KR101471158B1 - 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용되는 푸자리움 그래미니아룸 검출용 올리고 뉴클레오티드 및 이를 포함하는 검출용 키트 - Google Patents
정량적 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용되는 푸자리움 그래미니아룸 검출용 올리고 뉴클레오티드 및 이를 포함하는 검출용 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 다양한 조건하에서 qRT-PCT에 사용되는 정규화된 푸자리움 그래미니아룸 검정 유전자에 상보적인 올리고뉴클레오티드(프라이머)및 이를 포함하는 상기 균을 효과적으로 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 다양한 조건 하에서 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용되는 푸자리움 그래미니아룸 검정 유전자에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 및 서열번호 17 및 18;로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용되는 푸자리움 그래미니아룸 검출용 프라이머 세트인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 프라이머 세트는 길이 15 ~ 30 뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 푸자리움 그래미니아룸 검출용 키트를 제공하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 푸자리움 그래미니아룸 검출용 올리고뉴클레오티드를 이용하면, 균사체 성장단계, 유성생식단계, 곰팡이독소 생성단계(AG) 등 다양한 조건하의 푸자리움 그래미니아룸 균을 효과적으로 검출할 수 있으며, qRT-PCR를 이용하여 정규화된 검출에 적합한 검정 유전자를 밝혀 이에 상보적인 프라이머를 이용하여 상기 균을 보다 빠르고 신속하게 검정할 수 있다.
Description
본 발명은 푸자리움 그래미니아룸을 검출하기 위한 최적의 검정 유전자에 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다양한 조건하에서 qRT-PCT에 사용되는 정규화된 푸자리움 그래미니아룸 검정 유전자에 상보적인 올리고뉴클레오티드(프라이머)및 이를 포함하는 상기 균을 효과적으로 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.
사상균 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum , 완전세대: Gibberella zeae)은 중요한 곡물 병원균이며, 인간 및 동물에게 해로운 진균독을 생산한다(M. McMullen, et al, Plant Dis. 81 (1997) 13401348). 붉은 곰팡이독소를 생산하는 균류로서, Fusarium graminearum , F. culmorum , F. tricinctum 등이 대표적 균종이고, 균의 집락은 빨간색을 나타내는 것이 특징이다. 이들 중에서 가장 중요한 균종은 곡류의 붉은곰팡이병균인 F. graminearum 이고, 트리코데센류, 제아랄레논, 부테놀리드 등을 동시에 생산하는 균주가 많다. 식물병원성이 있다는 점에서 때로는 보리, 옥수수 등의 작물포장이 광범위하게 붉은곰팡이 독소의 오염으로 중독을 일으키는 경우가 있다.
균사체 성장, 유성생식과정(sexual development), 발아과정(germination) 및 발병과정(pathogenesis)과 같은 다양한 발달 과정 및 생리적인 조건 하에서 DNA 마이크로어레이를 이용하여 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 완전한 게놈 시퀀싱이 게놈 전체의 발현 프로파일링에 참작이 되었다. 이러한 연구에서 마이크로 어레이 데이타가 qRT-PCR에 의해 확인되지 않았음에도 불구하고, 유전자 발현 프로파일 이나 기능적인 연구들로부터 확인된 유전자의 특정 발현 패턴을 얻는데 가장 흔한 방법이 되어왔다.
정량적 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)은 관심 대상의 개별 타겟 유전자의 mRNA 발현 수준을 정량화하기 위한 가장 민감하고, 특이적인 방법이다. qRT-PCR 발현 분석은 다른 전통적인 방식에 비해 여러 가지 장점을 가지나, 그 발현에 있어, 연구 조건에 걸쳐 영향을 받지 않는 적합한 검정 유전자(reference genes)로 데이터 정규화할 것을 필요로 한다. 리보좀 유전자 및 그를 발현하는 액틴, 베타-튜블린(BTUB) 및 전자신장인자(EF1) 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH)와 같은 기초적인 세포기능에 관여하는 여러 개의 하우스키핑 유전자(housekeeping genes)가 인간 및 다른 모델 조직에서 qRT-PCR에 대한 검정유전자(reference genes)로 사용되어 왔다. 그러나, 연구하고자 하는 조직에 특이적인 실험 조건하에서 qRT-PCR발현에 대한 후보 검정 유전자(candidate reference genes)를 검정할 필요가 있다.
중요한 균류의 유전자 발현 분석하는데 흔히 qRT-PCR이 사용됨에도 불구하고, 본 균류에 대한 qRT-PCR 데이터의 표준화에 대한 상세한 검정 유전자(reference genes)의 확인 작업이 수행된 적이 없어서, 균류의 확인과정이 쉽지 않아 어려움이 있었다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 다양한 조건하에서 qRT-PCT을 이용하여 붉은 곰팡이균인 Fusarium graminearum를 효과적으로 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 다양한 조건하에서 qRT-PCT을 이용하여 붉은 곰팡이균인 Fusarium graminearum를 효과적으로 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 상기 균의 검출용 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
따라서, 본 발명의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용되는 푸자리움 그래미니아룸 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16 및 서열번호 17 및 18을 모두 포함하는 프라이머 세트로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 바람직한 일 실시예에 따르면, 서열번호 19 내지 23 중 어느 하나의 프라이머를 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트는 길이 15 ~ 30 뉴클레오티드를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 푸자리움 그래미니아룸 검출용 프라이머 세트를 포함하는 푸자리움 그래미니아룸 검출용 키트를 제공한다.
