KR20150040458A - 스타필로코커스 파스테리 검출용 프라이머쌍 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

스타필로코커스 파스테리 검출용 프라이머쌍 및 이를 이용한 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프라이머쌍 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 스타필로코커스(Staphylococcus) 속(genus)에 속하는 종(species) 중 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri)만을 종 특이적으로 검출하기 위한 프라이머쌍 및 이를 이용한 스타필로코커스 파스테리 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용하면, 스타필로코커스 파스테리를 우수한 효율로 단시간 내에 종 특이적으로 검출할 수 있어, 농식품 또는 의약학 분야 등에서 다양하게 활용가능할 것으로 기대된다.

Description

스타필로코커스 파스테리 검출용 프라이머쌍 및 이를 이용한 검출방법{Primer set for detecting Staphylococcus pasteuri and detecting method using the same}
본 발명은 스타필로코커스 파스테리 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 농식품 등에 포함된 스타필로코커스 파스테리를 검출하는 방법에 관한 것이다.
스타필로코커스(Staphylococcus)는 포도상구균 또는 포도알균으로 칭하는 미생물로, 자연계에 널리 분포하며 건강한 사람의 피부, 점막, 상기도, 비뇨기, 소화기 등에 정상적으로 존재하고, 공기, 바닥, 집기 등의 주변환경에도 존재하지만, 피부의 상처나 호흡기를 통하여 쉽게 인체에 감염될 수 있다. 스타필로코커스 속 (genus)에 속하는 다양한 종(species)은 흔히 심각한 질병을 일으키는 원인이 되며, 특히, 신선채소나 식품에도 존재하여 스타필로코커스에 오염된 음식을 사람이 섭취할 경우 식중독을 일으키기도 한다.
특히, 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri)는 스타필로코커스 속(genus)에 속하는 그람-양성균이다. 베타-톡신을 생산하며, 인간을 포함하는 동물이나 주변 환경에 존재한다. 스타필로코커스 파스테리는 패혈증, 식중독 등의 발생 원인이 된다.
이에, 스타필로코커스를 포함해 박테리아를 동정하고자 하는 많은 시도가 있어왔고, 그중 가장 대표적인 방법은 모든 박테리아가 가지고 있는 16S ribosome 부위를 증폭하고 증폭된 산물의 염기서열을 분석하여 동정하는 16S rRNA PCR 방법이다. 하지만, 16S rRNA PCR은 염기서열을 분석하는 과정에서 많은 시간이 소요되기 때문에 신속한 결과 수득을 기대하기 어렵다.
따라서, 최근, 기존의 동정방법을 보완하기 위하여 그람양성균 중 스트렙토코싸이(Streptococci ), 엔테로코싸이( Enterococci ), 스타필로코싸이( Staphylococci ) 속 등에 존재하는 망간 의존 초과산화물 불균등화 효소(manganese-dependent superoxide dismutase, sodA) 유전자부위를 기초로 제작한 프라이머쌍을 이용한 PCR 방법이 대두되었다.
다만, 스타필로코커스(Staphylococcus)는 종(species) 간 sodA 상동성이 높아 스타필로코커스 파스테리만을 종 특이적으로 검출하기 어렵다.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 스타필로코커스(Staphylococcus) 속(genus)에 속하는 종(species) 중 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri)만을 종 특이적으로 우수한 효율로 단시간 내에 검출하기 위한 프라이머쌍 및 이를 이용한 스타필로코커스 파스테리 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 위와 같은 과제를 달성하기 위해, 본 발명은 일 양태로 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PA237 프라이머쌍을 포함하는 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는, 상기 프라이머쌍은 PCR을 통해 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri)만을 종 특이적으로 검출할 수 있도록 개발된 것으로(표 2 참고), 스타필로코커스 속(genus) 외 다른 속에 속하는 균주들과 혼입된 경우는 물론이고(표 4, 도 4 참고), 스타필로코커스 속(genus)에 속하는 다른 종(species)과 혼입되어 있는 경우에도 스타필로코커스 파스테리만을 특이적으로 검출할 수 있다(표 2, 도 2 참고). 또한, 스타필로코커스 파스테리 종에 속하면 구체적 균주가 무엇인지는 상관없이 효과적으로 검출가능하다(표 3, 도 3 참고).
