KR20240003759A - 블로커 핵산 처리를 포함하는 표적 rna 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 블로커 핵산 처리를 포함하는 표적 RNA 검출 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 블로커 핵산 처리를 통해 비특이적 반응을 억제하고, 짧은 염기서열의 RNA까지 분석이 가능하여 높은 민감도 및 정확도로 검출이 가능하여 감염증, 암 등 여러 질환의 진단 용도로도 널리 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 블로커 핵산 처리를 포함하는 표적 RNA 검출 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 블로커 핵산 처리를 통해 비특이적 반응을 억제하고, 짧은 염기서열의 RNA까지 분석이 가능하여 높은 민감도 및 정확도로 검출이 가능하여 감염증, 암 등 여러 질환의 진단 용도로도 널리 활용될 수 있다.
삶의 질이 향상되면서 질병의 조기 진단에 대한 관심이 커지고 있으며, 분자진단 기술은 질병을 유발하는 병원체의 유전정보(DNA/RNA)를 직접적으로 검출하기 때문에, 기존의 항원/항체 반응을 기반으로 하여 질병의 간접 인자 (indirect factor)를 검출하는 면역진단 기술의 단점을 해결할 수 있는 기술로서 많은 관심을 받고 있다.
또한, 최근 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)이 크게 유행하면서 전 세계적으로 많은 사망자가 발생하고 WHO에서는 팬데믹 선언까지 하였다. 이러한 RNA 바이러스에 의한 질병의 경우, 높은 돌연변이 발생률에 의해 더욱 큰 피해가 발생되며 감염 여부에 대한 조기 진단이 더욱 요구되고 있다.
한편, miRNA 등 스몰(small) RNA는 생체 내 존재하는 단백질-비 암호화 RNA로, 특정 유전자의 전사 후 과정에 작용하여 해당 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 특히, 세포주기, 분화, 발달, 대사, 발암, 노화와 같은 생물학적 기능을 조절하여 생체의 항상성 유지를 매개하는 중요한 유전적 요소로 인지되며, 특히 이의 비정상적인 네트워크 형성은 세포 생리학적인 측면에서 치명적인 결함을 나타낼 수 있다.
또한, miRNA 등 스몰 RNA의 혈중 내 발현 양상은 암의 초기 단계에서 민감하게 반응하므로 암의 조기, 예측 발견에 있어서 강한 이점을 나타낸다. 또한 단순한 채혈만으로 다양한 암을 검사할 수 있기에 환자로부터 몸에 가해지는 부담이 감소될 수 있다. 나아가, 상기 감염, 암 외에도 알츠하이머, 파킨슨 병 등 여러 난치성 질환의 진단에 있어서 스몰 RNA를 높은 민감도로 신속하게 검출함으로써 조기 진단이 이루어질 수 있도록 하는 기술 개발에 대한 요구가 증가되고 있다.
본 발명의 목적은 블로커(blocker) 핵산을 처리하는 단계를 포함하는, RNA 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 표적 RNA 인식 부위 및 모듈 영역을 포함하는 센서 DNA; 및 상기 센서 DNA의 모듈 영역에 대해 상보적인 서열을 포함하는 블로커 핵산을 포함하는 RNA 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은, a) 검출 대상이 되는 표적 RNA에 상보적인 서열을 포함하는 센서DNA를 표적 RNA와 혼성화하는 단계; b) 상기 센서 DNA의 모듈 영역을 주형으로 하고, 상기 표적 RNA를 프라이머로 하여 중합효소로 중합하는 단계; 및 c) 상기 센서 DNA에 상보적으로 결합하는 블로커(blocker) 핵산을 처리하여 표적 RNA와 혼성화되지 않은 센서 DNA의 증폭을 억제하는 단계를 포함하는, RNA 검출 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 b) 단계의 중합 단계를 통해 형성된 중합된 가닥을 c) 단계와 동시 또는 c) 단계 이후에PCR 반응을 통해 증폭하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 본 발명 일 실시예에서는 qPCR을 수행시 블로커 핵산을 동시에 처리하더라도 미결합된 센서 DNA에 대한 제거가 나타남을 확인하였다. 이렇게 블로커 핵산은 PCR 반응시 동시에 처리될 수도 있으며, 블로커 핵산을 먼저 처리한 후 PCR 반응을 수행할 수도 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. PCR 반응시 동시에 처리되더라도 미결합된 센서 DNA의 제거가 잘 이루어지므로, 블로커 핵산을 PCR 반응 이전에 처리하더라도 장시간 반응시키지 않더라도 비특이적 반응을 충분히 억제할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 표적 RNA는 스몰(small) RNA 일 수 있다. 상기 스몰 RNA는 miRNA, siRNA 외에도 약 50개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 RNA를 통칭하는 것일 수 있다.
