KR20100012319A - 패혈증­유발 미생물의 분류 및 동정 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 패혈증-유발 미생물의 분류 및 동정 방법에 관한 것으로서, 멀티플랙스 증폭 방식으로 패혈증-유발 미생물을 분류 및 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 다양한 패혈증 유발 미생물을 멀티플랙스 증폭 방식으로 동시에 분류 및 동정할 수 있다. 본 발명에 따르면, 패혈증 유발 미생물을 고속으로 보다 간편한 방식으로 분류 및 동정할 수 있고, 60 여종이 넘은 패혈증 유발 미생물을 분류 및 동정할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 위음성 및 위양성과 같은 오류 데이터 없이 멀피플랙스 증폭 방식으로 패혈증 유발 미생물을 고속으로 분류 및 동정할 수 있다.
패혈증, 미생물, 박테리아, 분류, 동정, 검출, 프라이머, 증폭

Description

패혈증­유발 미생물의 분류 및 동정 방법{Methods for Classifying and Identifying Sepsis­Causing Microorganisms}
본 발명은 패혈증-유발 미생물의 분류 및 동정 방법에 관한 것이다.
패혈증은 독성-생성 미생물의 감염에 의한 전신 염증 상태로 특징되는 심각한 질환이며, 전신성 염증 반응증(systemic inflammatory response syndrome: SIRS)이라 불린다(Levy MM, et al., Crit . Care Med . 31(4):12506(2003); Bone RC et al., Chest 101(6):164455(1992)).
미생물, 특히 박테리아에 의한 감염의 주요한 위치는 폐, 배, 요로, 피부/연질 조직 및 중추신경계 등이다. 폐혈증의 증상은 일반적으로 감염 과정과 관련이 있다. 감염에 의해 패혈증이 유발되면, 빈맥, 빈호흡, 열 및/또는 감소된 배뇨와 같은 증상이 나타난다. 패혈증을 유발하는 면역반응은 염증 반응 및 혈액응고 과정의 전신성 활성화를 초래하는 전신성 염증 반응이다. 이러한 증상은 순환계의 이상을 초래하며 다수의 기관 이상 및 종국적으로 사망을 야기한다.
패혈증의 진단은 전통적으로 혈액 시료의 배양을 통하여 실시되는 것이 일반적이며, 이러한 진단은 시간이 많이 소모되는 작업이다.
미국 특허출원 공개 제20080146455호는 E. coli의 특정 서열에 특이적으로 혼성화되는 프라이머를 이용하여 패혈증을 검출하는 방법을 개시하고 있다. WO 2007/083852는 패혈증-유발 박테리아를 검출할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 개시하고 있다.
미국 특허출원 공개 제20050214820호는 미토콘드리아 핵산 분자의 상대적인 양을 측정하여 패혈증이 있는 환자를 진단하는 방법을 개시하고 있다. 미국 특허출원 공개 제20080114576호는 RT-PCR 및 유세포 분석기를 이용하여 패혈증의 초기 단계를 진단하는 방법을 기재하고 있다.
현재까지 패혈증을 진단하거나 패혈증-유발 미생물을 검출하는 많은 방법들이 소개되었으나, 패혈증을 유발하는 미생물의 종류가 매우 많고 이용되는 기술의 한계 때문에 여전히 시간 및 비용이 많이 소모되고, 정확도 측면에서도 개선하여야 하는 측면이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 패혈증 유발 미생물을 보다 개선된 효율성, 재현성 및 정확성으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 멀티플렉스 증폭 방법을 기초로 하여 패혈증 유발 미생물을 분류 및 동정하는 방식으로 패혈증 유발 미생물을 검출하는 신규한 방법을 개발하였고, 이 방법을 이용하는 경우에는 오류 데이터(위양성 또는 위음성 데이터) 없이 패혈증 유발 미생물을 분류 및 동정할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 패혈증-유발 미생물의 분류 및 검출의 동시 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 패혈증-유발 미생물의 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 패혈증-유발 미생물의 분류용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 패혈증-유발 미생물종의 동정용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 패혈증-유 발 미생물의 분류 및 검출의 동시 방법을 제공한다:
(a) 생물학적 시료로부터 핵산 분자를 수득하는 단계;
(b) 균류(fungi), 스타필로코커스(Staphylococcus) 속 박테리아, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 박테리아, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 박테리아 및 그람 음성 박테리아로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 3개의 패혈증-유발 미생물군각각에 속하는 최소 3종의 미생물종, 총 최소 9종의 미생물종의 핵산 분자에 혼성화되는 최소 9개의 미생물군 분류용 프라이머쌍을 상기 핵산 분자에 접촉시키는 단계로서, 상기 동일한 미생물군의 분류에 이용되는 미생물군 분류용 프라이머쌍은 동일 크기의 증폭산물(amplicon)을 생성하며 다른 미생물군의 분류에 이용되는 미생물군 분류용 프라이머쌍은 서로 다른 크기의 증폭산물을 생성하고;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 이용하여 상기 생물학적 시료로부터 수득한 핵산 분자를 멀티플렉스 방식으로 증폭시키는 단계; 그리고,
(d) 상기 증폭산물의 크기를 분석하여 생물학적 시료에 포함된 패혈증-유발 미생물의 분류(classifying) 및 검출(detecting)을 동시에 하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 패혈증-유발 미생물의 검출방법을 제공한다:
(a) 생물학적 시료로부터 핵산 분자를 수득하는 단계;
(b) 균류(fungi), 스타필로코커스(Staphylococcus) 속 박테리아, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 박테리아, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 박테리아 및 그 람 음성 박테리아로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 3개의 패혈증-유발 미생물군각각에 속하는 최소 3종의 미생물종, 총 최소 9종의 미생물종의 핵산 분자에 혼성화되는 최소 9개의 미생물군 분류용 프라이머쌍을 상기 핵산 분자에 접촉시키는 단계로서, 상기 동일한 미생물군의 분류에 이용되는 미생물군 분류용 프라이머쌍은 동일 크기의 증폭산물(amplicon)을 생성하며 다른 미생물군의 분류에 이용되는 미생물군 분류용 프라이머쌍은 서로 다른 크기의 증폭산물을 생성하고;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 이용하여 상기 생물학적 시료로부터 수득한 핵산 분자를 멀티플렉스 방식으로 증폭시키는 단계;
(d) 상기 증폭산물의 크기를 분석하여 생물학적 시료에 포함된 패혈증-유발 미생물을 분류(classifying)하는 단계;
(e) 상기 패혈증-유발 미생물군에 속하는 최소 3종의 미생물종의 핵산분자와 혼성화 되는 최소 3개의 미생물종 동정용 프라이머쌍 및 상기 생물적 시료로부터 얻은 핵산분자를 이용하여 상기 핵산분자를 멀티플렉스 방식으로 증폭시키는 단계로서, 상기 최소 3개의 미생물종 동정용 프라이머쌍은 서로 다른 크기의 증폭산물을 생성하며; 그리고,
(f) 상기 증폭산물의 크기를 분석하여 생물학적 시료에 포함된 패혈증-유발 미생물의 종을 동정(identifying)하는 단계.
본 발명자들은 패혈증 유발 미생물을 보다 개선된 효율성, 재현성 및 정확성으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 멀 티플렉스 증폭 방법을 기초로 하여 패혈증 유발 미생물을 분류 및 동정하는 방식으로 패혈증 유발 미생물을 검출하는 신규한 방법을 개발하였고, 이 방법을 이용하는 경우에는 오류 데이터(위양성 또는 위음성 데이터) 없이 패혈증 유발 미생물을 분류 및 동정할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있다: 패혈증 유발 미생물의 분류(classifying) 및 동정(identifying).
본 명세서에서 용어 “분류”는 분석 대상의 생물학적 시료에 있는 패혈증 유발 미생물이 균류, 스타필로코커스 속 박테리아, 엔테로코커스 속 박테리아, 스트렙토코커스 속 박테리아 및 그람 음성 박테리아, 총 5종류의 미생물군 중에서 어떠한 미생물군에 속하는 지를 판별하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “동정”은 분석 대상의 생물학적 시료에 있는 패혈증 유발 미생물이 어떠한 미생물종(species)에 속하는 지를 판별하는 것을 의미한다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 생물학적 시료로부터 핵산 분자를 수득한다. 본 발명에 이용되는 생물학적 시료는 다양한 동물로부터 얻을 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간으로부터 얻는다. 본 발명에 이용될 수 있는 생물학적 시료는 바람직하게는, 조직, 세포, 혈액, 림프, 골수액, 타액, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수 및 양막액이며, 가장 바람직하게는 혈액이다. 생물학적 시료로서 혈액은 전혈, 혈장, 또는 혈청이다.
생물학적 시료로부터 얻는 핵산 분자는 DNA(예컨대, gDNA) 또는 RNA(예컨대, mRNA)이다.
생물학적 시료로부터 DNA를 얻는 방법에 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 실시할 수 있다(Peter B. Kaufman, et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Inc (1995) and Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)). 예를 들어, 페놀/클로로포름 혼합물물에 의한 추출 및 침전, 그리고 스핀 컬럼을 이용한 분리 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal . Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 멀티플렉스 방식으로 증폭되는 핵산 분자는 생물학적 시료로부터 얻은 DNA 시료이다.
본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 멀티플렉스 증폭 방식으로 생물학적 시료에 포함된 패혈증 유발 미생물을 분류하는 것이다. 이 경우, 균류, 스타필로코커스 속 박테리아, 엔테로코커스 속 박테리아, 스트렙토코커스 속 박테리아 및 그람 음성 박테리아로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 3개의 패혈증-유발 미생물군 각각에 속하는 최소 3종의 미생물종, 총 최소 9종의 미생물종의 핵산 분자에 혼성 화되는 최소 9개의 미생물군 분류용 프라이머쌍(primer pairs for classifying)을 동시에 이용하여 멀티플렉스 증폭을 한다.
분류를 위한 멀티플렉스 증폭에서 동일한 미생물군의 분류에 이용되는 미생물군 분류용 프라이머쌍은 동일 크기의 증폭산물(amplicon)을 생성하며 다른 미생물군의 분류에 이용되는 미생물군 분류용 프라이머쌍은 서로 다른 크기의 증폭산물을 생성한다. 즉, 미생물군의 분류는 멀티플렉스 증폭산물의 크기에 의해 결정된다.
본 발명자들이 아는 한(to our best knowledge), 최소 9개의 미생물군 분류용 프라이머쌍을 동시에 이용하여 멀티플렉스 증폭을 하여, 최소 3개의 패혈증-유발 미생물군으로 분류하는 것은 본 발명자들에 의해 처음으로 제안된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)는 최소 4개의 패혈증-유발 미생물군 각각에 속하는 최소 3종의 미생물종의 핵산분자에 혼성화 되는 최소 3개의 미생물군 분류용 프라이머쌍, 즉 총 12개의 미생물군 분류용 프라이머쌍을 이용하여 실시된다. 보다 바람직하게는, 단계 (b)는 최소 5개의 패혈증-유발 미생물군 각각에 속하는 최소 3종의 미생물종의 핵산분자에 혼성화 되는 최소 3개의 미생물군 분류용 프라이머쌍, 즉 총 15개의 미생물군 분류용 프라이머쌍을 이용하여 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 패혈증-유발 균류로 분류될 수 있는 미생물은 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파라프실로시스, 칸디다 글라브라타, 칸디다 크루세이 및 아스퍼길루스 퍼미게터스 로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 3종, 보다 바람직하게는 최소 4종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종, 가장 바람직하게는 6종 모두이다.
