KR101719769B1

KR101719769B1 - 후자린산 생성 후자리움 종 검출용 프라이머쌍 및 이를 이용한 검출방법

Info

Publication number: KR101719769B1
Application number: KR1020150107219A
Authority: KR
Inventors: 이데레사; 함현희; 이수형; 홍성기; 류재기
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2017-03-28
Also published as: KR20170014230A

Abstract

본 발명은 후자리움속 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 농식품 등에 포함된 후자리움속을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용하면, 후자리움(Fusarium)속에 속하는 종(species) 중 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 균주만을 종 특이적으로 우수한 효율로 단시간 내에 검출할 수 있다.

Description

후자린산 생성 후자리움 종 검출용 프라이머쌍 및 이를 이용한 검출방법{Primer set for detecting Fusarium species which produce fusaric acid and detecting method using the same}

본 발명은 후자리움속 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 농식품 등에 포함된 후자리움속을 검출하는 방법에 관한 것이다.

곰팡이독소는 사람이나 동물에서 발암성, 급성 및 만성적 질병을 유발하는 위험물질 중 하나이다. 곰팡이 중에서도 후자리움속(Fusarium species)의 곰팡이는 대표적인 곰팡이독소를 생성하는 곰팡이로서 데옥시니발레놀/니발레놀, T-2 독소, 제랄레논, 푸모니신, 모닐리포민 및 후자린산(Fusaric acid, FA)과 같은 독소를 생성할 수 있고, 이 중 후자린산의 경우 다른 독소와 함께 상승된 독성을 유발할 수 있다.

또한, 후자리움속(Fusarium species)의 곰팡이는 약 100여 종으로 식물에 감염되면 심각한 병을 야기하게 되고 이로 인하여 경제적인 손실이 발생한다. 후자리움속은 강력한 병원성을 나타내고 누적적으로 증가되어 넓은 면적에 병을 발생시킴으로써 작물생산에 결정적인 제한 요인이 되기도 한다. 또한 약제처리나 일회적인 간단한 처리로서는 방제가 어렵기 때문에 세계 각국에서 큰 관심을 가지고 있는 토양병균이다. 후자리움속 중에 어떤 종들은 줄기, 잎, 열매 등에 다양한 병을 일으켜 큰 피해를 주고 있으며 이를 방제하려는 연구는 많이 시도되고 있다.

후자린산은 5-butylpicolinic acid로서 화학 구조가 간단하며 동물뿐만 아니라 식물에 약독성을 나타내고 식물의 시들음병에 관여하는 것으로 알려져 있다(Gaumann, 1957). 또한, 후자린산은 다른 후자리움(Fusarium) 독소와 중복 오염시 독성 증진효과를 보이는 물질로 주목받고 있으며, 캐나다에서 돼지 사료의 오염을 조사한 결과 상당한 양의 후자린산이 검출됨에 따라 돼지 사료의 후자리움(Fusarium) 독소의 오염 분석시 후자린산을 포함해야 한다는 연구 결과가 있다(Smith et al., 1993).

현재, 이러한 후자린산의 특성 때문에 후자린산을 생성하는 후자리움속 균주를 검출하는 방법이 필요한 상황이나, 여러 가지 후자리움속 균주 중에서도 후자린산을 생성하는 균주만을 특이적으로 검출하는 방법에 대해서는 알려진바 없다.

대한민국 공개특허 제10-2013-0054476호

이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 후자리움(Fusarium)속에 속하는 종(species) 중 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 균주만을 특이적으로 우수한 효율로 단시간 내에 검출하기 위한 프라이머쌍 및 이를 이용한 후자리움(Fusarium)속 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 일 양태로 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 fub10 프라이머쌍을 포함하는 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는, 상기 프라이머쌍은 PCR을 통해 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 균주만을 특이적으로 검출할 수 있도록 개발된 것으로, 후자리움(Fusarium)속 이외에 다른 속에 속하는 균주들과 혼입된 경우는 물론이고, 후자리움(Fusarium)속에 속하는 후자린산(fusaric acid)을 생성하지 못하는 다른 종과 혼입되어 있는 경우에도 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 균주만을 특이적으로 검출할 수 있다. 또한, 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 균주라면 구체적인 균주가 무엇인지 상관없이 효과적으로 검출 가능하다.

