KR20230167959A - 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아의 검출방법 - Google Patents
잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아의 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출용 프라이머 세트; 이를 포함하는 조성물; 이를 포함하는 키트; 및 이를 이용한 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출용 프라이머 세트; 이를 포함하는 조성물; 이를 포함하는 키트; 및 이를 이용한 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출 방법에 관한 것이다.
잔토모나스 속(Xanthomonas)은 토양질소의 탈질에 관여하는 세균이다. 여기에는 병원성 세균으로서 복숭아나무 세균성구멍병, 무 검은빛썩음병, 감귤 궤양병, 벼흰빛잎마름병, 강남콩 불마름병 등을 일으키는 것도 있다. 잔토모나스 호르토룸(Xanthomonas hortorum)은 세균성 점무늬병을 일으키는데, 처음에는 주로 오래된 잎에 수침상 점무늬를 형성하여 점점 커지다가 노란 색의 테두리를 형성하면서 갈색 내지 검은색 점무늬를 형성한다. 심하게 발병하면 잎 전체가 검게 말라 죽으며, 병반에는 검은색 알갱이 등을 형성하지 않아 곰팡이 병에 의한 점무늬병과는 다른 특징을 가진다.
식물 병원세균의 유전자 동정방법으로는 Dot-blot, 중합효소 연쇄반응(PCR) 등의 방법이 이용된다. 특히 PCR은 Dot-blot 방법보다 시간, 노력, 인력 등이 경제적이기 때문에 최근 널리 사용되고 있는 방법이다. PCR(중합효소 연쇄반응, polymerase chain reaction) 동정 방법은 10~20bp로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머)을 세균의 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)한 후 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 행하게 되면, 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭하게 되며, 그 PCR 증폭산물을 아가로스 젤(agarose gel) 또는 아크릴아마이드 젤(acrylamide gel)에 전기영동하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 및 은 염색(silver stain)으로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 유무 혹은 형태의 차이와 같은 세균종의 DNA 다형성을 동정 동정하는 방법이다. 현재, 이러한 PCR에 의한 세균의 동정법은 인체나 동물의 세균성 질병을 동정에 주로 이용되나, 최근에는 식물 병원균을 동정할 수 있도록 PCR 동정법이 개발되어 병의 동정과 함께 수출입 농산물의 검역에 이용되고 있다. 또한, PCR 동정 방법은 다른 방법에 비해 소요되는 시간이 짧고, 동정에 소요되는 비용이 저렴하며 또한, 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이다. 이에 최근에는 잔토모나스(Xanthomonas) 동정방법 중에서 유전물질인 핵산을 증폭하는 PCR 동정 방법이 가장 선호되고 있다.
그러나 기존의 PCR 동정 방법으로는 유전적 유사도로 인한 종간 구분의 어려움이 있어서 이를 극복할 수 있는 해결책이 필요한 실정이다.
기존의 잔토모나스 속 미생물 중, 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 세균성점무늬병원균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), 십자화과 흑부병원균(Xanthomonas campestris pv. campestris), 감귤류 궤양병 병원균(Xanthomonas axonopodis pv. citri) 및 콩불마름병원균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines) 등 다양한 미생물의 동정에 사용되는 개별적인 PCR 프라이머에 대한 연구는 이루어졌으나, 잔토모나스 속(Xanthomonas) 으로부터 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 동정해내는 방법에 대하여는 아직까지 연구된 바 없다. 이에, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 동정할 수 있는 방법 개발이 요구된다.
이에, 본 발명은 당근세균마름병의 원인 세균인 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 고특이도 및 고민감도로 검출할 수 있고, Real-time PCR에 적합하여 검체로부터 DNA 추출 없이 감염 여부 확인 및 직접 정량(밀도 측정)이 가능한 프라이머 세트를 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.
본 발명자들은 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 유전체 정보(GenBank accession NZ_CM002307.1, protein ID WP_220655539.1, location= 2448580..2449011)의 가상(hypothetical) 단백질 유전자를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하였다.