예를 들어, 상기 균류 6종 모두를 패혈증-유발 균류로 분류하는 멀티플렉스 증폭에서 총 6개의 프라이머쌍이 이용될 수 있으며, 이 경우 총 6개의 프라이머쌍은 서로 다른 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있으나, 이로부터 나오는 증폭산물은 동일 크기를 갖도록 디자인된다.
패혈증-유발 균류의 분류에 이용되는 가장 바람직한 프라이머가 서열목록 제1서열 내지 제12서열에 예시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 패혈증-유발 스타필로코커스 속 박테리아로 분류될 수 있는 미생물은 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스타필로코커스 헤모라이틱쿠스, 스타필로코커스 파스테리, 스타필로코커스 와르네리, 스타필로코커스 코나이 아종. 우레아리티쿠, 스타필로코커스 카프래, 스타필로코커스 에쿠오럼, 스타필로코커스 시물란스, 스타필로코커스 알레태, 스타필로코커스 클루사이, 스타필로코커스 갈리나럼, 스타필로코커스 아우리쿨라리스, 스타필로코커스 크로모제넨스, 스타필로코커스 델피니 및 스타필로코커스 인터메디우스로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 4종, 보다 바람직하게는 최소 5종, 보다 더 바람직하게는 최소 10종, 가장 바람직하게는 18종 모두이다.
예를 들어, 스타필로코커스 속 박테리아 18종 모두를 패혈증-유발 스타필로코커스 속 박테리아로 분류하는 멀티플렉스 증폭에서 총 18개의 프라이머쌍이 이용 될 수 있으며, 이 경우 총 18개의 프라이머쌍은 서로 다른 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있으나, 이로부터 나오는 증폭산물은 동일 크기를 갖도록 디자인된다. 또한, 이용되는 프라이머쌍의 개수를 줄이기 위하여 스타필로코커스 속 박테리아에서 공통적으로 발견되는 보존성 서열(conserved sequence)에 혼성화 되는 프라이머쌍을 제작할 수 있다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 스타필로코커스 속 박테리아 18종 모두를 패혈증-유발 스타필로코커스 속 박테리아로 분류하기 위하여, 전방향 프라이머 총 11개 및 역방향 프라이머 총 6개를 이용하고 있다.
패혈증-유발 스타필로코커스 속 박테리아의 분류에 이용되는 가장 바람직한 프라이머가 서열목록 제13서열 내지 제29서열에 예시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 패혈증-유발 엔테로코커스 속 박테리아로 분류될 수 있는 미생물은 엔테로코커스 페에시움, 엔테로코커스 페칼리스, 엔테로코커스 아비움 및 엔테로코커스 두란스, 총 4종 모두이다.
예를 들어, 엔테로코커스 속 박테리아 4종 모두를 패혈증-유발 엔테로코커스 속 박테리아로 분류하는 멀티플렉스 증폭에서 총 4개의 프라이머쌍이 이용될 수 있으며, 이 경우 총 4개의 프라이머쌍은 서로 다른 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있으나, 이로부터 나오는 증폭산물은 동일 크기를 갖도록 디자인된다. 또한, 이용되는 프라이머쌍의 개수를 줄이기 위하여 엔테로코커스 속 박테리아에서 공통적으로 발견되는 보존성 서열에 혼성화 되는 프라이머쌍을 제작할 수 있다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 엔테로코커스 속 박테리아 4종 모두를 패혈증-유발 엔 테로코커스 속 박테리아로 분류하기 위하여, 2개의 프라이머쌍이 이용되고 있다.
패혈증-유발 엔테로코커스 속 박테리아의 분류에 이용되는 가장 바람직한 프라이머가 서열목록 제30서열 내지 제33서열에 예시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 패혈증-유발 스트렙토코커스 속 박테리아로 분류될 수 있는 미생물은 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 아갈락티에, 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 안기노서스, 스트렙토코커스 고르도나이, 스트렙토코커스 인터메디우스, 스트렙토코커스 오랄리스, 스트렙토코커스 파라산구이니스, 스트렙토코커스 베스티불라리스, 스트렙토코커스 알락토리티쿠스, 스트렙토코커스 크리세티, 스트렙토코커스 다운에이, 스트렙토코커스 페루스, 스트렙토코커스 갈리나세우스, 스트렙토코커스 하이오인테스티날리스, 스트렙토코커스 루테티엔시스, 스트렙토코커스 마카새, 스트렙토코커스 파라우베리스, 스트렙토코커스 소브리너스 및 스트렙토코커스 수이스로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 4종의 미생물종, 보다 바람직하게는 최소 10종, 보다 더 바람직하게는 최소 15종, 가장 바람직하게는 22종 모두이다.
예를 들어, 스트렙토코커스 속 박테리아 22종 모두를 패혈증-유발 스트렙토코커스 속 박테리아로 분류하는 멀티플렉스 증폭에서 총 22개의 프라이머쌍이 이용될 수 있으며, 이 경우 총 22개의 프라이머쌍은 서로 다른 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있으나, 이로부터 나오는 증폭산물은 동일 크기를 갖도록 디자인된다. 또한, 이용되는 프라이머쌍의 개수를 줄이기 위하여 스트렙토코커스 속 박테리아에 서 공통적으로 발견되는 보존성 서열(바람직하게는, tuf 서열)에 혼성화 되는 프라이머쌍을 제작할 수 있다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 스트렙토코커스 속 박테리아 22종 모두를 패혈증-유발 스트렙토코커스 속 박테리아로 분류하기 위하여, 전방향 프라이머 총 3개 및 역방향 프라이머 총 5개를 이용하고 있다.
패혈증-유발 스트렙토코커스 속 박테리아의 분류에 이용되는 가장 바람직한 프라이머가 서열목록 제54서열 내지 제61서열에 예시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 패혈증-유발 그람 음성 박테리아로 분류될 수 있는 미생물은 E. coli, 프로테우스 미라빌리스, 슈모모나스 에어루기노사, 아시네토박터 바우마니, 스테노트로포모나스 말토필리아, 클렙시엘라 뉴모니애, 클렙시엘라 옥시토카, 세라티아 마르세스센스, 엔테로박터 클로아카이 및 엔테로박터 에어로게네스로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 4종의 미생물종, 보다 바람직하게는 최소 6종, 보다 더 바람직하게는 최소 8종, 가장 바람직하게는 10종 모두이다.
예를 들어, 그람 음성 박테리아 22종 모두를 패혈증-유발 그람 음성 박테리아로 분류하는 멀티플렉스 증폭에서 총 10개의 프라이머쌍이 이용될 수 있으며, 이 경우 총 10개의 프라이머쌍은 서로 다른 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있으나, 이로부터 나오는 증폭산물은 동일 크기를 갖도록 디자인된다. 또한, 이용되는 프라이머쌍의 개수를 줄이기 위하여 그람 음성 박테리아에서 공통적으로 발견되는 보존성 서열에 혼성화 되는 프라이머쌍을 제작할 수 있다.
패혈증-유발 그람 음성 박테리아의 분류에 이용되는 가장 바람직한 프라이머 가 서열목록 제34서열 내지 제53서열에 예시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 의해 분류되는 패혈증-유발 미생물 미생물군은 항생제 내성 미생물군을 추가적으로 포함한다. 보다 바람직하게는, 항생제 내성 미생물군의 분류는 blaSHV, mecA, vanA 및 vanB 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 항생제 내성 유전자에 혼성화 되는 최소 2개의 미생물군 분류용 프라이머쌍을 이용하여 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 패혈증 유발 미생물종을 동정하는 단계 (e)는 최소 5종의 미생물종의 핵산분자와 혼성화 되는 최소 5개의 미생물종 동정용 프라이머쌍을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 최소 6종의 미생물종의 핵산분자와 혼성화 되는 최소 6개의 미생물종 동정용 프라이머쌍, 가장 바람직하게는 최소 7종의 미생물종의 핵산분자와 혼성화 되는 최소 7개의 미생물종 동정용 프라이머쌍을 이용하여 실시된다.
가장 바람직하게는, 패혈증-유발 미생물종을 동정하기 위한 프라이머의 서열은 서열목록 제62서열 내지 제115서열에 예시되어 있다.
가장 바람직하게는, 항생제 내성 유전자를 동정하기 위한 프라이머의 서열은 서열목록 제116서열 내지 제123서열에 예시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분류 및/또는 동정을 하기 위한 멀티플랙스 증폭 과정에서 분류용 프라이머 및 동정용 프라이머 이외에 내부 대조군(internal control)을 생성하기 위한 프라이머 한 쌍을 추가적으로 이용하여 실시된다. 이러한 내부 대조군은 증폭 반응 자체가 제대로 이루어졌는지를 체크할 수 있도록 한다. 예를 들어, 하기의 실시예에 예시된 바와 같이, 인간의 하우스키핑 유전자인 MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자를 내부 대조군으로 사용할 수 있다. MTHFR 유전자 이외에, GAPDH(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) 유전자, β-액틴 유전자, PGK1(phosphoglycerate kinase 1) 유전자, β-글로빈 유전자 또는 28S RNA 유전자 등이 하우스키핑 유전자로 이용될 수 있다. MTHFR 유전자를 증폭하기 위한 프라이머는 서열목록 제124서열 및 제125서열에 예시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 미생물군 분류용 프라이머(primers for classifying microbe groups), 미생물종 동정용 프라이머(primers for identifying microbe species) 또는 이 둘 모두는 다음의 일반식 I로 표시된다:
5'-Xp-Yq-Zr-3' (I)
상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 5'-제1차 프라이밍 부위(5'-first priming portion)이고, Yq는 최소 3개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3'-제2차 프라이밍 부위 (3'-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5'-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3'-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼 성화 특이성 측면에서 5'-제1차 프라이밍 부위가 3'-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 프라이머 전체 구조의 혼성화 특이성이 5'-제1차 프라이밍 부위와 3'-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 프라이머 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
본 발명의 미생물군 분류용 프라이머 및 미생물종 동정용 프라이머가 가지는 기본적인 구조는 본 발명자에 의해 최초로 제안되는 것이고(참조: WO 2006/095981), 이중 프라이밍(dual priming) 구조라 명명할 수 있고, 이러한 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드는 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(dual priming oligonucleotide: DPO)라 명명된다. DPO는 본 발명자에 의하여 개발된 신 개념의 올리고뉴클레오타이드로서, 분할 구역에 의해 분리된 5'-제1차 프라이밍 부위과 3'-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미 다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는, 디옥시이노신, 이노신, 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역은 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드를 포함한다.
바람직하게는, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위의 길이는 3'-제2차 프라이밍 부위보다 길다. 상기 5'-제1차 프라이밍 부위은 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 상기 3'-제2차 프라이밍 부위은 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 상기 분할 구역은 3-10 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위은 40-80℃의 Tm을 갖는다. 바람직하게는, 상기 3'-제2차 프라이밍 부위은 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.
DPO 형태로 디자인한 패혈증 유발 미생물의 분류 및 동정용 프라이머는, 위 음성, 위양성 및 배경 산물(backgrounds)의 문제 없이 60종이 넘는 패혈증 유발 미생물을 멀티플랙스 증폭 방식으로 분류 및 동정할 수 있도록 한다.