본 발명의 후자린산(fusaric acid)은 후자리움(Fusarium)속의 일부가 분비하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이며 분자식 C₁₀H₁₃NO₂ 의 피리딘핵이 있는 약산성물질로서, 많은 식물, 곰팡이나 세균의 생육을 저해하는 작용을 할 수 있다. 이러한 생육 저해는 후자린산이 카탈라아제 또는 과산화효소 등 철포르핀계 호흡 효소와 결합하여 그 활성을 저해하기 위해 일어나는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

[화학식 1]

본 발명에서, 상기 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 균주는 예를 들어, 후자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 후자리움 프로리페라툼(Fusarium proliferatum), 후자리움 버티실리오이데스(Fusarium verticillioides), 후자리움 안토필룸(Fusarium anthophilum), 후자리움 불비콜라(Fusarium bulbicola), 후자리움 씨르시나툼(Fusarium circinatum), 후자리움 후지쿠로이(Fusarium fujikuroi), 후자리움 레돌렌스(Fusarium redolens), 후자리움 사카리(Fusarium sacchari), 후자리움 서브글루티난스(Fusarium subglutinans), 후자리움 탑시눔(Fusarium thapsinum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 균주일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 프라이머쌍은 Fub10 유전자를 증폭시키도록 작제된 것으로서, 상기 Fub10 유전자는 C6 전사 요소(C6 transcription factor)를 코딩하는 유전자일 수 있다.

상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 fub10 프라이머는 정방향(forward) 프라이머이고(fub10-F), 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 fub10 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머이다(fub10-R).

본 발명에 따른 명세서에 있어서, 용어 "프라이머(primer)"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg² ⁺ 의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.

본 발명의 프라이머에서 일반적인 DNA 염기서열에서 사용되는 A, T, C, G 이외에 표시된, S 의 경우에는 C 또는 G(상보적 코드 : S), M 의 경우에는 A 또는 C(상보적 코드 : K), W 의 경우에는 A 또는 T(상보적 코드 : W)를 나타낸다.

본 발명에 따른 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열에 대하여 1개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머쌍은 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 포함할 수 있다. 즉, 염기서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 프라이머쌍의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머쌍은 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 ³²P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISAS 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.

본 발명에 따른 프라이머쌍은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법 (1979, Meth, Enzymol.68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국특허 제4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용하여 증폭반응을 수행하면 표적서열, 즉 Fub10 유전자를 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 레플리카제(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 가능하다.

이 중에서, "중합효소 연쇄반응(PCR)"이란 중합효소를 이용하여 표적핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍으로부터 표적핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 증폭된 표적서열은 검출가능한 표지물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭산물이 합성되면서 방사성이 증폭산물에 혼입되어 증폭산물이 방사성으로 표지될 수 있다.

본 발명은 다른 양태로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 fub10 프라이머쌍을 포함하는 후자리움(Fusarium)속 검출용 조성물을 포함하는, 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 검출용 PCR 키트를 제공한다.

상기 키트에는 상기 프라이머쌍 외에 이에 제한되지 않지만, 핵산 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 핵산 추출용 시약, 데옥시뉴클레오티드, 핵산 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정 핵산 중합효소, 완충액, 및 dNTP 등이 포함될 수 있다. 상기 프라이머 및 핵산 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약은 동결 건조된 상태로 플라스틱 튜브에 담아 제공될 수 있으며, 상기 핵산은 바람직하게 DNA 일 수 있다.

또 다른 양태로, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 fub10 프라이머쌍을 이용하는 후자리움(Fusarium)속 검출을 위한 PCR 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 하기의 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 검출을 위한 PCR 방법을 제공한다:

S1) 시료의 핵산을 추출하는 단계; S2) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 fub10 프라이머쌍을 이용하여 상기 S1) 단계의 핵산으로부터 PCR을 수행하는 단계; 및 S3) 상기 S2) 단계의 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 시료는 후자리움(Fusarium)속의 포함 여부가 의심되는 것은 모두 포함될 수 있으며, 예컨대 후자리움(Fusarium)속 자체, 후자리움(Fusarium)속이 포함된 것으로 예상되는 농식품, 후자리움(Fusarium)속에 감염된 것으로 예상되는 인간 포함 동물 유래 조직 등일 수 있다.

