KR102373532B1 - 그래핀 처리를 포함하는 표적 rna 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산화그래핀 처리를 포함하는 표적 RNA 검출 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 산화그래핀 처리를 통해 비특이적 반응을 제거하고, 짧은 염기서열의 RNA까지 분석이 가능하여 높은 민감도 및 정확도로 검출이 가능하여 감염증, 암 등 여러 질환의 진단 용도로도 널리 활용될 수 있다.

Description

그래핀 처리를 포함하는 표적 RNA 검출 방법{A METHOD OF DETECTING TARGET RNA COMPRISING GRAPHENE TREATMENT}
본 발명은 산화그래핀 처리를 포함하는 표적 RNA 검출 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 산화그래핀 처리를 통해 비특이적 반응을 제거하고, 짧은 염기서열의 RNA까지 분석이 가능하여 높은 민감도 및 정확도로 검출이 가능하여 감염증, 암 등 여러 질환의 진단 용도로도 널리 활용될 수 있다.
삶의 질이 향상되면서 질병의 조기 진단에 대한 관심이 커지고 있으며, 분자진단 기술은 질병을 유발하는 병원체의 유전정보 (DNA/RNA)를 직접적으로 검출하기 때문에, 기존의 항원/항체 반응을 기반으로 하여 질병의 간접 인자 (indirect factor)를 검출하는 면역진단 기술의 단점을 해결할 수 있는 기술로서 많은 관심을 받고 있다.
또한, 최근 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)이 크게 유행하면서 전 세계적으로 많은 사망자가 발생하고 WHO에서는 팬데믹 선언까지 하였다. 이러한 RNA 바이러스에 의한 질병의 경우, 높은 돌연변이 발생률에 의해 더욱 큰 피해가 발생되며 감염 여부에 대한 조기 진단이 더욱 요구되고 있다.
한편, miRNA 등 스몰(small) RNA는 생체 내 존재하는 단백질-비 암호화 RNA로, 특정 유전자의 전사 후 과정에 작용하여 해당 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 특히, 세포주기, 분화, 발달, 대사, 발암, 노화와 같은 생물학적 기능을 조절하여 생체의 항상성 유지를 매개하는 중요한 유전적 요소로 인지되며, 특히 이의 비정상적인 네트워크 형성은 세포 생리학적인 측면에서 치명적인 결함을 나타낼 수 있다.
또한, miRNA 등 스몰 RNA의 혈중 내 발현 양상은 암의 초기 단계에서 민감하게 반응하므로 암의 조기, 예측 발견에 있어서 강한 이점을 나타낸다. 또한 단순한 채혈만으로 다양한 암을 검사할 수 있기에 환자로부터 몸에 가해지는 부담이 감소될 수 있다. 나아가, 상기 감염, 암 외에도 알츠하이머, 파킨슨 병 등 여러 난치성 질환의 진단에 있어서 비특이적 검출 반응을 제거하고RNA를 높은 민감도로 신속하게 검출함으로써 조기 진단이 이루어 질 수 있도록 하는 기술 개발에 대한 요구가 증가되고 있다.
한국공개특허 제 10-2019-0086259호 (2019.07.22.)
본 발명의 목적은 그래핀을 처리하는 단계를 포함하는, RNA 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서 DNA; 및 그래핀을 포함하는, RNA 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은, a) 검출 대상이 되는 타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서DNA를 타겟 RNA와 혼성화하는 단계; b) 상기 센서 DNA의 모듈 영역을 주형으로 하고, 상기 타겟 RNA를 프라이머로 하여 중합효소로 중합하는 단계; 및 c) 그래핀을 처리하여 타겟 RNA와 혼성화되지 않은 센서 DNA를 제거하는 단계를 포함하는, RNA 검출 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 b) 단계의 중합 단계를 통해 형성된 중합된 가닥을 c) 단계 이후PCR 반응을 통해 증폭하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 구체적으로 상기 타겟 RNA 는 스몰(small) RNA 일 수 있다. 상기 스몰 RNA 는 miRNA, siRNA 외에도 약 50개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 RNA를 통칭하는 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 그래핀은 산화그래핀(graphite oxide)일 수 있다.