이에, 상기 가상 단백질 유전자에 기초하여 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)에서 300bp 크기의 단편을 증폭시키는 신규의 프라이머 세트를 제작하고 이를 사용하여 여러 미생물 균주를 대상으로 PCR 및 Real-time PCR 증폭 시험을 수행한 결과 상기 프라이머 세트가 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)에서만 특이적으로 증폭 산물을 생성함을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
이상에 기초하여, 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (i) 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료에 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 (ii) DNA 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료에 대해서 Real-time PCR을 수행하는 단계; 및 상기 Real-time PCR에 의한 유전자 증폭 결과를 분석하는 단계를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 특이적으로 우수한 효율로 단시간 내에 검출할 수 있다.
특히 본 발명에 따른 프라이머 세트는 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)에 대해 검출 민감도가 높아 시료의 양이 적은 경우에도 우수한 효율로 검출할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 Real-time PCR은 검체로부터 DNA 추출과정 없이 직접적으로 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)의 감염 여부를 확인할 수 있고, 병원균 개체를 정량적으로 분석하여 해당 병원균의 검체 내 밀도를 확인할 수 있다.
도 1은 Xanthomonas hotorum의 가상 단백질(hypothetical protein) 유전자를 사용한 blastn 검색 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 프라이머를 사용한 가상 단백질의 PCR 증폭 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 Xanthomonas hotorum pv. carotae의 가상 단백질의 Real-time PCR 증폭 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 genomic DNA의 표준 희석 시리즈에서 Real-time PCR의 민감도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 cloned DNA의 표준 희석 시리즈에서 Real-time PCR의 민감도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 bacterial cell의 표준 희석 시리즈에서 Real-time PCR의 민감도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 프라이머를 사용한 가상 단백질의 PCR 증폭 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 Xanthomonas hotorum pv. carotae의 가상 단백질의 Real-time PCR 증폭 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 genomic DNA의 표준 희석 시리즈에서 Real-time PCR의 민감도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 cloned DNA의 표준 희석 시리즈에서 Real-time PCR의 민감도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 bacterial cell의 표준 희석 시리즈에서 Real-time PCR의 민감도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
본 발명자들은 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 유전체 정보(GenBank accession NZ_CM002307.1, protein ID WP_220655539.1, location= 2448580..2449011)의 가상(hypothetical) 단백질 유전자를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하였다.
이에, 상기 가상 단백질 유전자에 기초하여 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)에서 300bp 크기의 단편을 증폭시키는 신규의 프라이머 세트를 제작하였다.
본 발명자들은 상기 프라이머 세트를 사용하여 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 포함한 여러 미생물 균주를 대상으로 PCR 및 real-time PCR 증폭 시험을 수행한 결과 상기 프라이머 세트가 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)에서만 특이적으로 증폭 산물을 생성함을 확인하였다.
이에, 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 RS22715_300F 프라이머는 정방향(forward) 프라이머이고, 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 RS22715_300R 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머이다.
본 명세서에 있어서 용어 "프라이머(primer)"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열에 대하여 1개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 포함할 수 있다. 즉, 염기서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡핑화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머 세트는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol.68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국특허 제4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사-기반 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 레플리카제(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 가능하다.
이 중에서, "중합효소 연쇄반응(PCR)"이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 본 발명의 PCR은 일반(비정량) PCR 및 정량 PCR을 포괄하는 것으로서, 예를 들어, 일반 PCR, Real-time PCR을 포함한다. PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, real-time PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있다.
Real-time PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다. PCR 생산물의 증가가 표적 주형(template)의 초기 양과 비례하는 지수(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(threshold cycle)을 가지게 된다. PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준 시료를 사용하여 Real-time PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 PCR에 사용되는 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 Real-time PCR에 사용되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭 반응을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 증폭 반응 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 형광 측정, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출용 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 PCR용 키트일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 키트는 Real-time PCR용 키트일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 프라이머 세트 외에 핵산 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 핵산 추출용 시약, 데옥시뉴클레오티드, 핵산 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정 핵산 중합효소, 완충액(버퍼) 및 dNTP 등이 포함될 수 있다. 상기 프라이머 세트 및 핵산 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약은 동결 건조된 상태로 플라스틱 튜브에 담아 제공될 수 있으며, 상기 핵산은 바람직하게 DNA일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, (i) 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료에 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 (ii) DNA 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출 방법에 관한 것이다.