또한, 본 발명에 따른 프라이머쌍은 스타필로코커스 파스테리 망간 의존 초과산화물 불균등화 효소(manganese-dependent superoxide dismutase, sodA) 유전자를 증폭시키도록 작제된 것으로, 16S rRNA PCR 보다 신속한 종 특이적 검출이 가능하다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 PA237 F 프라이머는 정방향(forword) 프라이머이고, 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PA237 R 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머이다.
본 발명에 따른 명세서에 있어서, 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2 + 의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
본 발명에 따른 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열에 대하여 1개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머쌍은 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 포함할 수 있다. 즉, 염기서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 프라이머쌍의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머쌍은 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISAS 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머쌍은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol.68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용하여 증폭반응을 수행하면 표적서열, 즉 sodA 유전자를 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 레플리카제(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 가능하다.
이 중에서, "중합효소 연쇄반응(PCR)"이란 중합효소를 이용하여 표적핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍으로부터 표적핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 증폭된 표적서열은 검출가능한 표지물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭산물이 합성되면서 방사성이 증폭산물에 혼입되어 증폭산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명은 다른 양태로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PA237 프라이머쌍을 포함하는 스타필로코커스 파스테리 검출용 조성물을 포함하는, 스타필로코커스 파스테리 검출용 PCR 키트를 제공한다.
상기 키트에는 상기 프라이머쌍 외에 이에 제한되지 않지만, DNA 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, DNA 추출용 시약, 데옥시뉴클레오티드, DNA 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안성 DNA 중합효소, 완충액, 및 dNTP 등이 포함될 수 있다. 상기 프라이머쌍 및 DNA 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약은 동결 건조된 상태로 플라스틱 튜브에 담아 제공될 수 있다.
또 다른 양태로, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PA237 프라이머쌍을 이용하는 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri) 검출을 위한 PCR 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계; 2) 상기 프라이머쌍을 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 PCR을 수행하는 단계: 및 3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 시료는 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri)의 포함 여부가 의심되는 것은 모두 포함될 수 있으며, 예컨대 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri) 자체, 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri)가 포함된 것으로 예상되는 농식품, 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri) 감염된 것으로 예상되는 인간 포함 동물 유래 조직 등일 수 있다.
상기 3) 단계에서의 정성분석은 전기영동 결과, PCR 산물의 밴드크기를 통해 시료 내 스타필로코커스 파스테리 포함 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용하면, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속(genus)에 속하는 종(species) 중 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri)만을 종 특이적으로 우수한 효율로 단시간 내에 검출할 수 있다.
도 1은 스타필로코싸이 sodA 유전자(Staphylococci sodA gene) 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 스타필로코커스 종들(Staphylococcus species)의 PCR 결과를 나타낸 것이다. 각 번호는 표 2에 표시된 미생물을 의미한다.
도 3은 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri) 균주들의 PCR 결과를 나타낸 것이다. 각 번호는 표 3에 표시된 미생물을 의미한다.