그래핀은 탄소의 동소체 중 하나이며 탄소 원자들이 모여 2차원 평면을 이루고 있는 구조의 탄소 화합물로, 그래핀은 산화그래핀, 환원형 산화그래핀, 그래핀퀀텀닷, CVD 방식으로 제조한 그래핀 등일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 산화그래핀을 처리한 경우, 기존 검출 방법에서 적용되던 뉴클레아제에 비해 단일가닥(single strand, ss) DNA형태의 미반응 센서 DNA를 효과적으로 제거함으로써 비특이적 검출 반응이 억제됨을 확인하였는 바(도 4 내지 도 6), 구체적으로 산화그래핀이 적용될 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 그래핀은 pH 7 내지 pH 8의 조건에서 처리되는 것일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 산화그래핀이 혼합된 경우 실험한 모든 pH 범위에서 ssDNA 센서가 크게 감소된 것을 확인하였으며, 특히, pH 7 내지 8의 범위에서 ssDNA가 크게 감소된 반면, dsDNA는 적게 감소되어 ssDNA 센서 특이적인 제거가 안정적으로 이루어질 수 있음을 확인하였는 바(도 3), 상기 그래핀의 처리는 pH 7 내지 pH 8의 조건에서 이루어질 수 있다. 더욱 구체적으로 산화그래핀의 처리가 pH 7 내지 pH 8의 조건에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면은 타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서 DNA; 및 산화그래핀을 포함하는, RNA 검출용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 센서 DNA는 타겟 RNA를 인지하여 혼성화하고, 상기 산화그래핀은 타겟 RNA와 혼성화되지 않은 센서 DNA를 제거하는 것일 수 있다. 또한, 상기 센서 DNA는 단일 가닥(single strand, ss) DNA 형태인 것일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 타겟 RNA에 대한 상보적인 서열을 포함하는ssDNA 형태인 센서 DNA를 샘플에 혼합하여 타겟 RNA 검출 반응을 진행하였으며, 상기 검출 반응에 있어서 산화그래핀을 처리한 경우 타겟 RNA와 혼성화되지 않은 미반응 센서 DNA가 효과적으로 제거됨으로써 비특이적 PCR 반응이 억제됨을 확인하였다(도 4 내지 도 6). 이에 따라, 타겟 RNA를 검출하기 위한 센서 DNA 및 산화그래핀을 포함하는 RNA 검출용 조성물은 비특이적 반응을 억제하여 정확도를 향상시킨 검출 반응을 통해 타겟 RNA가 정확히 검출되도록 할 수 있다.
나아가, 본 발명 일 실시예에서는 산화그래핀 처리 단계를 포함한 경우 민감도가 현저히 향상되었음을 확인하였다(도 7). 즉, 본 발명의 산화그래핀 처리 단계를 포함하는 RNA 검출 방법은 엔도뉴클레아제 처리를 위한 DNA 클린업 단계가 제외됨에 따라 엔도뉴클레아제를 이용하는 검출 방법에 비해 검출 단계 및 소요되는 시간이 단축될 뿐 아니라, 비특이적 반응을 제거함으로써 검출 민감도를 현저히 향상시킬 수 있다.
상기 RNA 검출용 조성물은 센서 DNA; 및 산화그래핀 외에도 완충액, PCR 프라이머 등을 더욱 포함할 수 있으며, 추가로 포함되는 구성요소는 필요에 따라 변경하여 적용될 수 있다.
본 발명의 RNA 검출 방법 및 검출에 사용되는 센서 DNA의 구성은 검출 한계가 펨토몰(fmol), 아토몰(amol) 수준으로 매우 낮은 바, 종래 RNA 검출 기술에 비해 민감도 및 정확도가 현저히 우수하다. 특히, 그래핀을 처리함으로써 비특이적 반응을 억제하면서도 검출 민감도를 현저히 향상시켰으며, 종래의 뉴클레아제 적용 검출 방법에 비해 검출 단계가 감소되어 검출에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 기존 엔도뉴클레아제 처리 및 본 발명의 그래핀 처리 단계 적용시의 반응 순서도를 나타낸 것이다. 그래핀 처리의 경우 검출에 필요한 단계가 감소되어 소요 시간이 감축된다.