상기 (i) 단계의 시료는 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염이 의심되는 것은 모두 포함될 수 있으며, 예컨대 이들 병균 자체, 또는 이들 병균이 감염된 것으로 예상되는 식물체의 잎, 가지, 줄기, 뿌리, 꽃 등일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (i) 단계의 DNA 증폭 반응은 Real-time PCR일 수 있다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 Real-time PCR에 적합하여, 검체로부터 DNA 추출과정 없이 직접적으로 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)의 감염 여부를 확인할 수 있고, 병원균 개체를 정량적으로 분석하여 해당 병원균의 검체 내 밀도를 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (i) 단계에 있어서, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다.
일 구현예에서, 상기 (i) 단계에 있어서, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 경우, DNA 증폭 반응은 PCR에 의해 수행될 수 있다. PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 가지 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다.
상기 (ii) 단계의 DNA 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정에 의해 수행될 수 있으며, 이를 통해 표적 유전자의 증폭 여부를 확인할 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (ii) 단계의 DNA 증폭 산물의 검출은 전기영동에 의해 수행될 수 있으며, 이때 표적 유전자의 증폭 여부는 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)의 가상 단백질 유전자의 300bp 크기의 단편의 증폭 여부를 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료에 대해서 real-time PCR을 수행하는 단계; 및 상기 Real-time PCR에 의한 유전자 증폭 결과를 분석하는 단계를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 진단 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 진단 방법은 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA의 분리 과정 없이 시료 자체에 Real-time PCR이 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 Real-time PCR 진단 방법은 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료로부터 DNA 추출과정 없이 시료에서 직접적으로 해당 균의 검출이 가능하다. 또한 상기 Real-time PCR 진단 방법은 검체로부터 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 개체를 정량적으로 분석하여 해당 병원균의 검체 내 밀도를 확인할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 세균 균주 배양 및 총 RNA 추출
(1) 세균 균주 및 배양 조건
본 발명에서 사용된 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 포함한 기타 미생물은 Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea (KACC)에서 분양 받았으며, 이들의 출처는 표 1에 정리하였다. 잔토모나스(Xanthomonas) 균주들은 TSA(Tryptic Soy Agar)배지로 27℃에서 각각 이틀 배양하였다.
| No. | Scientific name | Sourcea | Hostb | 비고 |
| 1 | X. hotorum pv. carotae | This study | carrot | JJ2001 |
| 2 | X. hotorum pv. carotae | This study | carrot | JJ2004 |
| 3 | X. hotorum pv. carotae | This study | carrot | JJ2006 |
| 4 | X. axonopodis pv. | KACC 10317 | N.D. | N.D |
| 5 | X. campestris pv. zinnia | KACC 17126 | N.D. | Zinnia |
| 6 | X. campestris pv. glycines | KACC 10491 | N.D. | Soybean |
| 7 | X. campestris pv. | KACC 10460 | N.D. | N.D |
| 8 | X. campestris pv. | KACC 10377 | N.D. | N.D |
| 9 | X. axonopodis pv. glycines | KACC 11144 | N.D. | Soybean |
| 10 | X. campestris pv. vitians | KACC 19681 | N.D. | lettuce |
| 11 | X. arboricola pv. pruni | KACC 18153 | N.D. | plum |
| 12 | X. euvesicatoria | KACC 18722 | N.D. | pepper |
| 13 | X. perforans | KACC 16356 | N.D. | Tomato |
KACC: Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea
RDA: Rural Development Administration, Republic of Korea
a Superscript "T" indicates type strain
a N.D., Not determined
(2) 총 DNA의 추출
배양된 균주의 총 DNA를 추출하기 위해, Promega(Madison, WI, USA)사의 genomic DNA 추출 키트 (Wizard® Genomic DNA Purification Kit)를 이용하여 추출하였다.
실시예 2: 특이 프라이머 세트 제작
(1) 특이 염기서열 정보 탐색을 위한 blastn 프로그램 이용 분석
잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)의 유전체 정보 (GenBank accession NZ_CM002307.1, protein ID WP_220655539.1, location= 2448580..2449011)를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하였다(도 1).