또한, 바람직한 일 실시예에 따르면, 서열번호 19 내지 23 중 어느 하나의 프라이머를 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트는 길이 15 ~ 30 뉴클레오티드를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 푸자리움 그래미니아룸 검출용 프라이머 세트를 포함하는 푸자리움 그래미니아룸 검출용 키트를 제공한다.
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본 발명의 푸자리움 그래미니아룸 검출용 올리고뉴클레오티드를 이용하면, 균사체 성장단계, 유성생식단계, 곰팡이독소 생성단계 등 다양한 조건하의 푸자리움 그래미니아룸 균을 효과적으로 검출할 수 있으며, qRT-PCR를 이용하여 정규화된 검출에 적합한 검정 유전자를 밝혀 이에 상보적인 프라이머를 이용하여 상기 균을 보다 빠르고 신속하게 검정할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 검정된 후보 검정 유전자를 나타낸 표이다.
도 2는 CM 액체 배지에서 후보 검정 유전자의 Ct 값을 나타낸 표이다.
도 3은 당근 배지에서 후보 검정 유전자의 Ct 값을 나타낸 표이다.
도 4는 AG 액체 배지에서 후보 검정 유전자의 Ct 값을 나타낸 표이다.
도 5는 geNorm에 의해 측정된 발현 안정도(M 값)에 기초한 정규화를 위한 후보 검정 유전자의 순위를 나타낸 표이다.
도 6은 NormFider에 의해 측정된 발현 안정도에 기초한 정규화를 위한 후보 검정 유전자의 순위를 나타낸 표이다.
도 2는 CM 액체 배지에서 후보 검정 유전자의 Ct 값을 나타낸 표이다.
도 3은 당근 배지에서 후보 검정 유전자의 Ct 값을 나타낸 표이다.
도 4는 AG 액체 배지에서 후보 검정 유전자의 Ct 값을 나타낸 표이다.
도 5는 geNorm에 의해 측정된 발현 안정도(M 값)에 기초한 정규화를 위한 후보 검정 유전자의 순위를 나타낸 표이다.
도 6은 NormFider에 의해 측정된 발현 안정도에 기초한 정규화를 위한 후보 검정 유전자의 순위를 나타낸 표이다.
본 발명은 균사체 성장, 유성생식과정(sexual development) 및 진균독 생산(mycotoxin production)과 같은 다양한 조건하에서 qRT-PCR 데이터의 정규화를 위해 적합한 F. graminearum 검정유전자(reference genes)을 밝히는 위한 것이다.
본 발명자는 이전의 연구들에서 사용되어온 흔히 사용하는 하우스키핑 유전자와 F. graminearum 종의 전체 전사체 시퀀싱(RNA-seq)으로부터 선택되는 새로운 유전자 세트(공개되지 않음)을 포함하는 15개의 후보 검정(candidate references)을 선택하였다. 3가지의 다른 알고리즘(geNorm, NormFinder 및 BestKeeper)을 이용하여 다양한 조건하에서 이러한 유전자들의 발현에서의 변이를 비교함으로써, 본 발명자는 이후의 발현 연구에 사용될 수 있는 적합한 검정 유전자(reference genes)를 동정하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 예시적인 것으로 이 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위에서 제시된 실시예에 대한 다양한 변형 및 수정 발명을 만들 수 있을 것이다. 이러한 변형 및 수정 발명에 의하여 본 발명의 범위는 제한되지 않는다.
균의 종류 및 성장 조건 : 본 연구에 사용된 F. graminearum PH-1종은 F. graminearum 종 군집의 7혈통에 속하며, 그 게놈은 서열분석이 되었다(참조, http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_graminearum/MultiHome.html). 이는 -80℃에서 보관된 25% 글리세롤 보존배지로부터 회수되었으며, 감자 덱스트로오즈 아가에서 보관되었다(PDA; Difco Laboratories, Detroit, MI). 본 발명자는 4가지 다양한 배양 조건을 조사하였다. 상기한 바와 같이 수행된 완전액체배지(CM)에서 균사체 성장은 질소가 풍부한 조건하에서의 균사체(초목)의 성장을 나타낸다. 당근배지는 F. graminearum 에서 유성생식 단계를 나타내며, 2가지의 다른 발달단계에 적합하다. 당근배지의 처음 6일간의 성장은 질소부족 조건하에서의 기중 균사체(aerial mycelia)의 형성을 나타내며, 이는 유성생식단계의 선행단계이다. 동일한 배지에서의 이후의 6일간의 성장은 앞서 기술한 바와 같이, 유성 포자(자낭각)의 형성을 나타낸다.