도 2는 산화그래핀의 ssDNA 특이적 제거 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 pH에 따른 산화그래핀의 ssDNA 센서, dsDNA 제거 효과를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 전혈에서의 엔도뉴클레아제 및 산화그래핀의 ssDNA 센서 제거 효과를 비교한 결과를 나타낸 것이다(-RNA: 타겟 RNA와 미결합된 센서 DNA(ssDNA), +RNA: 타겟 RNA와 결합된 센서 DNA(double strand 형성)).
도 5는 혈장(plasma)에서의 엔도뉴클레아제 및 산화그래핀의 ssDNA 센서 제거 효과를 비교한 결과를 나타낸 것이다(-RNA: 타겟 RNA와 미결합된 센서 DNA(ssDNA), +RNA: 타겟 RNA와 결합된 센서 DNA(double strand 형성)).
도 6은 멀티플렉스 검출시 비특이적 반응 감소 효과를 비교한 결과를 나타낸 것이다(-RNA: 타겟 RNA와 미결합된 센서 DNA(ssDNA), +RNA: 타겟 RNA와 결합된 센서 DNA(double strand 형성)).
도 7은 산화그래핀, 엔도뉴클레아제 처리에 따른 검출 민감도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 산화그래핀의 ssDNA 특이적 제거 효과 확인
2 fmol ssDNA(miR93 센서 DNA), 100 amol dsDNA(miR210 센서 DNA 앰플리콘(amplicon))을 이용하여 산화그래핀의 ssDNA 형태인 센서 DNA에 대한 특이적 제거 효과를 확인하였다.
상기 센서 DNA는 타겟 RNA와의 상보적인 서열을 포함하는 센싱 영역을 포함하며, 상기 센싱 영역은 타겟 RNA를 감지하여 타겟 RNA와 혼성화하는 것으로서, '센서 DNA'로 명명하였다. 타겟 RNA와 혼성화되지 않은 센서 DNA는 ssDNA로 남아 검출에 있어 비특이적 반응을 일으킬 수 있는 바, 검출을 위한 PCR 반응 전에 이를 제거하는 단계가 필요하다. 본 발명에서는 산화그래핀을 혼합하여 센서 DNA에 의한 비특이적 반응을 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 2 fmol ssDNA(miR93 센서 DNA), 100 amol dsDNA(miR210 센서 DNA 앰플리콘(amplicon))과 산화그래핀(Graphene Oxide, GO 구입처 GRAPHENE SUPERMARKET) 100 ug을 섞어준 후 5 ul 10x 반응용 완충용액(reaction Buffer, 80 mM Tris-HCl, 40 mM (NH4)2SO4, 40 mM KCl, 8 mM MgSO4, 0.4% Triton®X-100 (pH7.0, 25 ℃))를 넣고, 증류수로 최종 볼륨이 50ul가 되도록 맞추었다. 상기 dsDNA는 센서 DNA와 타겟 RNA가 혼성화된 경우를 상정한 것이다. 각 센서 DNA 서열은 표 1에 정리된 바와 같다.
이후 10분간 25 ℃에서 인큐베이션 후 5분간 13,200 rpm으로 원심분리하여 산화그래핀을 침전시킨 후 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 이후, 상기 혼합물을 MEGAquick-spin™Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하고, 100 ul에 용리한 후 3 ul 샘플을 miR93 및 miR210 센서 특이적 프라이머를 이용하여 각각 95 ℃3 분 1사이클, 95 ℃10초, 64.5 ℃30초 40 사이클조건으로 qPCR을 수행하였다. 상기 miR93 및 miR210 센서 특이적 프라이머 서열은 표 2에 정리된 바와 같다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 산화그래핀을 넣어주었을 때 ssDNA의 경우 ct 값이 20.54 에서 30.03으로 10사이클 증가하는 것을 확인하였으며, dsDNA는 산화그래핀을 넣어주었을 때 ct 값이 28.7에서 30.21로 1.5사이클 증가하는 변화를 나타냄을 확인하였다. 이로부터 산화그래핀은 상기 조건에서 dsDNA보다 ssDNA 센서 DNA를 특이적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. pH에 따른 산화그래핀의 ssDNA 센서 제거 효과 확인