본 발명에서, "블로커 핵산(blocker nucleic acid)"은 표적 RNA에 대한 인식 부위를 포함하는 센서 DNA에 상보적으로 결합할 수 있으며, 표적 RNA와 센서 DNA의 혼성화 후에도 표적 RNA와 반응하지 못한 센서 DNA에 결합하여 PCR 증폭 반응시 미반응 센서 DNA의 증폭을 억제하는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 미반응 센서 DNA의 증폭 억제를 통해 표적 RNA외의 비특이적 신호를 제거함으로써 위양성을 제거하고 높은 정확도를 나타낼 수 있도록 할 수 있다.
구체적으로, 상기 블로커 핵산은 센서 DNA 내 모듈 영역에 대해 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 필요에 따라 센서 DNA의 영역 내에서 블로커 핵산이 결합하는 영역을 변경하여 이에 대한 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 블로커 핵산은 센서 DNA 내 모듈 영역에 상보적으로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 필요에 따라 블로커 핵산의 결합이 필요한 센서 DNA 영역에 상보적으로 결합할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 블로커 핵산은 잠금 핵산(Locked nucleic acid, LNA)을 포함하는 것일 수 있다.
상기 잠금 핵산은 블로커 핵산 내 5 내지 50 %의 비율로 포함될 수 있으며, 더욱 구체적으로 상기 잠금 핵산은 블로커 핵산 내 15 내지 50 %의 비율로 포함될 수 있으며, 가장 구체적으로 상기 잠금 핵산은 블로커 핵산 내 30 내지 50 %의 비율로 포함될 수 있다.
또한, 상기 잠금 핵산으로 치환되는 블로커 핵산 내 뉴클레오티드의 위치는 제한되지 않는다.
또한, 상기 센서 DNA는 단일 가닥(single strand, ss) DNA 형태인 것일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 표적 RNA에 대한 상보적인 서열을 포함하는ssDNA 형태인 센서 DNA를 샘플에 혼합하여 표적 RNA 검출 반응을 진행하였으며, 상기 검출 반응에 있어서 블로커 핵산을 처리한 경우 표적 RNA와 혼성화되지 않은 미반응 센서 DNA가 효과적으로 제거됨으로써 비특이적 PCR 반응이 억제됨을 확인하였다(도 2 내지 도5).
본 발명의 다른 측면은 표적 RNA 인식 부위 및 모듈 영역을 포함하는 센서 DNA; 및 상기 센서 DNA의 모듈 영역에 대해 상보적인 서열을 포함하는 블로커 핵산을 포함하는 RNA 검출용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 센서 DNA의 표적 RNA 인식 부위는 검출 대상이 되는 표적 RNA에 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 블로커 핵산은 잠금 핵산(Locked nucleic acid, LNA)을 포함하는 것일 수 있다. 블로커 핵산은 상기 설명된 바와 같다.
상기 RNA 검출용 조성물은 센서 DNA; 및 블로커 핵산 외에도 완충액, PCR 프라이머 등을 더욱 포함할 수 있으며, 추가로 포함되는 구성요소는 필요에 따라 변경하여 적용될 수 있다.