본 발명에서 이용되는 프라이머는 서열목록 제1서열부터 제123서열까지 뿐만 아니라 상기 서열과 상보적인 서열 및 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 본 명세서에서 용어 “실질적으로 동일한 서열”은 프라이머가 상기한 DPO의 구조를 가지면서 타깃 서열에 특이적으로 혼성화되는 능력을 보유하는 범위 내에서, 서열목록 제1서열부터 제123서열에 기재된 서열의 일부 염기가 결실, 부가 및/또는 치환된 서열을 의미한다. 이러한 실질적으로 동일한 서열이 본 발명의 청구범위에 속한다는 것은 균등론의 원칙 하에 명확하게 인식된다.
본 발명에 있어서, 용어 “타깃 서열(target sequence)”은 주어진 혼성화 조건 하에서 사용되는 프라이머와 혼성화되는 것이 소망되는 서열을 의미한다.
예를 들어, 프라이머의 서열과 완벽하게 일치하는 서열에만 혼성화시키는 것을 소망하여, 고엄격조건 하에서 혼성화를 실시하는 경우, 프라이머의 서열과 완벽하게 일치하는 서열은 “타깃 서열”이 되지만, 프라이머 또는 프로브의 서열과 하나의 염기라도 다른 서열은 “비-타깃 서열” 또는 “비-특이적 서열”이 된다. 그리고, 비-타깃 서열과 혼성화의 결과로 얻어지는 산물은 “비-타깃 산물” 또는 “비-특이적 산물”이 된다.
한편, 프라이머의 서열과 완벽하게 일치하는 서열뿐만 아니라 일부 미스매치가 있는 서열에도 혼성화시키는 것을 소망하여, 낮은 엄격조건 하에서 혼성화를 실시하는 경우, 프라이머의 서열과 완벽하게 일치하지 않더라도 주어진 조건에서 사 용되는 프라이머와 혼성화되는 것이 소망되는 서열은 “타깃 서열”이 되지만, 그 이외의 서열은 “비 타깃-서열”이 된다.
본 명세서에서 용어 “프라이머”는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이 오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
본 발명에서 이용되는 프라이머는 패혈증 유발 미생물의 핵산에 매우 높은 특이성으로 혼성화되어 패혈증 유발 미생물종의 분류 및 동정을 하는 데 매우 유용하다.
본 발명에서 상기 프라이머를 생물학적 시료로부터 수득한 핵산 분자와 혼성화시켜 증폭하는 과정은 통상의 증폭 방법에 따라 실시될 수 있다.
본 발명에서 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼성화 온도는 50℃ 내지 70℃이고 보 다 바람직하게는 55℃ 내지 68℃이고, 가장 바람직하게는 60℃ 내지 63℃이다.
패혈증 유발 미생물의 핵산 서열을 증폭하는 본 발명의 방법은 당업계에 공지된 다양한 프라이머-관련 핵산 증폭 방법들에 따라 실시될 수 있다.
핵산 서열을 증폭하기 위한 본 발명의 방법은 소망하는 어떠한 박과 식물의 종자감염 바이러스의 핵산 분자의 증폭에도 이용될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다. 상기 핵산 분자는 이중쇄 또는 단일쇄일 수 있고, 바람직하게는 이중쇄이다. 출발물질로서 핵산이 이중쇄인 경우, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
RNA가 출발물질로 이용되는 경우, 역전사 단계가 증폭 전에 필요로 하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res . 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계는 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소에 의해 이루어질 수 있다. RNase H 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 반응조건을 주의하여 선택하면 개별적인 RNase H 절단 과정을 피할 수 있다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼 합물에 제공하는 것이 소망된다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건(즉, 분할 구역이 타깃 서열에 수소결합을 할 수 없는 조건) 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 바람직하게는, 어닐링 온도는 50℃ 내지 70℃이고 보다 바람직하게는 55℃ 내지 68℃이고, 가장 바람직하게는 60℃ 내지 63℃이다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 멀티플랙스 증폭 과정은 멀티플랙스 PCR 방법에 따라 실시되며, 이는 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 상세히 설명되어 있다.
멀티플렉스 PCR은 PCR의 다른 변형 형태로서, 동일한 반응물에서 둘 이상의 프라이머쌍을 이용하여 하나 이상의 타깃 서열을 동시에 증폭할 수 있다. 그러나, 멀티플렉스 PCR로부터 얻은 결과는, 증폭 과정의 인위적 요소 때문에 종종 복잡하게 나오며, 이러한 오류의 결과는 반응 실패에 의한 위음 결과 그리고 위양 결과를 포함한다. 따라서 이러한 오류를 줄이기 위하여 멀티플렉스 PCR 반응 조건 을 최적화하는 데 인력과 시간을 많이 소비하지만, 만족할만한 결과를 얻기는 극히 힘들다. 본 발명의 방법은 이러한 종래의 멀티플렉스 PCR의 문제점을 극복하여, 하나의 PCR 반응 세트에서 다양한 종류의 패혈증 유발 미생물을 오류 없이 증폭하고 분류 및 동정할 수 있다.
증폭 반응 이후, 증폭산물의 크기를 분석하여 생물학적 시료에 포함된 패혈증-유발 미생물의 분류 및 검출을 동시에 할 수 있다. 본 발명의 분류 방법에 이용되는 프라이머는 소정(predetermined)의 크기를 갖는 증폭산물을 생성하도록 디자인 된 것이다. 따라서 증폭산물의 크기를 분석함으로써 생물학적 시료에 있는 패혈증-유발 미생물의 분류를 할 수 있고 동시에 검출하게 된다.
한편, 본 발명의 동정 방법에 따르면 증폭 반응 이후, 증폭산물의 크기를 분석하여 생물학적 시료에 포함된 패혈증-유발 미생물의 종을 동정한다. 본 발명의 동정에 이용되는 프라이머는 소정의 크기를 갖는 증폭산물을 생성하도록 디자인 된 것이다. 따라서 증폭산물의 크기를 분석함으로써 생물학적 시료에 있는 패혈증-유발 미생물의 종을 정확하게 규명할 수 있다.
소정의 크기를 갖는 증폭 산물의 형성 여부를 확인하는 것은, 전기영동 예컨대, 아가로스 젤 전기영동을 통해 쉽게 실시할 수 있다. 또는, 증폭산물의 확인은 테이프 방식의 전기영동으로 확인할 수 있으며, 이는 WO 2003/045557 및 WO 2006/085071, 그리고 Buck AH, et al., J. Virol . 81(24):13761-70(2007)에 개시되어 있으며, LAB901 Ltd.에서 ScreenTapeTM으로 상업적으로 구입 가능하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제61서열로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 프라이머를 포함하는 패혈증-유발 미생물의 분류용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제62서열 내지 제115서열로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 프라이머를 포함하는 패혈증-유발 미생물종의 동정용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 반응에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자 및 디옥시리보뉴클레오타이드-5'-트리포스페이트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사 효소, 다양한 완충액 및 시약, DNA 중합효소의 활성을 억제하는 저해제를 포함할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적양은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 컴파트먼트에 상술한 성분들을 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 다양한 패혈증 유발 미생물을 멀티플랙스 증폭 방식으로 동 시에 분류 및 동정할 수 있다.
(ⅱ) 본 발명에 따르면, 패혈증 유발 미생물을 고속으로 보다 간편한 방식으로 분류 및 동정할 수 있다.
(ⅲ) 본 발명에 따르면, 60 여종이 넘은 패혈증 유발 미생물을 분류 및 동정할 수 있다.
(ⅳ) 본 발명에 따르면, 위음성 및 위양성과 같은 오류 데이터 없이 멀피플랙스 증폭 방식으로 패혈증 유발 미생물을 고속으로 분류 및 동정할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 I: 패혈증-유발 미생물의 분류 검출용 프라이머 디자인 및 제조
본 발명의 기본적인 전략에 따라 분석 대상의 시료에 존재하는 패혈증-유발감염 미생물 총 60종을 멀티플렉스 PCR 방식으로 균류(fungi), 엔테로코커스(Enterococcus spp), 그람 음성 박테리아, 스타필로코커스 및 스트렙토코커스로 분류 검출할 수 있는 프라이머를 디자인 하였다. 이러한 분류(classifying)는 증폭산물의 크기의 차이에 의해 된다.
I-1: 균류의 분류 검출용 프라이머 디자인 및 제조
균류에 속하는 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파라프실로시스, 칸디다 글라브라타, 칸디다 크루세이 및 아스퍼길루스 퍼미게터스 등 총 6종의 미생물을 균류로 분류할 수 있는 프라이머는 580 bp의 증폭산물이 생성되도록 디자인 하였다.
칸디다 알비칸스 핵산 증폭용 프라이머
칸디다 알비칸스의 phr1 유전자 서열에서 발굴된 서열 중 DSO(dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 580 bp의 증폭산물이 나오도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CA-F AGCCAAGTTTGAATCGTCCACCIIIIIAGTTGAAGTT
CA-R TTCGTCATCATTGGATGAATAACCIIIIIGAATTTGTCT
칸디다 트로피칼리스 핵산 증폭용 프라이머
칸디다 트로피칼리스의 erg11 유전자에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 580 bp의 증폭산물이 나오도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CTr-F GATACTGCCATTGATGGCATCIIIIITTTCTTATCC
CTr-R AAATAGTGATTTCTGGTTGAGIIIIIATAACACTAG
칸디다 파라프실로시스 핵산 증폭용 프라이머
칸디다 파라프실로시스의 met2에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 580 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CPa-F CAAATCAACAGTTGTGCTGTIIIIIAAGATCCAAG
CPa-R CTTGTAAAGAGTCCAAGATCIIIIITTGTATACCC
칸디다 글라브라타 핵산 증폭용 프라이머
칸디다 글라브라타의 ssk2에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 580 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CG-F CCACTTCTAAAGAACACCAGIIIIICAATTCGGAT
CG-R GAGGCCCTTCGACTAGACCTIIIIIATGTGCTAGT
칸디다 크루세이 핵산 증폭용 프라이머
칸디다 크루세이의 sdh1 유전자에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 580 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CKr-F ATTATATGACCAGAGAAGCTCIIIIITCGATTATCG
CKr-R TGTGGAGCATATCTTTCCATAIIIIITTCACCTTCA
아스퍼길루스 퍼미게터스 핵산 증폭용 프라이머
아스퍼길러스 퍼미게터스의 tyr1 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 580 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
AF-F ACCATACATGCTCCTGTTTGIIIIIAGTCATTTGA
AF-R GTTTGGCCGGTACCATGGATIIIIITTCAAGGCTA
I-2: 스타필로코커스의 분류 검출용 프라이머 디자인 및 제조
패혈증을 유발하는 그람 양성 박테리아인 스타필로코커스에 속하는 총 18종 의 미생물, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus haemolyticus , Staphylococcus pasteuri , Staphylococcus warneri , Staphylococcus cohnii subsp . urealyticu , Staphylococcus hominis subsp . hominis , Staphylococcus caprae , Staphylococcus xylosus , Staphylococcus equorum , Staphylococcus simulans , Staphylococcus arlettae , Staphylococcus kloosii, Staphylococcus gallinarum , Staphylococcus auricularis , Staphylococcus chromognenes , Staphylococcus delphini , Staphylococcus intermedius을 스타필로코커스 속으로 분류할 수 있는 프라이머는 458 bp의 증폭산물이 생성되도록 디자인 하였다.