2 fmol ssDNA(miR93 센서 DNA), 100 amol dsDNA(miR210 센서 DNA 앰플리콘(amplicon)) 및 산화그래핀 100 ug을 혼합하였다. 이후, 10x 반응용 완충용액(reaction Buffer, 80 mM Tris-HCl, 40 mM (NH4)2SO4, 40 mM KCl, 8 mM MgSO4, 0.4% Triton®X-100)를 pH가 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0가 되도록 각각 제조한 후 샘플에 5 ul를 넣어준 후 최종 볼륨이 50ul가 되도록 맞추었다. 이후 10분간 25 ℃에서 인큐베이션 후 5분간 13,200 rpm으로 원심분리하여 산화그래핀을 침전시켰다. 이후, 상기 혼합물을 MEGAquick-spin™Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하고, 100 ul에 용리한 후 3 ul 샘플을 miR93 및 miR210 센서 특이적 프라이머를 이용하여 각각 95 ℃ 3 분 1사이클, 95 ℃ 10초, 64.5 ℃ 30초 40 사이클조건으로 qPCR을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 산화그래핀이 혼합된 경우 실험한 모든 pH 범위에서 ssDNA 센서가 크게 감소된 것을 확인하였다. 반면, dsDNA의 경우 일부 감소되었으나, ssDNA 센서에 비해 적게 감소되었다. 특히, pH 7 내지 8의 범위에서 ssDNA가 크게 감소된 반면, dsDNA는 적게 감소되어 ssDNA 센서 특이적인 제거가 안정적으로 이루어질 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 전혈에서의 엔도뉴클레아제 및 산화그래핀의 ssDNA 센서 제거 효과 확인
인간 혈액 샘플로부터 miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen)을 사용하여 RNA를 정제하였다.
1 ug의 전혈 RNA 및 500 amol의 miR93 센서 DNA를 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100, (pH 8.8 at 25°C)), 1 ㎕의 10 mM dNTP 및 2 unit의 DNA 폴리머라제(XenoT-POL)를 혼합하였다. 혼합액을 95 ℃에서 30초 간 가열한 후 63 ℃ 에서 7 분간 인큐베이션(incubation)하였다.
상기 혼합액을 분리하여 하나의 샘플에는 산화그래핀을 혼합하고, 다른 하나의 샘플은 엔도뉴클레아제를 혼합한 후, 각각 qPCR을 진행하였다.
구체적으로, XenoT-POL 샘플 20㎕를 50㎕로 희석한 후 산화그래핀 100 ug을 혼합하고, 8 mM Tris-HCl, 4 mM (NH4)2SO4, 4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, 0.04% Triton®X-100 (pH7.0, 25 ℃) 조건에서 10분간 25 ℃ 에서 인큐베이션 하였다. 이후 5 분간 13,200 rpm으로 원심분리하여 산화그래핀을 침전시켰다. 이후, 상층액을 얻어 새로운 튜브로 옮긴 후 DNA clean up kit로 정제하여 100 ul에 용리한 후 3 ul 샘플을 miR93 센서 특이적 프라이머를 이용하여 95 ℃ 3 분 1사이클, 95 ℃ 10초, 64.5 ℃ 30초 40 사이클조건으로 qPCR을 수행하였다.
또한, 20 ㎕의 XenoT-POL 샘플을 MEGAquick-spin™ Total Fragment DNA Purification Kit를 이용하여 클린업하고, 50 ㎕의 증류수로 용리하여, 엔도뉴클레아제 혼합물(40 mM 소듐아세테이트(sodium acetate, pH 4.5 at 25 °C), 300 mM NaCl, 2 mM ZnSO4 및 200 unit S1 뉴클레아제(nuclease))을 섞어주고 37 °C에서 11 분간 인큐베이션 하였다.
이후, MEGAquick-spin™ Total Fragment DNA Purification Kit을 이용하여 클린업하고, 100 ㎕의 증류수로 용리한 후 3 ul 샘플을 miR93 센서 특이적 프라이머를 이용하여 95 ℃ 3 분 1사이클, 95 ℃ 10초, 64.5 ℃ 30초 40 사이클조건으로 qPCR을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 산화그래핀을 처리한 경우, RNA와 미결합된 센서 DNA가 모두 제거되어 PCR 결과가 나타나지 않음을 확인한 반면, 뉴클레아제가 처리된 경우 RNA와 미결합된 센서 DNA가 모두 제거되지 않고 남아 PCR 수행 후 Ct 값이 나타남을 확인하였다(-RNA: 타겟 RNA와 미결합된 센서 DNA(ssDNA), +RNA: 타겟 RNA와 결합된 센서 DNA(double strand 형성)).
