 혼합시의 정량적 검출능 확인

miRNA21을 타겟 스몰 RNA로 하여 miRNA21 20 fmol 및 센서 21, 센서 210를 각각 20 fmol로 혼합한 후, 상기 실시예 1의 방식을 이용하여 여러 종류의 센서 DNA가 혼합된 상태에서도 타겟 miRNA의 검출이 정량적으로 확인될 수 있는지 검증하였다. 20 fmol의 센서 21, 센서 210을, miRNA21를 실험조건에 맞게 혼합 후 2 ㎕ 의 반응용 완충용액(200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 100 mM KCl, 20 mM MgSO₄, 1% Triton X-100, (pH 8.8 at 25°C), 1 ㎕의 10 mM dNTP, 2 unit XenoT-POL을 넣어준 후 95℃에서 30초간 가열한 후 63 ℃ 에서 10분간 인큐베이션하였다. 반응 샘플을 MEGAquick-spin™Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하고, 60 ㎕의 증류수로 용리하였다. 20 ㎕의 샘플을 뉴클레아제 혼합물(40 mM 소듐아세테이트(sodium acetate, pH 4.5 at 25 °C), 300 mM NaCl, 2 mM ZnSO₄, 및 200 unit S1 뉴클레아제)을 넣어주고 37 ℃에서 11 분간 인큐베이션 하였다. 이후, 상기 혼합물을 MEGAquick-spin™Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하고, 60 ㎕의 증류수로 용리하였다. 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 프라이머들을 이용하여 98 ℃ 2분 1사이클, 98 ℃ 10초, 64.5 ℃ 10초 30사이클의 조건으로 PCR 진행하하고, 앰플리콘(amplicon)을 클린업하였다. 이후 500 ng의 앰플리콘을 66 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 7.5% 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG 6000) (pH 7.6 at 25°C)의 조건에서 500 unit의 T3 DNA 리가아제(ligase)를 넣어준 후 25 °C에서 10분 간 인큐베이션 하였다. 이후 클린업 과정을 거친 후 용리된 DNA 40 ㎕, 1 mM dATP 1㎕, taq DNA polymerase 1 ul(5 unit), 5 ㎕ 반응용 완충용액(200 mM Tris-HCl/pH 8.8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 100 mM　β 및 증류수를 혼합하여 50 ㎕에 혼합물을 만든 후 72℃에서 20 분 동안 인큐베이션 하였다. dATP 테일링(tailing)된 DNA 산물을 MEGAquick-spin™Plus Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하였다. 이후 나노포어 시퀀싱을 위한 어댑터 결합(adaptor ligation, SQK-LSK109), AMPure XP 비드를 이용한 클린업, 유세포 프라이밍(priming the flow cell) 및 유세포 로딩(loading the flow cell) 과정은 나노포어 시퀀싱 프로토콜에 따라 수행하였다. 이후 수득된 나노포어 시퀀싱 파일에서 센서 21, 센서 210의 바코드 영역 서열을 카운트하여 검출 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 센서 DNA의 바코드 영역을 카운팅(counting) 한 결과 666,860개의 miRNA21이 측정되었고, 2,293개의 miRNA210이 백그라운드로 나타남을 확인하였다.

상기와 같은 결과는 본 발명의 기술이 펨토몰(fmol)의 현저히 낮은 농도에서도 높은 민감도와 정확도로 타겟 스몰 RNA의 수를 측정하여 정량적 검출이 가능함을 나타내는 것이다.

3-2. 다수의 타겟 스몰 RNA에 대한 다수의 센서 혼합시의 정량적 검출능 확인

miRNA21, miRNA210을 타겟 스몰 RNA로 하여 miRNA21 7 fmol, miRNA210 20 fmol의 서로 다른 농도로 혼합하고, 센서 21, 센서 210를 각각 20 fmol로 혼합하였다. 이후, 상기 실시예 1의 방식을 이용하여 다수의 타겟 스몰 RNA와 함께 여러 종류의 센서 DNA가 혼합된 상태에서도 타겟 miRNA의 검출이 정량적으로 확인될 수 있는지 검증하였다.

20 fmol의 센서 21, 센서 210을 7 fmol의 miRNA21, 20 fmol의 miRNA210과 혼합하였으며, 이하 나노포어 시퀀싱까지의 과정은 상기 3-1에 기재된 바와 같다. 이후 수득된 나노포어 시퀀싱 파일에서 센서 21, 센서 210의 바코드 영역 서열을 카운트하여 검출 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 7 fmol로 상대적으로 적은 농도로 혼합되었던 miRNA21의 경우 76,891개가 측정되었으며, 20 fmol의 농도로 혼합된 miRNA210의 경우 179,261개가 측정되었다.

상기와 같은 결과는 서로 다른 농도의 스몰 RNA가 존재하더라도 본 발명의 기술은 단순히 존재 유무만을 검출하는 것이 아닌, 정량적으로 샘플 내에 포함된 농도 내지 함량을 반영하여 검출이 가능함을 나타내는 것이다.

3-3. 혈액에서 추출한 RNA 샘플에서의 타겟 스몰 RNA의 정량적 검출능 확인

인간 혈액 샘플로부터 miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen)을 사용하여 RNA를 정제 및 추출하였다.