본 발명의 RNA 검출 방법 및 검출에 사용되는 센서 DNA의 구성은 검출 한계가 펨토몰(fmol), 아토몰(amol) 수준으로 매우 낮은 바, 종래 RNA 검출 기술에 비해 민감도 및 정확도가 현저히 우수하다. 특히, 블로커 핵산을 처리함으로써 비특이적 반응을 억제하여 검출의 정확도를 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 블로커 핵산 처리 단계를 포함하는 스몰 RNA 검출 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 블로커 핵산 처리시 미결합된 센서 DNA의 제거 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 블로커 핵산 내 LNA 함량에 따른 미결합된 센서 DNA의 제거 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 블로커 핵산 내 LNA 위치에 따른 미결합된 센서 DNA의 제거 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 센서 DNA 종류에 따른 블로커 핵산의 미결합된 센서 DNA의 제거 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 블로커 핵산 처리시 미결합된 센서 DNA의 제거 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 블로커 핵산 내 LNA 함량에 따른 미결합된 센서 DNA의 제거 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 블로커 핵산 내 LNA 위치에 따른 미결합된 센서 DNA의 제거 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 센서 DNA 종류에 따른 블로커 핵산의 미결합된 센서 DNA의 제거 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 블로커 핵산의 설계
표적 RNA에 대한 인식 부위를 포함하는 센서 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 블로커 핵산을 설계하였다. 상기 센서 DNA는 표적 RNA와의 상보적인 서열을 포함하는 인식 부위를 포함하며, 상기 인식 부위는 표적 RNA를 감지하여 표적 RNA와 혼성화하는 것으로서, '센서 DNA'로 명명하였다.
표적 RNA와 혼성화되지 않은 센서 DNA는 ssDNA로 남아 검출에 있어 비특이적 반응을 일으킬 수 있는 바, 검출을 위한 PCR 반응 전에 이를 제거하는 단계가 필요하다. 본 발명에서는 센서 DNA에 대한 상보적인 서열로 구성된 블로커 핵산을 설계하고, 이를 처리할 경우 표적 RNA와 혼성화되지 않은 센서 DNA에 의한 비특이적 반응을 억제시킬 수 있음을 확인하였다. 상기 블로커 핵산에는 잠금 핵산(Locked nucleic acid, LNA)이 포함되도록 설계하였다.
본 발명에서 예시적으로 설계한 블로커 핵산의 서열은 하기 표 1에 나타난 바와 같다. 이러한 블로커 핵산 서열은 필요에 따라 변경하여 적용될 수 있다.
실험예 1. 블로커 핵산 처리에 따른 미결합 센서 DNA 제거 효과 확인
인간 혈액 샘플로부터 XENOPURE Blood Small RNA Purification Kit (XENOHELIX)을 사용하여 RNA를 정제하였다. 100 ng의 전혈 RNA 및 2 fmol의 hsa-miR-92a-3p 센서 DNA를 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100(pH 8.8 at 25°C)), 1 ㎕의 2.5 mM dNTP 및 2 unit의 DNA 폴리머라제(XenoT-POL)를 혼합하였다. 혼합액을 95 ℃에서 3 분간 가열한 후 63 ℃에서 5 분간 인큐베이션(incubation)하여 hsa-miR-92a-3p 센서 DNA에 상보적인 DNA를 합성하였다. 음성 대조군(negative control, NTC)으로 RNA 대신 증류수를 넣고 동일한 반응을 진행하였다.
이후 60 °C에서 10분간 뉴클레아제(nuclease)를 처리하여 비특이적인 결합을 끊고 ssDNA인 센서를 제거한 후 컬럼(column)에 통과시켜 남아있는 센서와 RNA를 추가적으로 제거하였다.