상기와 같은 결과로부터 산화그래핀을 처리하는 단계를 포함하는 본 발명의 RNA 검출 기술은 검출 수단으로 이용되는 ssDNA 형태의 센서 DNA가 타겟 RNA와 혼성화되지 못한 경우 모두 제거됨으로써 비특이적 검출 반응이 나타나지 않음을 확인하였다.
실시예 4. 혈장(plasma)에서의 엔도뉴클레아제 및 산화그래핀의 ssDNA 센서 제거 효과 확인
250 ㎕의 인간 혈장 샘플에서 miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen)을 사용하여 RNA를 정제하였다.
상기 정제된 RNA를 40 ㎕ Elution 버퍼에 용리한 후, 13 ㎕ 샘플에 miR93 센서 DNA 및 miR210 센서 DNA를 각 500 amol 씩 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100, (pH 8.8, 25°C)), 1 ㎕의 10 mM dNTP 및 2 unit DNA 폴리머라제(XenoT-POL)를 넣어준 후 95 ℃에서 30초 간 가열한 후 63 ℃ 에서 7 분간 인큐베이션 하였다.
상기 혼합액을 분리하여 하나의 샘플에는 산화그래핀을 혼합하고, 다른 하나의 샘플은 엔도뉴클레아제를 혼합한 후, 각각 qPCR을 진행하였다. 산화그래핀 혼합, 뉴클레아제 혼합 이하 세부 진행 과정은 상기 실시예 3과 같다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 혈장 샘플을 이용한 경우에도 산화그래핀을 처리한 경우, RNA와 미결합된 센서 DNA가 모두 제거되어 PCR 결과가 나타나지 않음을 확인한 반면, 뉴클레아제를 처리한 경우 RNA와 미결합된 센서 DNA가 모두 제거되지 않고 남아 PCR 수행 후 Ct 값이 나타남을 확인하였다(-RNA: 타겟 RNA와 미결합된 센서 DNA(ssDNA), +RNA: 타겟 RNA와 결합된 센서 DNA(double strand 형성)). 또한, 센서 DNA를 달리하여 적용하더라도 동일하게 비특이적 반응이 제거됨을 확인하였다.
실시예 5. 멀티플렉스 검출시 비특이적 반응 감소 효과 비교
뉴클레아제와 산화그래핀 각 처리의 경우, 여러 종류의 센서 DNA 및 타겟 RNA를 혼합하여 멀티플렉스 검출시의 비특이적 검출 반응 감소 효과를 비교하였다.
구체적으로, 인간 혈액 샘플에서 RNA 정제 후 1ug의 전혈 RNA와 8종의 miRNA(miR93, miR210, miR486-5p, miR31, miR214, miR3656, miR425, miR1290) 검출을 위한 각각의 센서 DNA 8종을 각 500 amol씩 혼합하였다.
이후, 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100, (pH 8.8, 25°C)), 1 ㎕의 10 mM dNTP 및 2 unit DNA 폴리머라제(XenoT-POL)를 넣어준 후 95 ℃에서 30초 간 가열한 후 63 ℃ 에서 7 분간 인큐베이션 하였다.
상기 혼합액을 분리하여 하나의 샘플에는 산화그래핀을 혼합하고, 다른 하나의 샘플은 엔도뉴클레아제를 혼합한 후, 각각 qPCR을 진행하였다. 산화그래핀 혼합, 뉴클레아제 혼합 이하 세부 진행 과정은 상기 실시예 3과 같다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 멀티플렉스 방식으로 8종에 대한 타겟 RNA를 동시에 검출하는 경우에도, 산화그래핀을 처리한 경우 RNA와 미결합된 센서 DNA의 제거 효과가 뉴클레아제 S1을 처리한 경우에 비해 현저히 우수함을 확인하였다. 구체적으로, 멀티플렉스 검출 반응에서, 산화그래핀을 처리한 경우 뉴클레아제 S1을 처리한 경우에 비해 타겟 RNA와 미결합된 센서 DNA 제거가 효과적으로 나타남에 따라, PCR 수행 후 Ct 값이 -RNA에서 증가됨을 확인하였다(-RNA: 타겟 RNA와 미결합된 센서 DNA(ssDNA), +RNA: 타겟 RNA와 결합된 센서 DNA(double strand 형성)).