(2) 특이 프라이머 제작
잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)에서 RS22715_300F/R 후보 프라이머 세트를 제작하였고, 이는 300 bp 크기의 단편을 증폭하게 디자인하였으며, 프라이머의 서열은 다음과 같다(표 2). 프라이머는 GenBank 등록된 잔토모나스 호토룸(Xanthomonas hotorum) 균주의 가설 단백질(hypothetical protein) 유전자의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인한 후 제작되었다.
| 프라이머 | 염기서열 | 크기 (bp) |
서열
번호 |
| RS22715_300F | '5-TGGCCGGCTGCTCAAAGA-3' | 300 | 서열번호 1 |
| RS22715_300R | '5-CCGCATCCGAATCAGAATACAACT-3' | 서열번호 2 |
실시예 3: PCR 증폭 반응
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler (MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 수행하였고, 각 PCR 증폭을 위한 반응액은 최종 25 ㎕의 양으로 수행하였다. 반응액의 조성은 1X reaction buffer, 0.2 mM dNTP, Forward/Reverse 프라이머 각각 10 pM, 1.25 unit GoTaq® Flexi DNA polymerase (Promega Madison, WI, USA)을 혼합하여 수행하였다. PCR 반응에 사용된 세균의 genomic DNA 양은 20 ng으로 조정하여 수행하였다.
PCR 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 60℃ 30초 및 72℃ 60초로 30회 반복시킨 후 72℃에서 7분간 반응하였다. 증폭 반응 후 10 ㎕의 PCR 산물을 Loading Star염색약(DYNEBIO, Republic of Korea)으로 DNA를 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동한 후 UV transilluminator에서 증폭된 DNA band를 확인하였다.
그 결과, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 에서만 300 bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예4: Real-time PCR 특이성 분석
Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system(Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 수행하였고, 반응은 RS22715-300F/R 프라이머 각각 5 pM을 사용하였으며, 10 ㎕ QGreenBlue 2X Green qPCR Master Mix(CellSafe Bio, Inc., Korea)을 혼합하여, 총 20 ㎕의 Real-time PCR 혼합액으로 수행하였다.
Real-time PCR에 사용된 세균 genomic DNA 양은 NanodropTM NP80 (Implen, Germany)을 사용하여 5 ng로 조정하고 반응에 사용하였다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 60℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, melting curve와 melting peak를 위해 65℃ 내지 95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다.
그 결과, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)에서만 85℃에서 melting peak를 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 5: Real-time PCR 민감도 분석
(1) Genomic DNA의 Real-time PCR
Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system(Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 수행하였다. 각 반응은 QGreenBlue 2X Green qPCR Master Mix(CellSafe Bio, Inc., Korea)와 RS22715-300F/R 프라이머 각각 5 pM을 함유하는 Real-time PCR 혼합액으로, 총 20 ㎕의 양으로 수행하였으며, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) genomic DNA는 5 ng에서 10배씩 희석하였다.
그 결과, 표준 곡선은 Xanthomonas hotorum pv. carotae genomic DNA 표준 희석액의 교차점으로도 알려진 임계값 주기(Ct)에서 생성되었고, 모든 곡선은 R2 > 0.995로 나타났으며, melting peak 결과, 약 85℃의 melting temperature(Tm)에서 증폭된 생성물을 확인하였다(도 4).
(2) Clone DNA의 Real-time PCR
상기 표 1에 기재된 1번 균주의 genomic DNA를 상기 표 2에 기재된 프라이머와 실시예 3에 기재된 PCR 조건을 통해 생성된 PCR product를 pGEMT-easyTM vector(Promega Co., USA)에 클로닝하였다. Clone DNA 양은 약 1 ng에서부터 10배씩 희석하여 검출 한계치를 조사하였다.
그 결과, 표준 곡선은 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) cloned DNA 표준 희석액의 교차점이라고도 알려진 임계값 주기(Ct)에서 생성되었고, 모든 곡선은 R2 > 0.997으로 나타났으며, melting peak 결과, 약 85℃의 melting temperature(Tm)에서 증폭된 생성물을 확인하였다(도 5).
(3) Bacterial cell의 Real-time PCR
박테리아 세포 현탁액(bacterial cell suspension)은 8.10 X 107 CFU/ml이 되도록 조정한 후 10배씩 희석하여 Real-time PCR 혼합액에 첨가하였다. Real-time PCR 증폭 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 60℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, melting curve와 melting peak를 위해 65℃ 내지 95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다.