3 ul 샘플을 hsa-miR-92a-3p 센서 특이적 프라이머를 이용하여 95 ℃ 10 분 1 사이클, 95 ℃ 15초, 60 ℃ 1 분, 40 사이클 조건으로 qPCR을 수행할 때, 블로커 핵산을 각각 0, 0.75, 1.0 uM의 농도로 처리하여 qPCR을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 블로커 핵산을 처리한 경우 표적 RNA와 미결합된 센서 DNA가 모두 제거되어 PCR 결과가 나타나지 않음을 확인하였다(-RNA: 표적 RNA와 미결합된 센서 DNA(ssDNA), +RNA: 표적 RNA와 결합된 센서 DNA(double strand 형성)).
상기와 같은 결과로부터 블로커 핵산을 처리하는 단계를 포함하는 본 발명의 RNA 검출 기술은 검출 수단으로 이용되는 ssDNA 형태의 센서 DNA가 표적 RNA와 혼성화되지 못한 경우 제거됨으로써 비특이적 검출 반응이 나타나지 않음을 확인하였다.
실험예 2. 블로커 핵산 내 LNA 함량에 따른 미결합 센서 DNA 제거 효과 확인
블로커 핵산 내 LNA 함량에 따른 ssDNA 센서 제거 효과를 확인하였다. 상기 표 1의 블로커 핵산 서열에 대하여, 아래와 같이 LNA의 함량을 달리하여 블로커 핵산을 제작하였으며, LNA로 치환된 부분은 밑줄 및 굵은 글씨로 표시하였다.
상기 실시예 1에서와 동일한 방식으로 인간 혈액 샘플로부터 RNA를 수득하고, 100 ng의 전혈 RNA 및 2 fmol의 hsa-miR-92a-3p 센서 DNA를 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100(pH 8.8 at 25°C)), 1 ㎕의 2.5 mM dNTP 및 2 unit의 DNA 폴리머라제(XenoT-POL)를 혼합하였다. 혼합액을 95 ℃에서 3 분간 가열한 후 63 ℃에서 5 분간 인큐베이션(incubation)하여 hsa-miR-92a-3p 센서 DNA에 상보적인 DNA를 합성하였다. 음성 대조군(negative control, NTC)으로 RNA 대신 증류수를 넣고 동일한 반응을 진행하였다.
이후 60 ℃에서 10 분간 뉴클레아제(nuclease)를 처리하여 비특이적인 결합을 끊고 ssDNA인 센서를 제거한 후 컬럼(column)에 통과시켜 남아있는 센서와 RNA를 추가적으로 제거하였다.
3 ul 샘플을 hsa-miR-92a-3p 센서 특이적 프라이머를 이용하여 95 ℃ 10 분 1사이클, 95 ℃ 15초, 60 ℃ 1 분, 40 사이클 조건으로 qPCR을 수행할 때, 실시예 1, 실시예 2의 블로커 핵산을 각각 0.75 uM의 농도로 처리하였다.
블로커 핵산을 넣지 않은 음성대조군과 상기 실시예 1, 실시예 2의 블로커 핵산을 각각 넣은 처리군의 Cq 값을 비교하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 실시예 1 및 실시예 2의 블로커 핵산을 처리한 경우 표적 RNA와 미결합된 센서 DNA가 모두 제거되어 PCR 결과가 나타나지 않음을 확인하였다(-RNA: 표적 RNA와 미결합된 센서 DNA(ssDNA), +RNA: 표적 RNA와 결합된 센서 DNA(double strand 형성)). 이러한 결과로부터 블로커 핵산 내 LNA의 함량이 변동되더라도 ssDNA 센서 특이적인 제거가 안정적으로 이루어질 수 있음을 확인하였다.
실험예 3. 블로커 핵산 내 LNA 위치에 따른 미결합 센서 DNA 제거 효과 확인
블로커 핵산 내 LNA 함량에 따른 ssDNA 센서 제거 효과를 확인하였다. 상기 표 1의 블로커 핵산 서열에 대하여, 아래와 같이 9개 뉴클레오티드를 LNA로 치환하고 치환된 LNA의 위치를 달리하여 블로커 핵산을 제작하였으며, LNA로 치환된 부분은 밑줄 및 굵은 글씨로 표시하였다.