상기 S3) 단계에서의 정성분석은 전기영동 결과, PCR 산물의 밴드크기를 통해 시료 내 후자리움(Fusarium)속의 포함 여부를 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용하면, 후자리움(Fusarium)속에 속하는 종(species) 중 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 균주만을 종 특이적으로 우수한 효율로 단시간 내에 검출할 수 있다.

도 1은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 각각의 후자리움속 균주로부터 후자린산 유전자를 증폭한 결과를 나타낸 사진이다(각 균주의 번호는 표 2 참고).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1>

게놈 DNA( gDNA )의 분리

실험에 사용된 후자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum, Foxy20) 및 후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum, SCK04)은 국립농업과학원 보유 균주를 사용하였으며, 후자리움 프로리페라툼(Fusarium proliferatum, FP) 및 후자리움 버티실리오이데스(Fusarium verticillioides, FV)는 순천향대학교에서 분양받았으며, 후자리움 안토필룸(Fusarium anthophilum, KSU 11560), 후자리움 불비콜라(Fusarium bulbicola, KSU 10759), 후자리움 씨르시나툼(Fusarium circinatum, KSU H-10847), 후자리움 후지쿠로이(Fusarium fujikuroi, KSU C-1993), 후자리움 레돌렌스(Fusarium redolens, KSU18979), 후자리움 사카리(Fusarium sacchari, KSU B-3852), 후자리움 서브글루티난스(Fusarium subglutinans, KSU E-0990), 후자리움 탑시눔(Fusarium thapsinum, KSU F-4093), 후자리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense, KSU 11451), 후자리움 쿨모룸(Fusarium culmorum, KSU 11427), 후자리움 에퀴세티(Fusarium equiseti, KSU 20979), 후자리움 포에(Fusarium poae, KSU 11470), 후자리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides, KSU 11552), 후자리움 그래미네아룸(Fusarium graminearum, KSU Z-3639)는 후자리움 워크샵(Fusarium Laboratory Workshop)에서 분양 받은 균주를 사용하였다.

곰팡이 게놈 DNA의 분리를 위해 감자한천배지에서 5일간 배양한 균사체를 긁어 1.5ml 튜브에 넣은후 분쇄버퍼(EDTA 20mM, Tris-Cl 100mM, NaCl 8.19%) 400μl를 추가하고 pellet pestle을 장착한 드릴로 균사체를 분쇄하였다. 이후에 phenol:chloroform:isoamyl-alcohol(25:24:1)액을 동량 넣고 vortex 한 후 4℃ 12000rpm에서 10분간 원심분리하여 DNA를 분리하였다. DNA가 포함된 상층액은 새 튜브에 옮긴 후 이소프로판올(isopropanol)을 상층액과 동량 추가하여 위아래로 섞어준 후 위의 조건으로 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA는 70% 에탄올로 세척하여 건조시킨 후 TE버퍼에 용해하여 4℃에 보관하였다.

< 실시예 2>

PCR 의 실시

<2-1> 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움( Fusarium )속 균주 특이적 프라이머쌍 제작

본 발명자들은 후자리움(Fusarium)속이 생성하는 독소 중 후자린산의 생성 여부 진단을 위해 후자린산의 생합성에 관련된 유전자 중 전사 인자(transcription factor)인 Fub10 유전자 부위의 염기서열(GCA_000149555.1, GCA_000149955.1, GCA_000260195.2 등)을 바탕으로 후자리움(Fusarium)속 특이적 프라이머쌍, 정방향 프라이머 fub10-F(서열번호 1 : 5'-GATTTCATSGTCAATGAMAATATC-3') 및 역방향 프라이머 fub10-R(서열번호 2 : 5'-TTGAGAAWATGATACCATAGATTG-3')를 작제하였다. 이들 프라이머쌍은 후자리움(Fusarium)속의 Fub10 유전자를 특이적으로 인식하며, 이들 프라이머쌍을 이용한 PCR 증폭산물의 크기는 598bp이며, Tm 은 49℃이다(표 1).