스타필로코커스의 gap 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO(dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 458 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 또한, 사용되는 프라이머의 개수를 줄이기 위하여, 스타필로코커스의 gap 서열에서 보존성 서열을 이용하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Staphyl-F1 TGCAAAAGTTTTAAGTGACGAAIIIIITTTAGTTGA
Staphyl-F2 TGCTAAAGTATTAAATGACGAAIIIIITTTAGTTGA
Staphyl-F3 TGCTAAAGTTTTAAATGATGAGIIIIITTTAGTTGA
Staphyl-F4 TGCTAAAGTATTAAACGATGACIIIIITTTAGTTGA
Staphyl-F5 TGCTAAAGTTTTAAATGATGAAIIIIITTTAGTTGA
Staphyl-F6 TGCTAAAGTTTTAAATGGTGACIIIIICTTAATCGA
Staphyl-F7 TGCTAAAGTACTTAACGATGAAIIIIITTTAGTAGA
Staphyl-F8 AGCAAAAACTTTAAATGATGAAIIIIITTTAGTTGA
Staphyl-F9 AGCGAAAACATTACACGATGAAIIIIITATTGTTGA
Staphyl-F10 TGCAAAAACTTTACACGACGAAIIIIITATTGTTGA
Staphyl-F11 TGCAAAAACTTTACAAGACAACIIIIITATCGTTGA
Staphyl-R1 GACATTTCGTTATCATACCTTGCIIIIICTTTAACTAA
Staphyl-R2 CCCCACTCTTTGTCGTACCTTGCIIIIICTTTAACTAA
Staphyl-R3 GACATTTCGTTATCATACCTTGCIIIIICTTTAACCAT
Staphyl-R4 GACATTTCGTTATCATACCTTGCIIIIICTTTGATTAA
Staphyl-R5 CCCCATTCTTTGTCGTACCTTGCIIIIICTTTAACTAA
Staphyl-R6 GACATTTCGTTATCATACCTTGCIIIIITTTTAACTAA
I-3: 엔테로코커스의 분류 검출용 프라이머 디자인 및 제조
엔테로코커스에 속하는 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis , Enterococcus avium , 및 Enterococcus durans 등 총 4종의 미생물을 엔테로코커스 속으로 분류할 수 있는 프라이머는 350 bp의 증폭산물이 생성되도록 디자인 하였다. 하기의 2종의 프라이머 세트를 이용하면 Enterococcus avium 및 Enterococcus durans의 ddl 서열도 증폭된다.
엔테로코커스 페에시움 핵산 증폭용 프라이머
엔테로코커스 페에시움의 ddl 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 350 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Efci-F CTGAACGATTTAGAATACAGIIIIICAATCTTTTG
Efci-R TTCCATCTTCCCCGTTTGGCIIIIITAAAACTGGA
엔테로코커스 페칼리스 핵산 증폭용 프라이머
엔테로코커스 페칼리스의 ddl 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 350 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Efca-F CGGAAGAAGAAAATCCAGATGIIIIIGAAACGTTAG
Efca-R TTGGGAAGTTCTCGTTGCCCIIIIICTTCATTTAA
I-4: 그람 음성 박테리아의 분류 검출용 프라이머 디자인 및 제조
패혈증을 유발하는 그람 음성 박테리아인 E. coli, Proteus mirabilis , Pseudomonas aerugionsa , Acinetobacter baumannii , Stenotrophomonas maltophilia , Klebsiella pneumoniae , Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens , Enterobacter cloacae , Enterobacter aerogenes 등 총 10 종의 미생물을 그람 음성 박테리아로 분류할 수 있는 프라이머는 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 디자인 하였다.
E. coli 핵산 증폭용 프라이머
E. coli의 lamB 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
EC-F GATGATTACTCTGCGCAAACIIIIICTGGCGGTTG
EC-R CAGCATAAGTTTCACATTCGIIIIIAAGACGGTAT
아시네토박터 바우마니 핵산 증폭용 프라이머
아시네코박터 바우마니의 trpE 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Aba-F GATTGAGCGCTATTCACATGTIIIIIATATTGTTTC
Aba-R AATAACCAACAGCCCCGCCAIIIIITCCTCTTTTC
스테노트로포모나스 말토필리아 핵산 증폭용 프라이머
스테노트로포모나스 말토필리아의 ITS 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Sma-F GTACCTGCATTCAGAGAATCIIIIIGGCCAGGCCG
Sma-R AGTGCTTTTTCAAAAAGTACGCIIIIIGATGTGCGG
슈도모나스 에어루기노사 핵산 증폭용 프라이머
슈도모나스 에어루기노사의 oprL 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Pae-F GTCGAGCTGAAGAAGTAAGAIIIIITTATGCCCAA
Pae-R GTTGTCACCCCACCTCCGGTIIIIICGCCGCCG
프로테우스 미라빌리스 핵산 증폭용 프라이머
프로테우스 미라빌리스의 ureR 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Pmi-F GTCACCACTAATCTCACGTTGAIIIIICCTAAATATA
Pmi--R GATAGATGATAATCTGGAAGATGIIIIITAATCGGCGC
세라티아 마르세스센스 핵산 증폭용 프라이머
세라티아 마르세스센스의 gyrB 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Smar-F TTAACGCCCTGTCGGAGAAAIIIIIGCTGGTGATC
Smar-R CTTGGCCAGAATGTCGTACTIIIIITCGGTCACAT
엔테로박터 에어로게네스 핵산 증폭용 프라이머
엔테로박터 에어로게네스의 ompX 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Eae-F GCCGTTGTTCTGGCTGCATCIIIIIGTACTACTGC
Eae-R TTGCTGGTGTTGTCTTTTTCGGIIIIIGTGAAGGAAC
엔테로박터 클로아카이 핵산 증폭용 프라이머
엔테로박터 클로아카이의 ompX 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Ecl-F ACGGACTTACTTGAAGCACAIIIIIGGTGGTTATG
Ecl-R GTCTTGCTCGTAACGGTACTIIIIITTGAAACCGT
클렙시엘라 옥시토카 핵산 증폭용 프라이머
클렙시엘라 옥시토카의 mdh 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Kox-F GGATATTATCCGCTCGAATAIIIIIGTGGCGGAAC
Kox-R CTTCAACGACTTCAGTACCGIIIIITTGAATACGT
클렙시엘라 뉴모니애 핵산 증폭용 프라이머
클렙시엘라 뉴모니애의 lamb 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 200 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Kpn-F CTAACGTTGCCTATTCCGTGIIIIIGGAAGATGAC
Kpn-R ACCTGCACCCGGGCCGGAGAIIIIICAGTAGTAGA
I-5: 스트렙토코커스의 분류 검출용 프라이머 디자인 및 제조
패혈증을 유발하는 스트렙토코커스인 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 아갈락티에, 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 안기노서스, 스트렙토코커스 고르도나이, 스트렙토코커스 인터메디우스, 스트 렙토코커스 오랄리스, 스트렙토코커스 파라산구이니스, 스트렙토코커스 베스티불라리스, 스트렙토코커스 알락토리티쿠스, 스트렙토코커스 크리세티, 스트렙토코커스 다운에이, 스트렙토코커스 페루스, 스트렙토코커스 갈리나세우스, 스트렙토코커스 하이오인테스티날리스, 스트렙토코커스 루테티엔시스, 스트렙토코커스 마카새, 스트렙토코커스 파라우베리스, 스트렙토코커스 소브리너스, 스트렙토코커스 수이스 등 총 22 종의 미생물을 스트렙토코커스 속으로 분류할 수 있는 프라이머는 145 bp의 증폭산물이 생성되도록 디자인 하였다.
스트렙토코커스의 tuf 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 145 bp의 증폭산물이 생성되도록 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Str-F1 CGTGAACACATTCTTCTTTCACIIIIIGTTGGTGTTA
Str-F2 CGTGAACATATCCTTCTTTCACIIIIIGTTGGTGTTA
Str-F3 CGTGAACACATCTTGCTTTCACIIIIIGTTGGTGTTA
Str-R1 CTGGGAAATCATATTCTGAAAGIIIIICACGGATTTC
Str-R2 CTGGGAAGTCATATTCTGACAAIIIIICACGGATTTC
Str-R3 CTGGGAAGTCATATTCTGTAAGIIIIICACGGATTTC
Str-R4 CTGGGAAGTCATATTCTGAAAGIIIIICACGGATTTC
Str-R5 CTGGGAAGTCATATTCTGAAAGIIIIICACGAATTTC
실시예 Ⅱ: 패혈증-유발 미생물의 동정용 프라이머 디자인 및 제조
칸디다 알비칸스 동정용 프라이머
칸디다 알비칸스 의 phr1 유전자 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CAl-phr1-F1 AGGTTACAAGGACAGAACTGIIIIIATCAAGAACT
CAl-phr1-R1 GCTATTGATTGAAGCACTGCIIIIIAAATCACAAG
칸디다 트로피칼리스 동정용 프라이머
칸디다 트로피칼리스 의 erg11 유전자에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CTr-erg11-F2 TGAGAATGCACATGCCATTGIIIIITATTTTCAGA
CTr-erg11-R2 AATAATGGGATTTTTCTAGCIIIIICATGGTGATC
칸디다 파라프실로시스 동정용 프라이머
칸디다 파라프실로시스의 met2 및 top2 에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CPa-met2-F1 GTGGGGTCGATTGAACAAACIIIIIAACAACACAT
CPa-met2-R1 CTCTGGCTGAAGTCCGTAACIIIIITACTGTTTTC
CPa-top2-F1 GACATCTTCCAATTATGACGIIIIICAAAAAAAGG
CPa-top2-R1 CCTCTCCTTGATTGCTTTAAIIIIIATTTCAACAT
Par-643F-1 GCATTTGCAGTGAGTGATGGIIIIITTAACCAAGT
Par-1061R-1 GCTTCCTACTTCCGTCAACTIIIIICAATGCCTTA
칸디다 글라브라타 동정용 프라이머
칸디다 글라브라타의 ssk2에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CG-ssk2-F1 AGCTGTACAGATGAAGTTCAIIIIIATAAGTTATT
CG-ssk2-R2 TTGTTGTAACAAGTAAGAATIIIIICTATGCACCA
칸디다 크루세이 동정용 프라이머
칸디다 크루세이의 top2 유전자에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CKr-F1 GTGGAAGAAACGGTTATGGCGIIIIICTTTGTAAC
CKr-R1 ACTTTTCCATGCCAAACTTGGIIIIITCGGGTTTG
아스퍼길루스 퍼미게터스 동정용 프라이머
아스퍼길러스 퍼미게터스의 tyr1 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
AF-F2 CTTTATGAGAGACAGGAGTGIIIIIACCTAGGAAA
AF-tyr1-R1 GAAGGTAGTGCAGCATAATCIIIIITCACGTCGAA
엔테로코커스 페에시움 동정용 프라이머
엔테로코커스 페에시움의 ddl 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Efm-F ATCGAAATGCAGATTCCAGCIIIIITGCCAGAAGA
Efm-R GATTGACGCTGATGGTATCGIIIIITTCCTAACTG