그 결과, 표준 곡선은 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) bacterial cell 표준 희석액의 교차점이라고도 알려진 임계값 주기(Ct)에서 생성되었고, 모든 곡선은 R2 > 0.997으로 나타났으며, melting peak 결과, 약 85℃의 melting temperature(Tm)에서 증폭된 생성물을 확인하였다(도 6).
또한, standard curve의 R2값과 E값이 적정범위에 있는 것으로 보아 유효한 데이터로 판명할 수 있으며, 박테리아 세포 현탁액에서는 8.10Х105 CFU/ml에서도 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인하였다(표 3).
| Cloned DNA | Genomic DNA | Cell suspension | |||
| Weight/μl reaction mix | Ct ± SD a (n = 3) |
Weight/μl reaction mix | Ct ± SD (n = 3) |
CFU/ml reaction mix | Ct ± SD (n = 3) |
| 5 ng | 22.22±0.07 | 1 ng | 9.31±0.10 | 8.10×107 | 24.28±0.11 |
| 500 pg | 25.59±0.39 | 100 pg | 13.21±0.14 | 8.10×106 | 28.88±0.21 |
| 50 pg | 29.36±0.03 | 10 pg | 17.41±0.19 | 8.10×105 | 33.31±0.18 |
| 5 pg | 32.58±0.26 | 1 pg | 20.94±0.36 | 8.10×104 | 38.03±0.19 |
| 500 fg | 35.46±0.08 | 100 fg | 24.73±0.43 | 8.10×103 | ND |
| 10 fg | 28.32±0.21 | 8.10×102 | ND | ||
| 8.10×101 | ND | ||||
a SD, Three reactions standard deviation.
b N.D., Not detected.
따라서, 상기 Real-time PCR의 민감도 분석을 통해, standard curve의 R2값과 E값이 적정범위에 있는 것으로 보아 유효한 데이터로 판명할 수 있으며, genomic DNA는 5 pg와 cloned DNA는 10 fg, bacterial cell suspension에서는 8.10Х105 CFU/ml에서도 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
결론적으로, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)의 가설 단백질(hypothetical protein) 유전자의 특이 DNA 단편으로부터 제작된 RS22785-257F/R 프라이머는 R. fascians를 특이적인 검출을 위한 PCR 프라이머로 이용이 가능하다는 것을 알 수 있으며, 해당 병징을 DNA 추출과정 없이 시료에서 직접적으로 검출이 가능하다는 것을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Xanthomonas hotorum pv. carotae-specific primer set and method
for detecting Xanthomonas hotorum pv. carotae using the same
<130> PD22-039
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RS22715_300 Forward primer
<400> 1
tggccggctg ctcaaaga 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RS22715_300 Reverse primer
<400> 2
ccgcatccga atcagaatac aact 24
Claims (15)
- 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae)검출용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용되는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)에 사용되는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출용 키트.
- 제5항에 있어서, 키트가 PCR(중합효소 연쇄반응)용인, 키트.
- 제5항에 있어서, 키트가 real-time PCR용인, 키트.
- (i) 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
(ii) DNA 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는,
잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 검출 방법.
- 제8항에 있어서, (i) 단계의 DNA 증폭 반응이 real-time PCR인, 방법.
- 제8항에 있어서, (i) 단계에 있어서 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, (i) 단계의 DNA 증폭 반응이 PCR인, 방법.
- 제8항에 있어서, (ii) 단계의 DNA 증폭 산물의 검출이 전기영동에 의해 수행되는, 방법.
- 제12항에 있어서, 표적 유전자의 증폭 여부는 300 bp 크기의 단편의 증폭 여부를 통해 확인하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료에 대해서 real-time PCR을 수행하는 단계; 및 상기 real-time PCR에 의한 유전자 증폭 결과를 분석하는 단계를 포함하는, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 진단 방법.
- 제14항에 있어서, 잔토모나스 호토룸 병원형 카로데아(Xanthomonas hotorum pv. carotae) 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA의 분리 과정 없이 시료 자체에 real-time PCR이 수행되는, 방법.
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| KR20100048028A (ko) | 2008-10-30 | 2010-05-11 | 주식회사 씨젠 | 식물 감염성 세균 또는 곰팡이 검출용 올리고뉴클레오타이드 |
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