상기와 같은 결과는 본 발명의 산화그래핀을 이용한 검출 방법은 타겟 RNA와 혼성화하지 못하여 비특이적 반응을 일으킬 수 있는 센서 DNA를 효과적으로 제거함으로써 비특이적 반응에 의한 결과가 검출 결과에 포함되지 않도록 한다. 이로부터 뉴클레아제를 처리하기 위한 클린업 과정을 거치지 않아 검출 시간을 단축하면서도 비특이적 반응을 최소화함으로써 검출의 정확도를 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 엔도뉴클레아제 및 산화그래핀의 처리에 따른 검출 민감도 비교
인간 혈액 샘플로부터 miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen)을 사용하여 RNA를 정제하였다. 각각 100, 50, 25, 12.5 ng의 전혈 RNA 및 500 amol의 miR93 센서 DNA를 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100, (pH 8.8 at 25°C)), 1 ㎕의 10 mM dNTP 및 2 unit의 DNA 폴리머라제(XenoT-POL)를 혼합하였다. 혼합액을 95 ℃에서 30초 간 가열한 후 63 ℃ 에서 7 분간 인큐베이션(incubation)하였다.
상기 혼합액을 분리하여 하나의 샘플에는 산화그래핀을 혼합하고, 다른 하나의 샘플은 엔도뉴클레아제를 혼합한 후, 각각 qPCR을 진행하였다. 산화그래핀 혼합, 뉴클레아제 혼합 이하 세부 진행 과정은 상기 실시예 3과 같다.
그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이 산화그래핀을 처리한 경우, 엔도뉴클레아제를 처리한 것보다 검출능에서 현저히 향상된 민감도를 보여 100, 50, 25, 12.5 ng에서 더 낮은 Ct값이 나타남을 확인하였다. 도 7B에서는 miR93 분자 개수에 대한 qPCR standard curve를 이용하여 각 샘플에서 ㎕당 miRNA93의 분자 개수를 환산한 결과, 산화그래핀을 처리한 샘플은 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플보다 2.87~7.69 배의 miRNA93를 탐지할 수 있음을 확인하였다. 이를 통해 산화그래핀을 처리한 경우 엔도뉴클레아제를 처리한 것보다 검출능에서 향상된 민감도를 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명의 산화그래핀 처리 단계를 포함하는 RNA 검출 방법은 엔도뉴클레아제 처리를 위한 DNA 클린업 단계가 제외됨에 따라 엔도뉴클레아제를 이용하는 검출 방법에 비해 검출 단계 및 소요되는 시간이 단축될 뿐 아니라, 비특이적 반응을 제거함으로써 검출 민감도를 현저히 향상시킬 수 있다.
상기 실시예 1 내지 6의 각 miRNA 검출을 위한 센서 DNA의 서열은 하기 표 1에 정리된 바와 같다.
Figure 112020080900654-pat00001
또한, qPCR 수행시 이용된 프라이머 서열은 하기 표 2에 정리된 바와 같다.