엔테로코커스 페칼리스 동정용 프라이머
엔테로코커스 페칼리스의 ace 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Efs-F AAACAAGTGAAAAGACAGACACIIIIIAAACCGTAGA
Efs-R GATTTGTAGATAACTTACACCTAAAACGGCAAATGTAC
스타필로코커스 에피더미디스 동정용 프라이머
스타필로코커스 에피더미디스의 fmhB 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Sep-F CTCGTTTAAAAGCCCACAACIIIIIATGTTCTGAA
Sep-R CTCTTCCTTGTTAAATTAGAIIIIIAGCCAGTATT
스타필로코커스 헤모라이틱쿠스 동정용 프라이머
스타필로코커스 헤모라이틱쿠스의 fmhA 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Sha-F AAACGGATACGTTCTTTGAATTIIIIIAAATGGCCGA
Sha-R AAGCGGCAGCTAGATTGAGTGTIIIIICTTCTTCAGC
스타필로코커스 아우레우스 동정용 프라이머
스타필로코커스 아우레우스의 nuc 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
SA-F GAAGTCGAGTTTGACAAAGGIIIIIGAACTGATAA
SA-R TGTCTTCGCTCCAAATATTTIIIIICTCTTTTTTC
엔테로박터 에어로게네스 동정용 프라이머
엔테로박터 에어로게네스의 ompX 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Eae-tolC-X CTGCTGAAGGAAGCGGAAAACCGCAACCIIIIICTGCTGCAGG
Eae-tolC-X CGTGTTGTTCAGCGCGATCAGATCCTGCIIIIICAGCGTGCCG
세라티아 마르세스센스 동정용 프라이머
세라티아 마르세스센스의 chiC 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Smar-chiC-X CTTTATTGCGCCGCAATATTACAACIIIIICGGCGACGGT
Smar-chiC-X CAGTTTCAGCGAGGTGGCGCCCAGCIIIIIGACCGTCAGC
클렙시엘라 뉴모니애 동정용 프라이머
클렙시엘라 뉴모니애의 lamB 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Kpn-lamB-X TCTCTCTGGCGGCTACCCGTAIIIIIGAAAGCGGCG
Kpn-lamB-X GTTGTTATCGATGCTGGTCCCCTGAGIIIIICCGCTGTTCC
엔테로박터 클로아카이 동정용 프라이머
엔테로박터 클로아카이의 ompX 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Eclo-ompX-X GTTTCAACCTTAAGTACCGTTAIIIIIAAGATAACAA
Eclo-ompX-X GATCGGGTTGAACTGCATACCAGIIIIITAAGAGAAAC
클렙시엘라 옥시토카 동정용 프라이머
클렙시엘라 옥시토카의 mdh 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Kox-mdh-X AATACCACCGTGGCGATTGCIIIIIAAGTGCTGAA
Kox-mdh-X TGTGATAATAAAGGAAGAATAGTTAIIIIICGCCTGAGTG
슈도모나스 에어루기노사 동정용 프라이머
슈도모나스 에어루기노사의 algD 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Paeru-F TATTTCGCGAGCGGGACAAACGIIIIIAACTTCCCTC
Paeru-R AGTCCAGCACAGCCTTCTTGIIIIIGGTGGTGCC
E. coli 동정용 프라이머
E. coli의 lamB 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Ecol-F TCGACTGCATAAGGAGCCGGIIIIITAAGCACCCC
Ecol-R GGTAGAAGCGCTTACCTGIIIIIATGGTGGAGC
프로테우스 미라빌리스 동정용 프라이머
프로테우스 미라빌리스의 ureR 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Pmir-F TTGCTGGCGGTTTATCACGAAGIIIIIGATATTCTTA
Pmir-R TATTTACGTTTAAATGCGTCIIIIIAATAAGCATT
스테노트로포모나스 말토필리아 동정용 프라이머
스테노트로포모나스 말토필리아의 ITS 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Smal-F TGAGCAAAGACAGCATCGTCIIIIIGGGCGTCTTC
Smal-R TTCGAAAGGGACTTCGGTATACIIIIIGAACATGGTG
아시네토박터 바우마니 동정용 프라이머
아시네코박터 바우마니의 trpE 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Abau-F CGCGTGTACGTAATACTGGTGAIIIIICACGTCCTAA
Abau-R TAAACGTGACTTATCGTATTGIIIIICTTCCACCAC
스트렙토코커스 뉴모니애 동정용 프라이머
스트렙토코커스 뉴모니애의 ply 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Spne-F GATACTGTAACGGTAGAGGAIIIIIAACAGAGAGG
Spne-R GTTTTTTCATAAACCGTACGCIIIIITTCCCAGGCA
스트렙토코커스 피오게네스 동정용 프라이머
스트렙토코커스 피오게네스의 rpoB 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Spyo-F CGATTAAACAAGTTTGTGGTGIIIIICTCACTAGGC
Spyo-R ACCATCTCAATAAAGCAAGACTIIIIIAATGAACATAC
스트렙토코커스 미티스 동정용 프라이머
스트렙토코커스 미티스의 gyrB 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Smit-F ATGGTGAAATGGATGATATCAIIIIIGAAGTAGCCATG
Smit-R GGAAATCAGAAAAGGCATCACTIIIIIGGCGATTGGT
스트렙토코커스 아갈락티에 동정용 프라이머
스트렙토코커스 아갈락티에 의 cfa 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Saga-F TTATTCGCATTTTAGATCCATTIIIIICAGTTGATTC
Saga-R TGTGATTGCTTTATTTAAAGTIIIIIAAACTTTAAATTC
실시예 Ⅲ: 항생제 내성 유전자 동정용 프라이머의 디자인 및 제작
항생제 내성 유전자 blaSHV 동정용 프라이머
blaSHV 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
blaSHV-F GCAGATAAAATTATAACCACIIIIIAAATCAGCAA
blaSHV-R GGGTAGTGGTGTCGCGGGCGIIIIIGGGAAGCGCC
항생제 내성 유전자 mecA 동정용 프라이머
mecA 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
mecA-F GCGATAATGGTGAAGTAGAAIIIIITGAACGTCCG
mecA-R TAACTGGAACGAAGGTATCATCIIIIICCCAATTTTG
항생제 내성 유전자 vanA 동정용 프라이머
vanA 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
vanA-F CCATGTTGATGTAGCATTTTCIIIIITGCATGGCAA
vanA-R CCTGCTCAATTAAGATTTTTGIIIIIATATTGTCTT
항생제 내성 유전자 vanB 동정용 프라이머
vanB 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다.
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
vanB-F GCTATGCAAGAAGCCATGTIIIIIATGGGAAGCC
vnaB-R AGGCCAGTGATTTGTCCATGIIIIITGCGGAGCTT
실시예 Ⅳ: 병원체 시료의 준비
NucleoSpin Blood Prep kit (MACHEREY-NAGEL)을 사용하여 환자의 혈액 2 ml로부터 200 ㎕ DNA를 얻었다.
실시예 Ⅴ: 내부 대조군 ( internal control )
MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자를 내부 대조군으로 사용하였다. MTHFR 유전자의 증폭에 사용하는 프라이머 서열은 다음과 같으며, 증폭 산물의 크기는 904 bp이다.
명칭 서열(5'->3')
MT-F TCTCCTCTCAGGTCCAGAACIIIIICAGCGTTGCT
MT-R GCCACTGGCCAGAAGCTCCTIIIIIAGGCTCACGG
실시예 Ⅵ: 패혈증-유발 미생물의 분류용 멀티플렉스 PCR
우선, 환자 혈액에 있는 패혈증-유발 미생물을 분류 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR을 실시하였다. 상기 실시예에서 제조된 프라이머 중에서 다음과 같이 프라이머 세트 I 및 Ⅱ를 준비하였다. 그리고 실시예에서 얻은 환자의 병원체 DNA 시료를 사용하여 멀티플렉스 PCR를 수행하였다(각 프라이머 세트는 실시예 V의 내부 대조군 증폭용 프라이머를 포함한다).
프라이머 세트 I
병원체 분류 프라이머 쌍 PCR 산물 크기( bp )
균류 Candida albicans CA-F/CA-R 580
Candida tropicalis CTr-F/CTr-R
Candida parapsilosis CPa-F/CPa-R
Candida glabrata CG-F/CG-R
Candida krusei CKr-F/CKr-R
Aspergillus fumigatus AF-F/AF-R
Staphylococcus 속 (Staphyl-F1/Staphyl-F2/Staphyl-F3/Staphyl-F4/Staphyl-F5/Staphyl-F6/Staphyl-F7/Staphyl-F8/Staphyl-F9/Staphyl-F10/Staphyl-F11)/(Staphyl-R1/Staphyl-R2/Staphyl-R3/Staphyl-R4/Staphyl-R5/Staphyl-R6) 458
Enterococcus 속 E. faecium Efci-F/Efci-R 350
E. faecalis Efca-F/Efca-R
프라이머 세트 Ⅱ
병원체 분류 프라이머 쌍 PCR 산물 크기(bp)
그람 음성 박테리아 E. coli EC-F/EC-R 200
Acinetobacter baumannii Aba-F/Aba-R
Stenotrophomonas maltophilia Sma-F/Sma-R
Pseudomonas aeruginosa Pae-F/Pae-R
Proteus mirabilis Pmi-F/Pmi-R
Serratia marcescens Smar-F/Smar-R
Enterobacter aerogenes Eae-F/Eae-R
Enterobacter cloacae Ecl-F/Ecl-R
Klebsiella oxytoca Kox-F/Kox-R
Klebsiella pneumoniae Kpn-F/Kpn-R
Streptococcus 속 (Str-F1/Str-F2/Str-F3)/(Str-R1/Str-R2/Str-R3/Str-R4/Str-R5) 145
DNA 시료, dNTP, MgCl2 및 Taq 중합효소를 함유하는 25 ㎕의 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN) 반응 완충액, 10 ㎕의 프라이머 세트 (I-Ⅱ)를 포함하는 최종 50 ㎕의 반응혼합물을 사용하여 멀티플렉스 PCR을 실시하였다. 반응혼합물을 포함하는 튜브를 전가열 (95℃) 된 온도 사이클러 (thermal cycler)에 넣고, 95℃ 15분에서 변성반응시킨 후, 94℃ 30초, 63℃ 1.5분 및 72℃ 1.5분의 40 사이클 처리하고 이어 72℃에서 10분 반응시켰다. PCR 산물은 Screentape System(Lab901)에서 최종 확인하였다.
도 1 및 도 2는 환자로부터 얻은 병원체 시료에 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 실시한 패혈증-유발 미생물의 분류용 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 환자 1, 2 및 5번에 감염된 미생물은 Staphylococcus 속에 박테리아라는 분류를 할 수 있었다. 또한, 도 2에서 볼 수 있듯이, 환자 1, 4 및 5에 감염된 미생물은 그람 음성 박테리아라는 분류를 할 수 있었다.
실험 결과, 본 발명에 따르는 경우에는 멀티플렉스 PCR의 조건에서도 위-양성 오류 없이 환자의 시료로부터 패혈증 유발 병원체의 분류를 정확히 할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 Ⅶ: 패혈증-유발 미생물의 동정용 멀티플렉스 PCR
상기 실시예 Ⅵ에서 분류된 환자의 패혈증-유발 미생물을 동정하기 위하여, 프라이머 세트 Ⅲ-Ⅷ을 이용하여 멀티플렉스 PCR를 수행하였다(각 프라이머 세트는 실시예 V의 내부 대조군 증폭용 프라이머를 포함한다).
