CN116179767A - 一种基于核酸恒温扩增的日本脑炎病毒检测试剂盒 - Google Patents

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隋国栋
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Abstract

本发明用于生物检测技术领域，具体为一种基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒。本发明检测试剂盒包括引物组、扩增反应试剂、阳性质控以及阴性对照；引物组根据NCBI中日本脑炎病毒基因组包膜蛋白E基因片段SEQ ID NO.5设计，为SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4所示；阳性对照为日本脑炎病毒假病毒，阴性对照为无核酸酶水。本发明利用链置换Bst DNA聚合酶和Mulv逆转录酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，利用UDG酶去除气溶胶污染，实现核酸指数扩增，保证扩增的高度灵敏度和快速性。本发明检测试剂盒对日本脑炎病毒的检测灵敏度高、操作简便，成本低，假阳性率低，并大大提高日本脑炎病毒的检测速度。

Description

一种基于核酸恒温扩增的日本脑炎病毒检测试剂盒
技术领域
本发明用于生物检测技术领域，具体涉及基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒。
背景技术
日本脑炎病毒最早在日本发现，是一种人畜共患疾病，经由蚊子传播，主要分布在亚洲。其致死率高且后遗症严重，其诊断方法的研究十分具有意义。日本脑炎病毒的检测方法主要以基于血清的和分子诊断的方法为主。血清学检测方法主要包括传统血清学的补体结合试验、新型SPA协同凝集试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、胶体金技术以及乳胶凝集试验等。分子诊断方法主要包括实时PCR方法、基因芯片技术以及核酸探针检测等技术。基于免疫的检测方法主要检测的是既往感染，无法实现即时检测和精准检测，容易漏诊。基于核酸的RT-PCR方法可以通过特异性扩增RNA实现精准确诊，几乎没有窗口期，准确率高，但是其检测时间长，需要进行热循环。
环介导等温扩增是日本科学家在2000年左右发明的技术(Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12):E63.)，通过识别模板序列200bp左右的序列中的六段位置实现，链置换酶发挥链置换作用来形成环介导等温扩增核心元件，形成指数扩增。环介导等温扩增技术，引物设计简单，操作方便，对机器要求低，可以在水浴锅进行反应，非常适合基层临床实时检测。同时，由于环介导等温扩增中会产生焦磷酸盐沉淀，从外观上会直接表现出浑浊度的变化，可以直接肉眼观察，初步筛选。也可以通过核酸染料进行实时荧光检测，从荧光曲线Ct值判断反应进行情况。技术选择性非常多，非常适合临床实时检测的要求，可以在1h内直接出诊断报告，极大压缩诊断消耗的时间。
现行的标准日本脑炎诊断流程包括样本采集，核酸提取以及扩增检测，整个流程大约需要2–3h，非常耗时。
等温扩增以其快速反应特征，可以极大减少检测流程时间。利用恒温扩增的快速和精确诊断的特点，可以替代PCR诊断方法，提高检测速度，达到检测灵敏度，显著减少整个日本脑炎病毒检测时间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测速度块、检测灵敏度高的基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒。
本发明提供的基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒，包括引物组，扩增反应试剂。
本发明根据NCBI中日本脑炎病毒基因组包膜蛋白E基因片段(见SEQ ID NO.5所示)设计引物组，引物组具体为上游外部引物F3、下游外部引物B3、上游内部引物FIP和下游内部引物BIP，依次为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示；
所述扩增反应试剂，包括：Bst DNA聚合酶8U，Mulv逆转录酶8U，UNG酶8U，1mMdNTP，1mM dUTP，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，50mM KCl，0.1％ Tween20，2mM MgSO4，5×SYBR GREENⅠ。利用链置换Bst DNA聚合酶和Mulv逆转录酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，利用UDG酶去除气溶胶污染，实现核酸指数扩增，保证扩增的高度灵敏度和快速性。
本发明中，利用链置换Bst DNA聚合酶和Mulv逆转录酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，利用UDG酶去除气溶胶污染，实现核酸指数扩增，保证扩增的高度灵敏度和快速性。
所述试剂盒，还包括阳性质控以及阴性对照，阳性对照为日本脑炎病毒假病毒，阴性对照为无核酸酶水(无RNA酶和DNA酶的去离子水)。
进一步地，所述外引物F3浓度为0.2-0.4μM，外引物B3浓度为0.2-0.4μM，内引物FIP浓度为1.4-1.8μM，内引物BIP浓度为1.4-1.8μM。
进一步地，所述扩增反应试剂中，可通过加入添加剂如二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖和PEG8000来改变荧光曲线到达平衡点的时间；添加剂可以是一种，也可以是两种的组合，也可以是三种的组合，例如是10％的二甲基亚砜、15％的海藻糖、15％的PEG8000或者5μg的单链结合蛋白。
所述试剂盒，还包括试剂盒的使用说明。
本发明的基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)采用标准方法采集脑脊液样本；
(2)使用Qiagen核酸提取试剂盒进行样本核酸提取；
(3)对提取核酸分别进行检测，分别进行阳性对照反应和阴性对照反应；
(4)反应结束后观察荧光曲线变化，若为S型曲线且反应出峰时间在35min以前，则判断阳性，否则阴性。
本发明的优势在于：
(1)针对日本脑炎病毒的包膜蛋白E基因的6个区域设计4条特异性引物，扩增产物具有高度特异性；本发明在恒温条件下反应，不需要价值昂贵、步骤繁琐的温度循环仪器，降低了检测成本；
(2)UNG酶和dUTP的加入可以去除扩增产物气溶胶污染，进一步降低检测环境污染和扩增结果假阳性；
(3)本发明从样本采集后到核酸扩增结果，整个流程约1h，极大缩短反应时间；仅需要观察荧光曲线判断反应结果，可以减少气溶胶污染；
(4)本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、节省时间等优势；检测日本脑炎病毒方便快捷、成本低廉，适合现场快速检测。
附图说明
图1为本发明的恒温扩增检测日本脑炎病毒临床样本结果。
图2为本发明的恒温扩增检测试剂盒的灵敏度检测结果。
具体实施方式
实施例1，引物设计
外部引物组的Tm值应该在55–63℃，碱基长度在15–25个。内部引物组5’端20个碱基左右的Tm值要高于其他引物组Tm值，控制在60–68℃，内部引物组3’端20个碱基左右的Tm值在55–63℃。所有引物的GC含量控制在30％-65％，需要保证引物的5’端和3’端稳定性，需要避免引物自身和引物之间形成二聚体。引物锚定在靶序列上的位置有着严格的要求，外部引物组之间的碱基长度控制在160-220，相对应的内部引物和外部引物之间的碱基控制在20个以内，内部引物组之间的碱基长度控制在120–180。这4–6条引物能够锚定在核酸的6–8个位置，依赖外部引物组的链置换作用和内部引物组5’端和模板互补的序列特征形成可放大信号的扩增元件，形成一系列不同长度的扩增产物。
本发明对日本脑炎病毒包膜蛋白E基因(见其序列如SEQ ID NO.5所示)中一个片段的6个区域设计了4条特异引物，所述引物组由SEQ ID NO.1所示的上游外部引物F3、SEQID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP和SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP组成。
本发明利用链置换Bst DNA聚合酶、Mulv逆转录酶以及特殊发卡引物实现加速扩增反应。其中聚合酶需要有5’-3’聚合活性，不能有5’–3’外切酶活性，可以在60℃左右反应。逆转录酶需要耐高温，可以在50℃以上能稳定反应。通过聚合酶，逆转录酶，以及引物的设计，形成茎环结构进行扩增，加快反应。
实施例2，采用恒温检测日本脑炎病毒试剂盒检测临床样本
(1)样本采集：采集患者脑脊液；
(2)提取核酸：采用Qiagen试剂盒提取样本核酸；
(3)LAMP检测：
日本脑炎病毒反应体系为25μL，各组分的用量为：1mM dNTP混合物、1mM dUTP、20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、0.1％ Tween20、2mM MgSO4、5×SYBR GREENⅠ、8UBst DNA聚合酶、8U Mulv逆转录酶、8U UNG酶、外引物F3和外引物B3浓度为0.2μM、内引物FIP和BIP浓度为1.6μM，加灭菌纯化水至25μL体系；混匀后将混合物置于63℃荧光定量PCR仪器反应45min，每30s读取一次荧光，检测通道为FAM通道，参见图1所示；
同时设置无菌无核酸去离子水阴性对照和隐球菌阳性对照，用以判定结果；
阴性对照没有出峰阳性对照出峰判定试剂有效；阴性对照没有出峰，阳性对照没有出峰判定试剂过期；阴性对照出峰，阳性对照出峰判定试剂污染，阴性对照出峰，阳性对照没有出峰判定试剂污染且过期；
(4)结果判定
1号为阳性对照，2-5号为临床样本4例，6号为阴性对照；判定临床样本和日本脑炎病毒假病毒阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，反应有效，结果可信；证明样本中存在新型冠状病毒，同时证明该发明具有高特异性(如图1所示)。
实施例3，采用恒温扩增检测日本脑炎病毒试剂盒的灵敏度检测
将临床样本进行核酸提取，然后依次定量成5×107copy/μl,5×106copy/μl,5×105copy/μl,5×104copy/μl,5×103copy/μl,5×102copy/μl,5×10copy/μl,和5copy/μl，在25μl反应体系加入5μl进行扩增，共进行8个浓度梯度检测，其对应终溶液检测限分别为，107copy/μl，106copy/μl，105copy/μl，104copy/μl，103copy/μl，102copy/μl，101copy/μl，100copy/μl。结果如图2，可以看出该检测试剂盒的检测限为100copy/μl。