도 4는 다양한 속(genus)에 속하는 균주들의 PCR 결과를 나타낸 것이다. 각 번호는 표 4에 표시된 미생물을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 게놈 DNA ( gDNA )의 분리
식품 유리의 미생물들을 배양액에서 배양 후 게놈 DNA의 분리를 위하여 TOMY MX-301 원심분리기 (TOMY KOGYO Co. Tokyo, 일본)를 사용하여 13,000 rpm 속도로 1분 동안 원심분리하여 미생물을 얻었다. 이후에, G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology Inc., 성남, 한국)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 게놈 DNA의 순도는 스펙트로미터 (UV-1601 Spectrophotometer Shimadzu 사, 일본)를 사용하여 A 260/ A 280 비율을 결정함으로써 측정되었다. 상기 A 260/ A 280 비율이 1.8보다 큰 게놈 DNA를 선택하여 260 nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
실시예 2. PCR 의 실시
실시예 2-1. 스타필로코커스 파스테리 ( Staphylococcus pasteuri ) 특이적 프라이머쌍 제작
스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri)의 망간 의존 초과산화물 불균등화 효소(manganese-dependent superoxide dismutase, sodA) 유전자부위의 염기서열(Genbank Accession No. AJ343953, Genbank Accession No. AJ343920)을 바탕으로 스타필로코커스 파스테리 종 특이적 프라이머쌍, 정방향 프라이머 PA237-F(서열번호 1: 5'-GCTAATTTAGACAGTGTACCTTCTG-3') 및 역방향 프라이머 PA237-R(서열번호 2: 5'-GCCCGTTATTTACTACTAACCA-3')를 작제하였다. 이들 프라이머쌍은 스타필로코커스 파스테리 sodA 유전자를 특이적으로 인식하며, 이들 프라이머쌍을 이용한 PCR 증폭산물의 크기는 237bp이며, Tm은 61℃이다(표 1).
Strain Primer Sequence (5`-3`) size (bp) Tm
(°C)
Staphylococcus pasteuri PA237 F GCTAATTTAGACAGTGTACCTTCTG 237 61
PA237 R GCCCGTTATTTACTACTAACCA
실시예 2-2. 제작 프라이머쌍의 종 특이성 확인
(1) 스타필로코커스 속( genus )에 속하는 다양한 종( species )을 대상으로 한 PCR
상기 표 1의 프라이머쌍을 이용해, 하기 표 2에 해당하는 스타필로코커스 속에 속하는 종(species)을 C1000™ thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Inc.,CA, 미국)를 사용하여 PCR을 실시하였고, 각 반응은 Maxime PCR Premix Kit (i-starTaq)（iNtRON Biotechnology, 성남, 한국)를 사용하여 확인하였다.
번호 strain
1 S.aureus ATCC 29213
2 S.capitis KACC 13242
3 S.caprae KACC 13251
4 S.carnosus KACC 13250
5 S.chromogenes KACC 13248
6 S.cohnii KACC 13237
7 S.epidermidis KACC 14822
8 S.equorum S-14
9 S.haemolyticus KACC 132389
10 S. pettenkoferi S-19
11 S. saprophyticus KACC 13235
12 S. simulans KACC 13241
13 S. warneri KACC 10785
14 S. xylosus KACC 13239
15 S. pasteuri KACC 13185
보다 구체적으로, 표 1의 프라이머쌍 (10 pM) 및 상기 표 2의 각각의 미생물의 gDNA (100 ng)를 포함하는 PCR 반응 혼합물 30 μl를 95°C에서 5분간 변성한 후, 95°C에서 1분. 61°C에서 1분, 72°C에서 30 초간 반응시키는 싸이클을 1 싸이클(cycle)로 하여 30 싸이클을 실시한 다음, 72°C에서 5분간 반응시켰다. 수득된 PCR 산물 10μl를 Loading STAR(DyneBio Inc., 성남, 한국)와 5:1의 부피비로 혼합한 후, 2% 아가로스겔에 전기영동한 후 자외선 조사기 (UV transilluminator)에서 확인하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 즉, 표 2에 대한 미생물 목록을 대상으로 PCR 및 전기영동한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 표시한 각 번호는 상기 표 2에 표시된 미생물을 의미하며, 사용한 Ladder는 100 bp DNA Ladder (Bioneer, 대전, 한국)이다.
그 결과, 표 1의 프라이머쌍이 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri) 병원균이 포함된 경우(표 2의 15번, 도 2의 15번)만 증폭시켰음을 알 수 있었다. 즉, 도 2의 전기영동 결과로부터, 본 발명의 프라이머쌍(PA237 F/PA237 R)은 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri) 병원균만 특이적으로 증폭시킨다는 것을 알 수 있었다.