상기 실험예 1에서와 동일한 방식으로 인간 혈액 샘플로부터 RNA를 수득하고, 100 ng의 전혈 RNA 및 2 fmol의 hsa-miR-92a-3p 센서 DNA를 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100(pH 8.8 at 25°C)), 1 ㎕의 2.5 mM dNTP 및 2 unit의 DNA 폴리머라제(XenoT-POL)를 혼합하였다. 혼합액을 95 ℃에서 3 분간 가열한 후 63 ℃에서 5 분간 인큐베이션(incubation)하여 hsa-miR-92a-3p 센서 DNA에 상보적인 DNA를 합성하였다. 음성 대조군(negative control, NTC)으로 RNA 대신 증류수를 넣고 동일한 반응을 진행하였다.
이후 60 °C에서 10분간 뉴클레아제(nuclease)를 처리하여 비특이적인 결합을 끊고 ssDNA인 센서를 제거한 후 컬럼(column)에 통과시켜 남아있는 센서와 RNA를 추가적으로 제거하였다.
3 ul 샘플을 hsa-miR-92a-3p 센서 특이적 프라이머를 이용하여 95 ℃ 10 분 1사이클, 95 ℃ 15초, 60 ℃ 1분, 40 사이클 조건으로 qPCR을 수행할 때, 실시예 2 내지 실시예 5의 블로커 핵산을 각각 0.75 uM의 농도로 처리하였다.
블로커 핵산을 넣지 않은 음성대조군과 상기 실시예 2 내지 실시예 5의 블로커 핵산을 각각 넣은 처리군의 Cq 값을 비교하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 실시예 2 내지 실시예 5의 블로커 핵산을 처리한 경우 모두에서 표적 RNA와 미결합된 센서 DNA가 모두 제거되어 PCR 결과가 나타나지 않음을 확인하였다(-RNA: 표적 RNA와 미결합된 센서 DNA(ssDNA), +RNA: 표적 RNA와 결합된 센서 DNA(double strand 형성)). 이러한 결과로부터 블로커 핵산 내 LNA의 위치가 변동되더라도 ssDNA 센서 특이적인 제거가 안정적으로 이루어질 수 있음을 확인하였다.
실험예 4. 센서 DNA 종류에 따른 블로커 핵산의 미결합 센서 DNA 제거 효과 확인
서로 다른 종류의 센서 DNA를 대상으로 블로커 핵산의 ssDNA 센서 제거 효과를 확인하였다.
상기 실험예 1에서와 동일한 방식으로 인간 혈액 샘플로부터 RNA를 수득하고, 100 ng의 전혈 RNA 및 2 fmol의 hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-let-7d-5p 센서 DNA를 각각 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100(pH 8.8 at 25°C)), 1 ㎕의 2.5 mM dNTP 및 2 unit의 DNA 폴리머라제(XenoT-POL)를 혼합하였다. 혼합액을 95 ℃에서 3 분간 가열한 후 63 ℃에서 5 분간 인큐베이션(incubation)하여 hsa-miR-92a-3p 센서 DNA에 상보적인 DNA를 합성하였다. 음성 대조군(negative control, NTC)으로 RNA 대신 증류수를 넣고 동일한 반응을 진행하였다.
이후 60 °C에서 10분간 뉴클레아제(nuclease)를 처리하여 비특이적인 결합을 끊고 ssDNA인 센서를 제거한 후 컬럼(column)에 통과시켜 남아있는 센서와 RNA를 추가적으로 제거하였다.
3 ul 샘플을 hsa-miR-92a-3p 센서 특이적 프라이머를 이용하여 95 ℃ 10 분 1사이클, 95 ℃ 15초, 60 ℃ 1분 40 사이클 조건으로 qPCR을 수행할 때, 실시예 2의 블로커 핵산을 각각 0.75 uM의 농도로 처리하였다.