Primer	Sequence(5'-3')	size(bp)	Tm(℃)
fub10-F	GATTTCATSGTCAATGAMAATATC	598	49
fub10-R	TTGAGAAWATGATACCATAGATTG	598	49

<2-2> 제작 프라이머쌍의 특이성 확인

상기 표 1의 프라이머쌍을 이용해, 하기 표 2에 해당하는 후자리움(Fusarium)속에 속하는 종(species)을 대상으로 Myclcler (Bio-Rad Laboratories, Inc.,CA, 미국)과 TaKaRa Ex Taq(TaKaRa Biotechnology, 일본)을 사용하여 PCR을 실시하였다.

Number	Description	균주명	Fub10 유전자 증폭	후자린산 생성¹
M	1kb ladder	마커	-	-
C	Negative control	water	X	X
1	F. oxysporum	Foxy20(자체보유균주)	O	O
2	F. proliferatum	Fp(순천향대 분양균주)	O	O
3	F. verticillioides	Fv(순천향대 분양균주)	O	O
4	F. anthophilum	KSU 11560	O	O
5	F. bulbicola	KSU 10759	O	O
6	F. circinatum	KSU H-10847	O	O
7	F. fujikuroi	KSU C-1993	O	O
8	F. redolens	KSU 18979	O	O
9	F. sacchari	KSU B-3852	O	O
10	F. subglutinans	KSU E-0990	O	O
11	F. thapsinum	KSU F-4093	O	O
12	F. crookwellense	KSU 11451	X	O
13	F. culmorum	KSU 11427	X	X
14	F. equiseti	KSU 20979	X	X
15	F. poae	KSU 11470	X	X
16	F. sporotrichioides	KSU 11552	X	X
17	F. graminearum	KSU Z-3639	X	X
18	F. asiaticum	SCK04(자체보유균주)	X	X

¹ 해당 종에서 후자린산 생성 여부가 확인 또는 보고된 결과임

보다 구체적으로, 표 1의 프라이머쌍 (10 pM) 및 상기 표 2의 각각의 미생물의 gDNA (100 ng)를 포함하는 PCR 반응 혼합물 25 μl를 96℃에서 1분 30초간 변성한 후, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 68℃에서 1분간 반응시키는 싸이클을 1 싸이클(cycle)로 하여 35 싸이클을 실시한 다음, 68℃에서 10분간 반응시켰다. 수득된 PCR 산물 3μl를 Loading STAR(DyneBio Inc., 성남, 한국)와 3:1의 부피비로 혼합한 후, 1% 아가로스겔에 전기영동한 후 자외선 조사기 (UV transilluminator)에서 확인하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 즉, 표 2에 대한 미생물 목록을 대상으로 PCR 및 전기영동한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 표시한 각 번호는 상기 표 2에 표시된 미생물을 의미하며, 사용한 Ladder는 1kb DNA Ladder (Bioneer, 대전, 한국)이다.

그 결과, 표 1의 프라이머쌍이 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속만 증폭시켰음을 알 수 있었다. 즉, 도 1의 전기영동 결과로부터, 본 발명의 프라이머쌍(fub10-F/fub10-R)은 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 균주만 특이적으로 증폭시킨다는 것을 알 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for detecting Fusarium species which produce fusaric acid and detecting method using the same <130> P15-140 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Primer <400> 1 gatttcatsg tcaatgamaa tatc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Primer <400> 2 ttgagaawat gataccatag attg 24

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 fub10 프라이머쌍을 포함하는 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 fub10 프라이머쌍은 Fub10 유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 후자리움(Fusarium)속은 후자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 후자리움 프로리페라툼(Fusarium proliferatum), 후자리움 버티실리오이데스(Fusarium verticillioides), 후자리움 안토필룸(Fusarium anthophilum), 후자리움 불비콜라(Fusarium bulbicola), 후자리움 씨르시나툼(Fusarium circinatum), 후자리움 후지쿠로이(Fusarium fujikuroi), 후자리움 레돌렌스(Fusarium redolens), 후자리움 사카리(Fusarium sacchari), 후자리움 서브글루티난스(Fusarium subglutinans), 후자리움 탑시눔(Fusarium thapsinum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 검출용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 검출용 조성물을 포함하는, 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 검출용 PCR 키트.
서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 fub10 프라이머쌍을 이용하는 후자린산(fusaric acid)을 생성하는 후자리움(Fusarium)속 검출을 위한 PCR 방법.