(2) 스타필로코커스 파스테리( Staphylococcus pasteuri) 에 속하는 다양한 균주를 대상으로 PCR
상기 표 1의 프라이머쌍을 이용해, 하기 표 3에 해당하는 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri)에 속하는 다양한 균주를 C1000™ thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Inc.,CA, 미국)를 사용하여 PCR을 실시하였고, 각 반응은 Maxime PCR Premix Kit (i-starTaq)（iNtRON Biotechnology, 성남, 한국)를 사용하여 확인하였다.
번호 strain
1 Staphylococcus pastueri S-34
2 Staphylococcus pastueri S-35
3 Staphylococcus pastueri SS-1
4 Staphylococcus pastueri SS-32
5 Staphylococcus pastueri KACC 13185
보다 구체적으로, 상기 표 3의 미생물을 대상으로 상기 (1)과 동일한 방법으로 PCR 및 전기영동하였다.
그 결과, 도 3에 도시한 바와 같이, 표 1의 프라이머쌍(PA237 F/PA237 R)이 5가지의 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri ) 모두를 증폭시켰음을 알 수 있었다. 즉, 도 3의 결과를 토대로 본 발명의 프라이머쌍이 스타필로코싸이(Staphylococci ) 속 중 파스테리(pasteuri ) 종만 특이적으로 증폭시킨다는 결과를 얻을 수 있었다.
(3) 다양한 속( genus )에 속하는 균주를 대상으로 PCR
상기 표 1의 프라이머쌍을 이용해, 하기 표 4에 해당하는 다양한 속(genus)에 속하는 균주를 C1000™ thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Inc.,CA, 미국)를 사용하여 PCR을 실시하였고, 각 반응은 Maxime PCR Premix Kit (i-starTaq)（iNtRON Biotechnology, 성남, 한국)를 사용하여 확인하였다.
번호 strain
1 Listeria monocytogenes ATCC 15313
2 Enterococcus faecalis KACC 11304
3 Bacillus cereus KCTC 1092
4 Streptococcus acidominimus KACC 13815
5 Salmonella enterica ATCC 19946
6 Yersinia enterocolitica ATCC 9610
7 Escherichia coli O157:H7
8 Staphylococcus aureus CCARM 3793
9 Staphylococcus pastueri KACC 13185
보다 구체적으로, 상기 표 4의 미생물을 대상으로 상기 (1)과 동일한 방법으로 PCR 및 전기영동하였다.
그 결과, 도 4에 도시한 바와 같이, 표 1의 프라이머쌍(PA237 F/PA237 R)이 스타필로코커스 파스테리(staphylococcus pasteuri )만(9번) 증폭시켰음을 알 수 있었다. 즉, 도 4의 결과를 토대로 본 발명의 프라이머쌍이 스타필로코싸이 파스테리(Staphylococci pasteuri ) 만 특이적으로 증폭시킨다는 결과를 얻을 수 있었다.
<110> Rural development administration <120> Primer set for detecting Staphylococcus pasteuri and detecting method using the same <130> P13-151 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PA237 F <400> 1 gctaatttag acagtgtacc ttctg 25

Claims (4)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PA237 프라이머쌍을 포함하는 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri) 검출용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 PA237 프라이머쌍은 스타필로코커스 파스테리 망간 의존 초과산화물 불균등화 효소(manganese-dependent superoxide dismutase, sodA) 유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 스타필로코커스 파스테리 검출용 조성물.
  3. 제 1항에 따른 스타필로코커스 파스테리 검출용 조성물을 포함하는, 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri) 검출용 PCR 키트.
  4. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PA237 프라이머쌍을 이용하는 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri) 검출을 위한 PCR 방법.
KR1020130118991A 2013-10-07 2013-10-07 스타필로코커스 파스테리 검출용 프라이머쌍 및 이를 이용한 검출방법 KR101589193B1 (ko)

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US20070292846A1 (en) * 2003-07-10 2007-12-20 Biomerieux Method for Detecting and/or Identifying Bacteria of the Genus Staphylococcus
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