프라이머 세트 Ⅲ
병원체 프라이머 쌍 PCR 산물 크기( bp )
Candida albicans CAl-phr1-F1/CAl-phr1-R1 649
Candida tropicalis CTr-erg11-F2/CTr-erg11-R2 513
Candida parapsilosis CPa-met2-F1/CPa-met2-R1 410
CPa-top2-F1/CPa-top2-R1
Par-643F-1/Par-1061R-1
Candida glabrata CG-ssk2-F1/CG-ssk2-R2 313
Candida krusei CKr-F1/CKr-R1 216
Aspergillus fumigatus AF-F2/AF-tyr1-R1 152
프라이머 세트 Ⅳ
병원체 프라이머 쌍 PCR 산물 크기(bp)
Enterococcus faecalis Efs-F/Efs-R 650
Staphylococcus epidermidis Sep-F/Sep-R 430
Staphylococcus haemolyticus Sha-F/Sha-R 351
Enterococcus faecium Efm-F/Efm-R 281
Staphylococcus aureus SA-F/SA-R 214
프라이머 세트 Ⅴ
병원체 프라이머 쌍 PCR 산물 크기( bp )
Enterobacter aerogenes Eae-tolC-F/Eae-tolC-R 603
Serratia marcescens Smar-chiC-F/Smar-chiC-R 466
Klebsiella pneumoniae Kpn-lamB-F/Kpn-lamB-R 350
Enterobacter cloacae Eclo-ompX-F/Eclo-ompX-R 284
Klebsiella oxytoca Kox-mdh-F/Kox-mdh-R 200
프라이머 세트 Ⅵ
병원체 프라이머 쌍 PCR 산물 크기(bp)
Pseudomonas aeruginosa Paeru-F/Paeru-R 655
Escherichia coli Ecol-F/Ecol-R 496
Proteus mirabilis Pmir-F/Pmir-R 335
Stenotrophomonas maltophilia Smal-F/Smal-R 200
Acinetobacter baumannii Abau-F/Abau-R 137
프라이머 세트 Ⅶ
병원체 프라이머 쌍 PCR 산물 크기( bp )
Streptococcus pneumoniae Spne-F/Spne-R 683
Streptococcus pyogenes Spyo-F/Spyo-R 445
Streptococcus mitis Smit-F/Smit-R 351
Streptococcus agalactiae Saga-F/Saga-R 239
프라이머 세트 Ⅷ
항생제 내성 타겟 유전자 프라이머 쌍 PCR 산물 크기(bp)
blaSHV blaSHV-F/blaSHV-R 643
mecA mecA-F/mecA-R 480
vanA vanA-F/vanA-R 359
vanB vanB-F/vanB-R 256
DNA 시료, dNTP, MgCl2 및 Taq 중합효소를 함유하는 25 ㎕의 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN) 반응 완충액, 10 ㎕의 프라이머 세트 (Ⅲ-Ⅷ)를 포함하는 최종 50 ㎕의 반응혼합물을 사용하여 멀티플렉스 PCR을 실시하였다. 반응혼합물을 포함하는 튜브를 전가열 (95℃) 된 온도 사이클러 (thermal cycler)에 넣고, 95℃ 15분에서 변성반응시킨 후, 94℃ 30초, 63℃ 1.5분 및 72℃ 1.5분의 40 사이클 처리하고 이어 72℃에서 10분 반응시켰다. PCR 산물은 Screentape System(Lab901)에서 최종 확인하였다.
도 3은 균류에 속하는 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파라프실로시스, 칸디다 글라브라타, 칸디다 크루세이 및 아스퍼길루스 퍼미게터스 등 총 6종의 미생물을 정확하게 동정할 수 있는 프라이머 8쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 한 결과이다. 실험 결과, 도 3에서는 어떠한 균류 밴드도 관찰되지 않았으며, 이는 도 1의 실험 결과와 일치하는 것이다.
도 4는 스타필로코커스에 속하는 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis , 및 Staphylococcus haemolyticus , 엔테로코커스에 속하는 Enterococcus faecium 및 Enterococcus faecalis 등 총 5종의 미생물을 정확하게 동정할 수 있는 프라이머 5쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 한 결과이다. 실험 결과, 도 4에서 1번 환자의 경우 Staphylococcus epidermidis에 감염이 되어 있고, 5번 환자의 경우 Enterococcus faecalis 및 Staphylococcus aureus에 감염이 되어 있음을 알 수 있다. 즉, 도 1의 실험 결과에서 1번 환자의 경우 감염 미생물이 Staphylococcus 속 미생물로 분류 되었고, 도 4의 실험 결과 이 Staphylococcus 속 미생물은 정확하게 Staphylococcus epidermidis임이 동정되었다. 또한, 도 1의 실험 결과에서 5번 환자의 경우 감염 미생물이 Staphylococcus 속 미생물로 분류 되었고, 도 4의 실험 결과 이 Staphylococcus 속 미생물은 정확하게 Staphylococcus aureus임이 동정되었다.
도 5는 그람 음성 박테리아에 속하는 Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens , Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae , Klebsiella oxytoca , 등 총 5종의 미생물을 정확하게 동정할 수 있는 프라이머 5쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 한 결과이다. 실험 결과, 도 5에서 1번 환자의 경우 Enterobacter cloacae에 감염이 되어 있음을 알 수 있다. 즉, 도 2의 실험 결과에서 1번 환자의 경우 감염 미생물이 그람 음성 박테리아로 분류 되었고, 도 5의 실험 결과 이 그람 음성 박테리아가 정확하게 Enterobacter cloacae임이 동정되었다.
도 6은 그람 음성 박테리아에 속하는 Pseudomonas aerugionsa , E. coli, Proteus mirabilis , Stenotrophomonas maltophilia , Acinetobacter baumannii 등 총 5종의 미생물을 정확하게 동정할 수 있는 프라이머 5쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 한 결과이다. 실험 결과, 도 6에서 1번 환자의 경우 Acinetobacter baumannii에 감염 되었고, 5번 환자의 경우 Pseudomonas aerugionsa에 감염 되었음을 알 수 있다. 즉, 도 2의 실험 결과에서 1번 및 5번 환자의 경우 감염 미생물이 그람 음성 박테리아로 분류 되었고, 도 6의 실험 결과 이 그람 음성 박테리아가 정확하게 각각 Acinetobacter baumannii 및 Pseudomonas aerugionsa임이 동정되었다.
도 7은 스트렙토코커스에 속하는 Streptococcus pnemoniae, Streptococcus agalactiae , Streptococcus pyrogenes , Streptococcus mitis 등 총 4종의 미생물을 정확하게 동정할 수 있는 프라이머 4쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 한 결과이다. 실험 결과, 도 7에서는 어떠한 균류 밴드도 관찰되지 않았으며, 이는 도 2의 실험 결과와 일치하는 것이다.
도 8은 항생제 내성 유전자인 blaSHV, mecA, vanA 및 vanB를 동정할 수 있는 프라이머 4쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 한 결과이다. 실험 결과, 1-3번 및 5번 환자의 병원체는 mecA 내성 유전자, 4번 환자의 병원체는 blaSHV 내성 유전자를 갖는다는 것을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 5명의 환자로부터 얻은 병원체 시료에 본 발명의 패혈증-유발 미생물군 분류용 프라이머 세트 I를 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 위쪽 패널은 SreenTapeTM의 소프트웨어로 분석된 멀티플렉스 PCR 결과를 보여주며, “+”는 증폭이 되었다는 표시이다. 아래쪽 패널은 SreenTapeTM에서 전기영동한 결과를 보여주며, 화살표 머리는 밴드가 형성된 가리킨다. 1-5: 환자 번호, N: 음성 대조군.
도 2는 5명의 환자로부터 얻은 병원체 시료에 본 발명의 패혈증-유발 미생물군 분류용 프라이머 세트 Ⅱ를 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 1-5: 환자 번호, N: 음성 대조군.
도 3은 5명의 환자로부터 얻은 병원체 시료에 본 발명의 패혈증-유발 미생물종 동정용 프라이머 세트 Ⅲ을 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 1-5: 환자 번호, N: 음성 대조군.
도 4는 5명의 환자로부터 얻은 병원체 시료에 본 발명의 패혈증-유발 미생물종 동정용 프라이머 세트 Ⅳ을 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 1-5: 환자 번호, N: 음성 대조군.
도 5는 5명의 환자로부터 얻은 병원체 시료에 본 발명의 패혈증-유발 미생물종 동정용 프라이머 세트 Ⅴ을 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 1-5: 환자 번호, N: 음성 대조군.
도 6은 5명의 환자로부터 얻은 병원체 시료에 본 발명의 패혈증-유발 미생물종 동정용 프라이머 세트 Ⅵ을 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 1-5: 환자 번호, N: 음성 대조군.
도 7은 5명의 환자로부터 얻은 병원체 시료에 본 발명의 패혈증-유발 미생물종 동정용 프라이머 세트 Ⅶ을 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 1-5: 환자 번호, N: 음성 대조군.
도 8은 5명의 환자로부터 얻은 병원체 시료에 본 발명의 항생제 내성 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트 Ⅷ을 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 1-5: 환자 번호, N: 음성 대조군.