혈액에서 정제한 RNA 800 ng과 센서 21, 센서 210 및 센서 486을 각 200 amol로 혼합하고 이후, 상기 실시예 1의 방식을 이용하여 타겟 miRNA의 검출이 정량적으로 확인될 수 있는지 검증하였다. 이하 나노포어 시퀀싱까지의 과정은 상기 3-1에 기재된 바와 같다. 이후 수득된 나노포어 시퀀싱 파일에서 센서 21, 센서 210 및 센서 486의 바코드 영역 서열을 카운트하여 검출 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 혈액 내에 존재하는 miRNA의 종류별 농도에 따라 miRNA21의 경우 5,279개, miR210은 682개, miRNA486은 342,538개가 측정되었다.

상기와 같은 결과는, 본 발명의 기술은 바이러스, 세균 등에 의한 감염증, 암 등의 지표가 되는 스몰 RNA의 존재를 단순 검출이 아닌 정량적인 수준에서의 측정까지 함에 따라 정상, 질병이 시작되고 있는 단계, 잠복기, 발병기 등을 분자 수준에서 빠르게 진단할 수 있음을 나타내는 것이다.

상기와 같이 본 발명은 미세한 수준에서의 분자 진단이 가능하도록 함으로써인간 등 개체의 질환 발병 유무, 질환의 진행 단계, 잠복기에서의 바이러스 감염 여부 진단 등 기존 기술의 검출 한계를 극복하여 질환의 극 초기, 잠복기에서의 진단에까지도 적용될 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Xenohelix. Co., Ltd. <120> A METHOD OF DETECTING small RNA <130> 20PP30301 <150> KR 1020190179664 <151> 2019-12-31 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> has-miR-21-5p <400> 1 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> has-miR-210-3p <400> 2 cugugcgugu gacagcggcu ga 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> has-miR-486-5p <400> 3 uccuguacug agcugccccg ag 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sensing region of sensor DNA detecting for has-miR-486-5p <400> 4 tcaacatcag tctgataagc ta 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sensing region of sensor DNA detecting for has-miR-210-3p <400> 5 tcagccgctg tcacacgcac ag 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sensing region of sensor DNA detecting for has-miR-486-5p <400> 6 ctcggggcag ctcagtacag ga 22 <210> 7 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> module region of sensor DNA detecting for has-miR-21-5p <400> 7 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc atacgagatc gtgatgtgac 60 tggagttgct tggctctggt gtattggt 88 <210> 8 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> module region of sensor DNA detecting for has-miR-210-3p <400> 8 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc atacgagata catcggtgac 60 tggagttgct tggctctggt gtattggt 88 <210> 9 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> module region of sensor DNA detecting for has-miR-486-5p <400> 9 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc atacgagatt taggcgtgac 60 tggagttgct tggctctggt gtattggt 88 <210> 10 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> barcode region of sensor DNA detecting for has-miR-21-5p <400> 10 cgtgat 6 <210> 11 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> barcode region of sensor DNA detecting for has-miR-210-3p <400> 11 acatcg 6 <210> 12 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> barcode region of sensor DNA detecting for has-miR-486-5p <400> 12 ttaggc 6 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 13 aacaatacca cgaccaccga caac 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 14 accaatacac cagagccaag caac 24

Claims

a) 검출 대상이 되는 타겟 스몰(small) RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서DNA를 타겟 스몰 RNA와 혼성화하는 단계;
b) 상기 센서 DNA의 모듈 영역을 주형으로 하고, 상기 타겟 스몰 RNA를 프라이머로 하여 중합효소로 중합하는 단계;
c) 상기 센서 DNA의 모듈 영역 및 b) 단계에서 중합된 가닥에 대응하는 프라이머를 이용하여 증폭하여 앰플리콘을 생성하는 단계; 로서,
상기 c) 단계의 프라이머는 5' 말단에 인산(phosphate)이 결합된 것이고,
d) 상기 앰플리콘의 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 스몰 RNA 검출 방법.
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제1항에 있어서,
상기 c) 단계에서 앰플리콘이 복수 개 생성된 경우,
d) 생성된 앰플리콘들을 결찰(ligation)시키는 단계를 더욱 포함하는, 스몰 RNA 검출 방법.
제4항에 있어서,
상기 d) 단계는 앰플리콘들을 결찰시킨 후, 상기 결찰된 앰플리콘의 양 말단에 서열 분석을 위한 어댑터(adaptor)를 결합시키는 것을 추가로 포함하는 것인, 스몰 RNA 검출 방법.
제4항에 있어서,
상기 d) 단계 이후 e) 결찰된 앰플리콘의 서열을 분석하는 단계를 더욱 포함하는, 스몰 RNA 검출 방법.
제6항에 있어서,
상기 e) 단계에서 서열 분석은 나노포어 서열 분석인 것인, 스몰 RNA 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 센서 DNA는 고유한 바코드(barcode) 영역을 포함하는 것인, 스몰 RNA 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 앰플리콘은 센서 DNA의 바코드 영역이 포함되어 증폭된 것인, 스몰 RNA 검출 방법.
제9항에 있어서,
상기 검출은 앰플리콘의 수를 측정함으로써 타겟 스몰 RNA의 수까지 정량적으로 검출 가능한 것인, 스몰 RNA 검출 방법.
제10항에 있어서,
상기 앰플리콘의 수는 앰플리콘에 포함된 바코드의 수를 측정하여 확인하는 것인, 스몰 RNA 검출 방법.
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