블로커 핵산을 넣지 않은 음성대조군과 상기 각 센서의 종류를 달리하여 블로커 핵산을 처리한 군에서의 Cq 값을 비교하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 센서의 종류와 관계없이 hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-144-3p 및 hsa-let-7d-5p 센서 DNA 군 모두에서 표적 RNA와 미결합된 센서 DNA가 모두 제거되어 PCR 결과가 나타나지 않음을 확인하였다(-RNA: 표적 RNA와 미결합된 센서 DNA(ssDNA), +RNA: 표적 RNA와 결합된 센서 DNA(double strand 형성)). 이러한 결과로부터 센서 DNA의 종류와 관계없이 블로커 핵산 처리에 의해 ssDNA 센서 특이적인 제거가 안정적으로 이루어질 수 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명의 블로커 핵산 처리 단계를 포함하는 RNA 검출 방법은 비특이적 반응을 제거함으로써 검출 민감도를 현저히 향상시킬 수 있으며, 블로커 핵산 내 포함되는 LNA의 함량이나 위치가 달라지더라도 센서 DNA종류에 관계없이 비특이적 반응을 제어할 수 있다.
상기 실험예 1 내지 4에서 사용된 각 miRNA 검출을 위한 센서 DNA 서열은 하기 표 4에 정리된 바와 같다. 센서 DNA 내에서 블로커 핵산이 결합되는 부분은 밑줄로 표시하였다.
또한, qPCR 수행시 이용된 프라이머 서열은 하기 표 5에 정리된 바와 같다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (12)
- a) 검출 대상이 되는 표적 RNA에 상보적인 서열을 포함하는 센서DNA를 표적 RNA와 혼성화하는 단계;
b) 상기 센서 DNA의 모듈 영역을 주형으로 하고, 상기 표적 RNA를 프라이머로 하여 중합효소로 중합하는 단계; 및
c) 상기 센서 DNA에 상보적으로 결합하는 블로커(blocker) 핵산을 처리하여 표적 RNA와 혼성화되지 않은 센서 DNA의 증폭을 억제하는 단계를 포함하는, RNA 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 b) 단계의 중합 단계를 통해 형성된 중합된 가닥을 c) 단계와 동시 또는 c) 단계 이후에 PCR 반응을 통해 증폭하는 단계를 더욱 포함하는, RNA 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표적 RNA는 스몰(small) RNA인 것인, RNA 검출 방법. - 제3항에 있어서, 상기 스몰 RNA는 miRNA인 것인, RNA 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 블로커 핵산은 센서 DNA 내 모듈 영역에 대해 상보적인 서열을 포함하는 것인, RNA 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 블로커 핵산은 센서 DNA 내 모듈 영역에 상보적으로 결합하는 것인, RNA 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 블로커 핵산은 잠금 핵산(Locked nucleic acid, LNA)을 포함하는 것인, RNA 검출 방법. - 제5항에 있어서,
상기 잠금 핵산은 블로커 핵산 내 5 내지 50 %의 비율로 포함되는 것인, RNA 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 센서 DNA는 단일 가닥(single strand, ss) DNA 형태인 것인, RNA 검출 방법. - 표적 RNA 인식 부위 및 모듈 영역을 포함하는 센서 DNA; 및
상기 센서 DNA의 모듈 영역에 대해 상보적인 서열을 포함하는 블로커 핵산을 포함하는 RNA 검출용 조성물. - 제10항에 있어서,
상기 센서 DNA의 표적 RNA 인식 부위는 검출 대상이 되는 표적 RNA에 상보적인 서열을 포함하는 것인, RNA 검출용 조성물. - 제10항에 있어서,
상기 블로커 핵산은 잠금 핵산(Locked nucleic acid, LNA)을 포함하는 것인, RNA 검출용 조성물.
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