Figure 112020080900654-pat00002
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Xenohelix. Co., Ltd. <120> A METHOD OF DETECTING TARGET RNA COMPRISING GRAPHENE TREATMENT <130> 20PP30344 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR93 sensor DNA <400> 1 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc aacgagatca tggcgtgact 60 ggagttgctt ggctctggtg tattggtcta cctgcacgaa cagcactttg 110 <210> 2 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR210 sensor DNA <400> 2 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc atacgagata catcggtgac 60 tggagttgct tggctctggt gtattggttc agccgctgtc acacgcacag 110 <210> 3 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR486-5p sensor DNA <400> 3 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc atacgagatt taggcgtgac 60 tggagttgct tggctctggt gtattggttc ggggcagctc agtacagga 109 <210> 4 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR31 sensor DNA <400> 4 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc atacgagatt acagcgtgac 60 tggagttgct tggctctggt gtattggtag ctatgccagc atcttgcct 109 <210> 5 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR214 sensor DNA <400> 5 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc atacgagatt ataatgtgac 60 tggagttgct tggctctggt gtattggtac tgcctgtctg tgcctgctgt 110 <210> 6 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR3656 sensor DNA <400> 6 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc atacgagata tgagcgtgac 60 tggagttgct tggctctggt gtattggtcc acccccgcac ccgcc 105 <210> 7 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR425 sensor DNA <400> 7 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc atacgagatc attttgtgac 60 tggagttgct tggctctggt gtattggttc aacgggagtg atcgtgtcat t 111 <210> 8 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR1290 sensor DNA <400> 8 aacaatacca cgaccaccga caactacacg ctacagtcgc atacgagatt cattcgtgac 60 tggagttgct tggctctggt gtattggttc cctgatccaa aaatcca 107 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR93 target RNA <400> 9 ctacagtcgc atacgagatc atggc 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR93 target RNA <400> 10 caaagtgctg ttcgtgcagg taga 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR210 target RNA <400> 11 ctaagtcgca tacgagatac atcg 24 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR210 target RNA <400> 12 tgcgtgtgac agcggctgaa c 21 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR486-5p target RNA <400> 13 cgctacagtc gcatacgaga tttaggc 27 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR486-5p target RNA <400> 14 tcctgtactg agctgccccg ag 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR31 target RNA <400> 15 cagtcgcata cgagattaca gc 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR31 target RNA <400> 16 aggcaagatg ctggcatagc t 21 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR214 target RNA <400> 17 cacgctacag tcgcatacga gattataat 29 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR214 target RNA <400> 18 acagcaggca cagacaggc 19 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR3656 target RNA <400> 19 gctacagtcg catacgagat atgagc 26 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR3656 target RNA <400> 20 ggcgggtgcg ggggtgg 17 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR425 target RNA <400> 21 cagtcgcata cgagatcatt ttgtg 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR425 target RNA <400> 22 aatgacacga tcactcccgt tgaac 25 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR1290 target RNA <400> 23 gctacagtcg catacgagat tcattc 26 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR1290 target RNA <400> 24 tggatttttg gatcagggaa ccaa 24

Claims (9)

  1. a) 검출 대상이 되는 타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서DNA를 타겟 RNA와 혼성화하는 단계;
    b) 상기 센서 DNA의 모듈 영역을 주형으로 하고, 상기 타겟 RNA를 프라이머로 하여 중합효소로 중합하는 단계; 및
    c) 그래핀을 처리하여 타겟 RNA와 혼성화되지 않은 센서 DNA를 제거하는 단계를 포함하고,
    상기 b) 단계의 중합 단계를 통해 형성된 중합된 가닥을 c) 단계 이후 PCR 반응을 통해 증폭하는 단계를 더욱 포함하는, RNA 검출 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 타겟 RNA는 스몰(small) RNA인 것인, RNA 검출 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 스몰 RNA는 miRNA인 것인, RNA 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 그래핀은 산화그래핀(graphite oxide)인 것인, RNA 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 그래핀은 pH 7 내지 pH 8의 조건에서 처리되는 것인, RNA 검출 방법.
  7. 타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서 DNA; 및 산화그래핀을 포함하는 RNA 검출용 조성물로서,
    상기 RNA 검출은,
    a) 검출 대상이 되는 타겟 RNA의 상보적인 서열을 포함하는 센서DNA를 타겟 RNA와 혼성화하는 단계;
    b) 상기 센서 DNA의 모듈 영역을 주형으로 하고, 상기 타겟 RNA를 프라이머로 하여 중합효소로 중합하는 단계; 및
    c) 산화그래핀을 처리하여 타겟 RNA와 혼성화되지 않은 센서 DNA를 제거하는 단계를 포함하고,
    상기 b) 단계의 중합 단계를 통해 형성된 중합된 가닥을 c) 단계 이후 PCR 반응을 통해 증폭하는 단계를 더욱 포함하는 것인, RNA 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 센서 DNA는 타겟 RNA를 인지하여 혼성화하고,
    상기 산화그래핀은 타겟 RNA와 혼성화되지 않은 센서 DNA를 제거하는 것인, RNA 검출용 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 센서 DNA는 단일 가닥(single strand, ss) DNA 형태인 것인, RNA 검출용 조성물.
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