<110> Seegene, Inc. <120> Methods for Classifying and Identifying Sepsis-Causing Microorganisms <160> 125 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-F <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 1 agccaagttt gaatcgtcca ccnnnnnagt tgaagtt 37 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-R <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n denotes deoxinosine <400> 2 ttcgtcatca ttggatgaat aaccnnnnng aatttgtct 39 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTr-F <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 3 gatactgcca ttgatggcat cnnnnntttc ttatcc 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTr-R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 4 aaatagtgat ttctggttga gnnnnnataa cactag 36 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPa-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 5 caaatcaaca gttgtgctgt nnnnnaagat ccaag 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPa-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 6 cttgtaaaga gtccaagatc nnnnnttgta taccc 35 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 7 ccacttctaa agaacaccag nnnnncaatt cggat 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 8 gaggcccttc gactagacct nnnnnatgtg ctagt 35 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKr-F <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 9 attatatgac cagagaagct cnnnnntcga ttatcg 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKr-R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 10 tgtggagcat atctttccat annnnnttca ccttca 36 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AF-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 11 accatacatg ctcctgtttg nnnnnagtca tttga 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AF-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 12 gtttggccgg taccatggat nnnnnttcaa ggcta 35 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F1 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 13 tgcaaaagtt ttaagtgacg aannnnnttt agttga 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F2 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 14 tgctaaagta ttaaatgacg aannnnnttt agttga 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F3 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 15 tgctaaagtt ttaaatgatg agnnnnnttt agttga 36 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F4 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 16 tgctaaagta ttaaacgatg acnnnnnttt agttga 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F5 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 17 tgctaaagtt ttaaatgatg aannnnnttt agttga 36 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F6 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 18 tgctaaagtt ttaaatggtg acnnnnnctt aatcga 36 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F7 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 19 tgctaaagta cttaacgatg aannnnnttt agtaga 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F8 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 20 agcaaaaact ttaaatgatg aannnnnttt agttga 36 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F9 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 21 agcgaaaaca ttacacgatg aannnnntat tgttga 36 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F10 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 22 tgcaaaaact ttacacgacg aannnnntat tgttga 36 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-F11 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 23 tgcaaaaact ttacaagaca acnnnnntat cgttga 36 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-R1 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 24 gacatttcgt tatcatacct tgcnnnnnct ttaactaa 38 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-R2 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 25 ccccactctt tgtcgtacct tgcnnnnnct ttaactaa 38 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-R3 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 26 gacatttcgt tatcatacct tgcnnnnnct ttaaccat 38 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-R4 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 27 gacatttcgt tatcatacct tgcnnnnnct ttgattaa 38 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-R5 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 28 ccccattctt tgtcgtacct tgcnnnnnct ttaactaa 38 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphyl-R6 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 29 gacatttcgt tatcatacct tgcnnnnntt ttaactaa 38 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Efci-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 30 ctgaacgatt tagaatacag nnnnncaatc ttttg 35 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Efci-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 31 ttccatcttc cccgtttggc nnnnntaaaa ctgga 35 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Efca-F <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 32 cggaagaaga aaatccagat gnnnnngaaa cgttag 36 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Efca-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 33 ttgggaagtt ctcgttgccc nnnnncttca tttaa 35 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EC-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 34 gatgattact ctgcgcaaac nnnnnctggc ggttg 35 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EC-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 35 cagcataagt ttcacattcg nnnnnaagac ggtat 35 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aba-F <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 36 gattgagcgc tattcacatg tnnnnnatat tgtttc 36 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aba-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 37 aataaccaac agccccgcca nnnnntcctc ttttc 35 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sma-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 38 gtacctgcat tcagagaatc nnnnnggcca ggccg 35 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sma-R <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 39 agtgcttttt caaaaagtac gcnnnnngat gtgcgg 36 <210> 40 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pae-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 40 gtcgagctga agaagtaaga nnnnnttatg cccaa 35 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pae-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 41 gttgtcaccc cacctccggt nnnnncgccg ccg 33 <210> 42 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pmi-F <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 42 gtcaccacta atctcacgtt gannnnncct aaatata 37 <210> 43 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pmi--R <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 43 gatagatgat aatctggaag atgnnnnnta atcggcgc 38 <210> 44 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smar-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 44 ttaacgccct gtcggagaaa nnnnngctgg tgatc 35 <210> 45 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smar-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 45 cttggccaga atgtcgtact nnnnntcggt cacat 35 <210> 46 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eae-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 46 gccgttgttc tggctgcatc nnnnngtact actgc 35 <210> 47 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eae-R <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 47 ttgctggtgt tgtctttttc ggnnnnngtg aaggaac 37 <210> 48 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ecl-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 48 acggacttac ttgaagcaca nnnnnggtgg ttatg 35 <210> 49 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ecl-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 49 gtcttgctcg taacggtact nnnnnttgaa accgt 35 <210> 50 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kox-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 50 ggatattatc cgctcgaata nnnnngtggc ggaac 35 <210> 51 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kox-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 51 cttcaacgac ttcagtaccg nnnnnttgaa tacgt 35 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kpn-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 52 ctaacgttgc ctattccgtg nnnnnggaag atgac 35 <210> 53 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kpn-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 53 acctgcaccc gggccggaga nnnnncagta gtaga 35 <210> 54 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Str-F1 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 54 cgtgaacaca ttcttctttc acnnnnngtt ggtgtta 37 <210> 55 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Str-F2 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 55 cgtgaacata tccttctttc acnnnnngtt ggtgtta 37 <210> 56 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Str-F3 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 56 cgtgaacaca tcttgctttc acnnnnngtt ggtgtta 37 <210> 57 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Str-R1 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 57 ctgggaaatc atattctgaa agnnnnncac ggatttc 37 <210> 58 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Str-R2 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 58 ctgggaagtc atattctgac aannnnncac ggatttc 37 <210> 59 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Str-R3 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 59 ctgggaagtc atattctgta agnnnnncac ggatttc 37 <210> 60 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Str-R4 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 60 ctgggaagtc atattctgaa agnnnnncac ggatttc 37 <210> 61 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Str-R5 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 61 ctgggaagtc atattctgaa agnnnnncac gaatttc 37 <210> 62 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAl-phr1-F1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 62 aggttacaag gacagaactg nnnnnatcaa gaact 35 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAl-phr1-R1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 63 gctattgatt gaagcactgc nnnnnaaatc acaag 35 <210> 64 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTr-erg11-F2 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 64 tgagaatgca catgccattg nnnnntattt tcaga 35 <210> 65 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTr-erg11-R2 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 65 aataatggga tttttctagc nnnnncatgg tgatc 35 <210> 66 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPa-met2-F1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 66 gtggggtcga ttgaacaaac nnnnnaacaa cacat 35 <210> 67 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPa-met2-R1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 67 ctctggctga agtccgtaac nnnnntactg ttttc 35 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPa-top2-F1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 68 gacatcttcc aattatgacg nnnnncaaaa aaagg 35 <210> 69 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPa-top2-R1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 69 cctctccttg attgctttaa nnnnnatttc aacat 35 <210> 70 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Par-643F-1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 70 gcatttgcag tgagtgatgg nnnnnttaac caagt 35 <210> 71 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Par-1061R-1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 71 gcttcctact tccgtcaact nnnnncaatg cctta 35 <210> 72 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-ssk2-F1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 72 agctgtacag atgaagttca nnnnnataag ttatt 35 <210> 73 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-ssk2-R2 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 73 ttgttgtaac aagtaagaat nnnnnctatg cacca 35 <210> 74 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKr-F1 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 74 gtggaagaaa cggttatggc gnnnnncttt gtaac 35 <210> 75 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKr-R1 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 75 acttttccat gccaaacttg gnnnnntcgg gtttg 35 <210> 76 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AF-F2 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 76 ctttatgaga gacaggagtg nnnnnaccta ggaaa 35 <210> 77 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AF-tyr1-R1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 77 gaaggtagtg cagcataatc nnnnntcacg tcgaa 35 <210> 78 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Efm-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 78 atcgaaatgc agattccagc nnnnntgcca gaaga 35 <210> 79 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Efm-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 79 gattgacgct gatggtatcg nnnnnttcct aactg 35 <210> 80 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Efs-F <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 80 aaacaagtga aaagacagac acnnnnnaaa ccgtaga 37 <210> 81 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Efs-R <400> 81 gatttgtaga taacttacac ctaaaacggc aaatgtac 38 <210> 82 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sep-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 82 ctcgtttaaa agcccacaac nnnnnatgtt ctgaa 35 <210> 83 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sep-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 83 ctcttccttg ttaaattaga nnnnnagcca gtatt 35 <210> 84 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sha-F <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 84 aaacggatac gttctttgaa ttnnnnnaaa tggccga 37 <210> 85 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sha-R <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 85 aagcggcagc tagattgagt gtnnnnnctt cttcagc 37 <210> 86 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 86 gaagtcgagt ttgacaaagg nnnnngaact gataa 35 <210> 87 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 87 tgtcttcgct ccaaatattt nnnnnctctt ttttc 35 <210> 88 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eae-tolC-X <220> <221> misc_feature <222> (29)..(33) <223> n denotes deoxyinosine <400> 88 ctgctgaagg aagcggaaaa ccgcaaccnn nnnctgctgc agg 43 <210> 89 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eae-tolC-X <220> <221> misc_feature <222> (29)..(33) <223> n denotes deoxyinosine <400> 89 cgtgttgttc agcgcgatca gatcctgcnn nnncagcgtg ccg 43 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smar-chiC-X <220> <221> misc_feature <222> (26)..(30) <223> n denotes deoxyinosine <400> 90 ctttattgcg ccgcaatatt acaacnnnnn cggcgacggt 40 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smar-chiC-X <220> <221> misc_feature <222> (26)..(30) <223> n denotes deoxyinosine <400> 91 cagtttcagc gaggtggcgc ccagcnnnnn gaccgtcagc 40 <210> 92 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kpn-lamB-X <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 92 tctctctggc ggctacccgt annnnngaaa gcggcg 36 <210> 93 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kpn-lamB-X <220> <221> misc_feature <222> (27)..(31) <223> n denotes deoxyinosine <400> 93 gttgttatcg atgctggtcc cctgagnnnn nccgctgttc c 41 <210> 94 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eclo-ompX-X <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 94 gtttcaacct taagtaccgt tannnnnaag ataacaa 37 <210> 95 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eclo-ompX-X <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 95 gatcgggttg aactgcatac cagnnnnnta agagaaac 38 <210> 96 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kox-mdh-X <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 96 aataccaccg tggcgattgc nnnnnaagtg ctgaa 35 <210> 97 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kox-mdh-X <220> <221> misc_feature <222> (26)..(30) <223> n denotes deoxyinosine <400> 97 tgtgataata aaggaagaat agttannnnn cgcctgagtg 40 <210> 98 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Paeru-F <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 98 tatttcgcga gcgggacaaa cgnnnnnaac ttccctc 37 <210> 99 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Paeru-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 99 agtccagcac agccttcttg nnnnnggtgg tgcc 34 <210> 100 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ecol-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 100 tcgactgcat aaggagccgg nnnnntaagc acccc 35 <210> 101 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ecol-R <220> <221> misc_feature <222> (19)..(23) <223> n denotes deoxyinosine <400> 101 ggtagaagcg cttacctgnn nnnatggtgg agc 33 <210> 102 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pmir-F <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 102 ttgctggcgg tttatcacga agnnnnngat attctta 37 <210> 103 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pmir-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 103 tatttacgtt taaatgcgtc nnnnnaataa gcatt 35 <210> 104 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smal-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 104 tgagcaaaga cagcatcgtc nnnnngggcg tcttc 35 <210> 105 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smal-R <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 105 ttcgaaaggg acttcggtat acnnnnngaa catggtg 37 <210> 106 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Abau-F <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 106 cgcgtgtacg taatactggt gannnnncac gtcctaa 37 <210> 107 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Abau-R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 107 taaacgtgac ttatcgtatt gnnnnncttc caccac 36 <210> 108 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spne-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 108 gatactgtaa cggtagagga nnnnnaacag agagg 35 <210> 109 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spne-R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 109 gttttttcat aaaccgtacg cnnnnnttcc caggca 36 <210> 110 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spyo-F <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 110 cgattaaaca agtttgtggt gnnnnnctca ctaggc 36 <210> 111 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spyo-R <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 111 accatctcaa taaagcaaga ctnnnnnaat gaacatac 38 <210> 112 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smit-F <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 112 atggtgaaat ggatgatatc annnnngaag tagccatg 38 <210> 113 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smit-R <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 113 ggaaatcaga aaaggcatca ctnnnnnggc gattggt 37 <210> 114 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Saga-F <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 114 ttattcgcat tttagatcca ttnnnnncag ttgattc 37 <210> 115 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Saga-R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 115 tgtgattgct ttatttaaag tnnnnnaaac tttaaattc 39 <210> 116 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blaSHV-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 116 gcagataaaa ttataaccac nnnnnaaatc agcaa 35 <210> 117 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blaSHV-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 117 gggtagtggt gtcgcgggcg nnnnngggaa gcgcc 35 <210> 118 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mecA-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 118 gcgataatgg tgaagtagaa nnnnntgaac gtccg 35 <210> 119 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mecA-R <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 119 taactggaac gaaggtatca tcnnnnnccc aattttg 37 <210> 120 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanA-F <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 120 ccatgttgat gtagcatttt cnnnnntgca tggcaa 36 <210> 121 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanA-R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 121 cctgctcaat taagattttt gnnnnnatat tgtctt 36 <210> 122 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanB-F <220> <221> misc_feature <222> (20)..(24) <223> n denotes deoxyinosine <400> 122 gctatgcaag aagccatgtn nnnnatggga agcc 34 <210> 123 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vnaB-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 123 aggccagtga tttgtccatg nnnnntgcgg agctt 35 <210> 124 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MT-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 124 tctcctctca ggtccagaac nnnnncagcg ttgct 35 <210> 125 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MT-R <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 125 gccactggcc agaagctcct nnnnnaggct cacgg 35

Claims (34)

  1. 다음의 단계를 포함하는 패혈증-유발 미생물의 분류 및 검출의 동시 방법:
    (a) 생물학적 시료로부터 핵산 분자를 수득하는 단계;
    (b) 균류(fungi), 스타필로코커스(Staphylococcus) 속 박테리아, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 박테리아, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 박테리아 및 그람 음성 박테리아로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 3개의 패혈증-유발 미생물군각각에 속하는 최소 3종의 미생물종, 총 최소 9종의 미생물종의 핵산 분자에 혼성화되는 최소 9개의 미생물군 분류용 프라이머쌍을 상기 핵산 분자에 접촉시키는 단계로서, 상기 동일한 미생물군의 분류에 이용되는 미생물군 분류용 프라이머쌍은 동일 크기의 증폭산물(amplicon)을 생성하며 다른 미생물군의 분류에 이용되는 미생물군 분류용 프라이머쌍은 서로 다른 크기의 증폭산물을 생성하고;
    (c) 상기 단계 (b)의 결과물을 이용하여 상기 생물학적 시료로부터 수득한 핵산 분자를 멀티플렉스 방식으로 증폭시키는 단계; 그리고,
    (d) 상기 증폭산물의 크기를 분석하여 생물학적 시료에 포함된 패혈증-유발 미생물의 분류(classifying) 및 검출(detecting)을 동시에 하는 단계.