Claims (4)

1.一种基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒，其特征在于，包括引物组、扩增反应试剂；
所述引物组根据NCBI中日本脑炎病毒基因组包膜蛋白E基因片段SEQ ID NO.5设计，具体为上游外部引物F3、下游外部引物B3、上游内部引物FIP和下游内部引物BIP，依次为SEQID NO.1-SEQ ID NO.4所示；
所述扩增反应试剂包括：Bst DNA聚合酶8U，Mulv逆转录酶8 U，UNG酶8U，1mM dNTP，1mMdUTP，20mM Tris-HCl，10mM (NH4)2SO4，50mM KCl，0.1% Tween20，2mM MgSO4，5 × SYBRGREEN Ⅰ。
2.根据权利要求1所述三基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性质控以及阴性对照，阳性对照为日本脑炎病毒假病毒，阴性对照为无核酸酶水。
3.根据权利要求2所述三基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒，其特征在于，所述外引物F3浓度为0.2-0.4 µM，外引物B3浓度为0.2-0.4 µM，内引物FIP浓度为1.4-1.8 µM，内引物BIP浓度为1.4-1.8 µM。
4.根据权利要求1所述三基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应试剂中，通过加入添加剂来改变荧光曲线到达平衡点的时间；所述添加剂选自二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖和PEG8000。
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