  2. 다음의 단계를 포함하는 패혈증-유발 미생물의 검출방법:
    (a) 생물학적 시료로부터 핵산 분자를 수득하는 단계;
    (b) 균류(fungi), 스타필로코커스(Staphylococcus) 속 박테리아, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 박테리아, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 박테리아 및 그람 음성 박테리아로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 3개의 패혈증-유발 미생물군각각에 속하는 최소 3종의 미생물종, 총 최소 9종의 미생물종의 핵산 분자에 혼성화되는 최소 9개의 미생물군 분류용 프라이머쌍을 상기 핵산 분자에 접촉시키는 단계로서, 상기 동일한 미생물군의 분류에 이용되는 미생물군 분류용 프라이머쌍은 동일 크기의 증폭산물(amplicon)을 생성하며 다른 미생물군의 분류에 이용되는 미생물군 분류용 프라이머쌍은 서로 다른 크기의 증폭산물을 생성하고;
    (c) 상기 단계 (b)의 결과물을 이용하여 상기 생물학적 시료로부터 수득한 핵산 분자를 멀티플렉스 방식으로 증폭시키는 단계;
    (d) 상기 증폭산물의 크기를 분석하여 생물학적 시료에 포함된 패혈증-유발 미생물을 분류(classifying)하는 단계;
    (e) 상기 패혈증-유발 미생물군에 속하는 최소 3종의 미생물종의 핵산분자와 혼성화 되는 최소 3개의 미생물종 동정용 프라이머쌍 및 상기 생물적 시료로부터 얻은 핵산분자를 이용하여 상기 핵산분자를 멀티플렉스 방식으로 증폭시키는 단계로서, 상기 최소 3개의 미생물종 동정용 프라이머쌍은 서로 다른 크기의 증폭산물을 생성하며; 그리고,
    (f) 상기 증폭산물의 크기를 분석하여 생물학적 시료에 포함된 패혈증-유발 미생물의 종을 동정(identifying)하는 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 생물학적 시료로부터 핵산 분자는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 최소 4개의 패혈증-유발 미생물군 각각에 속하는 최소 3종의 미생물종의 핵산분자에 혼성화 되는 최소 3개의 미생물군 분류용 프라이머쌍를 이용하여 실시되며, 상기 최소 3개의 미생물군 분류용 프라이머쌍은 동일 크기의 증폭산물을 생성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 최소 5개의 패혈증-유발 미생물군 각각에 속하는 최소 3종의 미생물종의 핵산분자에 혼성화 되는 최소 3개의 미생물군 분류용 프라이머쌍를 이용하여 실시되며, 상기 최소 3개의 미생물군 분류용 프라이머쌍은 동일 크기의 증폭산물을 생성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 패혈증-유발 미생물군에 속하는 균류는 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파라프실로시스, 칸디다 글라브라타, 칸디다 크루세이, 아스퍼길루스 퍼미게터스 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파라프실로시스, 칸디다 글라브라타, 칸디다 크루세이 및 아스퍼길루스 퍼미게터스로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 4종의 미생물종이 균류로 분류되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 패혈증-유발 미생물군에 속하는 스타필로코커스 속 박테리아는 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스타필로코커스 헤모라이틱쿠스, 스타필로코커스 파스테리, 스타필로코커스 와르네리, 스타필로코커스 코나이 아종. 우레아리티쿠, 스타필로코커스 카프래, 스타 필로코커스 에쿠오럼, 스타필로코커스 시물란스, 스타필로코커스 알레태, 스타필로코커스 클루사이, 스타필로코커스 갈리나럼, 스타필로코커스 아우리쿨라리스, 스타필로코커스 크로모제넨스, 스타필로코커스 델피니, 스타필로코커스 인터메디우스 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스타필로코커스 헤모라이틱쿠스, 스타필로코커스 파스테리, 스타필로코커스 와르네리, 스타필로코커스 코나이 아종. 우레아리티쿠, 스타필로코커스 카프래, 스타필로코커스 에쿠오럼, 스타필로코커스 시물란스, 스타필로코커스 알레태, 스타필로코커스 클루사이, 스타필로코커스 갈리나럼, 스타필로코커스 아우리쿨라리스, 스타필로코커스 크로모제넨스, 스타필로코커스 델피니 및 스타필로코커스 인터메디우스로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 4종의 미생물종이 스타필로코커스 속 박테리아로 분류되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 패혈증-유발 미생물군에 속하는 엔테로코커스 속 박테리아는 엔테로코커스 페에시움, 엔테로코커스 페칼리스, 엔테로코커스 아비움, 엔테로코커스 두란스 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 엔테로코커스 페에시움, 엔테로코커스 페칼리스, 엔테로코커스 아비움 및 엔테로코커스 두란스가 엔테로코커스 속 박테리아로 분류되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 패혈증-유발 미생물군에 속하는 스트렙토코커스 속 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 아갈락티에, 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 안기노서스, 스트렙토코커스 고르도나이, 스트렙토코커스 인터메디우스, 스트렙토코커스 오랄리스, 스트렙토코커스 파라산구이니스, 스트렙토코커스 베스티불라리스, 스트렙토코커스 알락토리티쿠스, 스트렙토코커스 크리세티, 스트렙토코커스 다운에이, 스트렙토코커스 페루스, 스트렙토코커스 갈리나세우스, 스트렙토코커스 하이오인테스티날리스, 스트렙토코커스 루테티엔시스, 스트렙토코커스 마카새, 스트렙토코커스 파라우베리스, 스트렙토코커스 소브리너스, 스트렙토코커스 수이스 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 아갈락티에, 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 안기노서스, 스트렙토코커스 고르도나이, 스트렙토코커스 인터메디우스, 스트렙토코커스 오랄리스, 스트렙토코커스 파라산구이니스, 스트렙토코커스 베스티불라리스, 스트렙토코커스 알락토리티쿠스, 스트렙토코커스 크리세티, 스트렙토코커스 다운에이, 스트렙토코커스 페루스, 스트렙토코커스 갈리나세우스, 스트렙토코커스 하이오인테스티날리스, 스트렙토코커스 루테티엔시스, 스트렙토코커스 마카새, 스트렙토코커스 파라우베리스, 스트렙토코커스 소브리너스 및 스트렙토코커스 수이스로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 4종의 미생물종이 스트렙토코커스 속 박테리아로 분류되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 패혈증-유발 미생물군에 속하는 그람 음성 박테리아는 E. coli, 프로테우스 미라빌리스, 슈모모나스 에어루기노사, 아시네토박터 바우마니, 스테노트로포모나스 말토필리아, 클렙시엘라 뉴모니애, 클렙시엘라 옥시토카, 세라티아 마르세스센스, 엔테로박터 클로아카이, 엔테로박터 에어로게네스 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 E. coli, 프로테우스 미라빌리스, 슈모모나스 에어루기노사, 아시네토박터 바우마니, 스테노트로포모나스 말토필리아, 클렙시엘라 뉴모니애, 클렙시엘라 옥시토카, 세라티아 마르세스센스, 엔 테로박터 클로아카이 및 엔테로박터 에어로게네스로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 4종의 미생물종이 그람 음성 박테리아로 분류되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 분류되는 패혈증-유발 미생물 미생물군은 항생제 내성 미생물군을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 항생제 내성 미생물군의 분류는 blaSHV, mecA, vanA 및 vanB 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 항생제 내성 유전자에 혼성화 되는 최소 2개의 미생물군 분류용 프라이머쌍을 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (e)는 최소 5종의 미생물종의 핵산분자와 혼성화 되는 최소 5개의 미생물종 동정용 프라이머쌍을 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 미생물군 분류용 프라이머, 미생물종 동정용 프라이머 또는 이 둘 모두는 다음의 일반식 I로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    5'-Xp-Yq-Zr-3' (I)
    상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 5'-제1차 프라이밍 부위(5'-first priming portion)이고, Yq는 최소 3개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3'-제2차 프라이밍 부위 (3'-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5'-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3'-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5'-제1차 프라이밍 부위가 3'-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 프라이머 전체 구조의 혼성화 특이성이 5'-제1차 프라이밍 부위와 3'-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 프라이머 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20 항에 있어서, 상기 분할 부위는 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 20 항에 있어서, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위의 길이는 3'-제2차 프라이밍 부위보다 긴 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 20 항에 있어서, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 20 항에 있어서, 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 20 항에 있어서, 상기 분할 부위는 3-10 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 20 항에 있어서, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 40-80℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 20 항에 있어서, 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 10-40℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 20 항에 있어서, 상기 분할 부위는 3-15℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 서열목록 제1서열 내지 제61서열로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 프라이머를 포함하는 패혈증-유발 미생물의 분류용 키트.
  32. 서열목록 제62서열 내지 제115서열로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 프라이머를 포함하는 패혈증-유발 미생물종의 동정용 키트.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제116서열 내지 제123서열로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 항생제 내성 유전자 증폭용 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 패혈증-유발 미생물종의 동정용 키트.
  34. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제124서열 및 제125서열의 내부대조군 증폭용 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20160022072A (ko) * 2014-08-19 2016-02-29 경북대학교 산학협력단 스트렙토코커스 애갈락티에 검출용 조성물 및 방법
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