상기한 바와 같이 수행된 아그마틴(AG)으로 보정된 한정된 액체배지에서의 균사체 성장은 트리코데센(trichthecne)의 생산을 나타내며, 독소 축적이 6-7일째에 가장 높다. 각 성장 조건에서의 RNA추출에 대한 시기는 다음과 같다: CM 배지에서 2, 4, 6일째; 당근배지에서 6일동안 성장된 기중균사체를 제거한 후 당근배지에서 2, 4, 6일째; AG 액체배지에서 3, 6일째.
RNA 추출 : 균의 균사체 또는 자낭각(perithecia)은 각각의 선택된 시간에 각 배지로부터 채집하였다. 샘플의 전체 RNA는 제조자의 프로토콜에 따라 전체 RNA 추출키트(iNtRON Biotechnolgy, Korea)를 이용하여 추출되었다. 모든 RNA 샘플은 아가로오즈 겔 전기영동에 의해 분석되었으며, 260 nm/280 nm 흡광도 비율(1.8~2.0)에서 자외선 분광강도계(ultraviolet spectrophotometry를 이용하여 정량화되었다. cDNA의 첫번째 가닥은 PrimeScript RT reagent kit (TaKaRa, Japan)를 이용하여 전체 RNA로부터 합성되었다.
검정 유전자, 프라이머 디자인 및 PCR 효율 테스트 : 15개의 후보 검정유전자가 선택되었다(도 1). 7개는 데이터 정규화를 위해 참조로 흔히 사용되는 일반적인 하우스키핑 유전자의 F. graminearum이 이종상동유전자(orthologs)이다.
남은 8개는 RNA 서열 분석에 의해 각각의 mRNA의 리드 빈도(read frequencies)에 근거하여 F. graminearum PH-1 게놈으로부터 선택되었으며, 각각은 상기한 다른 조건하에서, 동일한 수준으로 계속 발현된다(데이터 미도시). 새롭게 선택된 후보 유전자의 프라이머는 PrimerSelect 프로그램(DNASTAR, Madison, WI)을 이용하여 디자인되었고, 하우스키핑 유전자에 흔히 사용되는 것들은 공개된 문헌으로부터 직접적으로 얻은 것이다(도 1).
모든 유전자의 증폭 효율은 각 조건에서 하나의 시간으로부터 RNA 샘플을 사용하여 결정되었으며, 이후, 연속한 10배 cDNA 희석 곡선의 기울기 분석을 실시하였다(도 1).
정량적 실시간 PCR 및 데이터 분석 : qRT-PCR은 SYBR Green Super Mix (Bio-Rad, USA)및 실시간 PCR 시스템(Eppendorf Mastercycler ep realplex4, Germany)으로 수행되었다. 각 사이클에서 SYBR Green 염색의 형광의 변화는 시스템 소프트웨어로 모니터하였으며, 각 반응의 배경에 대한 한계사이클 (threshold cycle, Ct)을 계산하였다. 각 후보 검정 유전자의 발현 안정성은 3가지 마이크로소프트-엑셀 기반의 통계적 툴(geNorm, NormFinder 및 BestKeeper)을 이용하여 분석되었다.
유전자 발현은 각 조건(생물학적 복제)에서 각 시간 포인트로부터 2가지 분리된 샘플에서 측정되었다. 각 개별 반응은 트리플리케이트(기계적 복제)로 수행되었다. 각 트리플리케이트의 평균 Ct값은 이후의 geNorm 및 NormFinder 분석을 위해 1차 발현(linear expression)으로 변환되었다.
<실험결과> 후보 유전자 발현 분석
qRT-PCR 프라이머는 91 ~250 bp의 앰플리콘(amplicons)를 생성한다(도 1). 상기 프라이머 세트(BTUB 제외)의 평균 PCR 효율은 1.95~1.99 범위이다. 세 개 유전자(EF1B, UBC 및 CYP)의 표준편차는 0.05 보다 약간 높았음에도 불구하고, 모든 유전자의 E 값 평균은 이론적 최적 수준인 2에 가까웠다.
본 발명자는 또한, 모든 유전자의 실시간 녹는점 곡선 분석에서 단일 피크를 관찰하였다(데이타 도시 안함). 따라서, 모든 프라이머에 의한 유전자 특이적 증폭이 확인되었다. 모든 이후의 데이터에서, BTUB는 기대 이상의 높은 E 값(0.92)를 나타내었기 때문에, 신뢰할 만한 것으로 고려되지 않았다. 이는 BTUB 뉴클레오티드 서열에서 3번째 인트론 영역을 감싸고 있는 역 프라이머의 위치 때문일 것이다. 상기 샘플의 증폭 곡선으로부터 얻어진 Ct값을 [도 2~4]에 나타내었다. 평균 Ct값은 17(17 (for CYP2) 에서 25(GzC2H044)를 나타내었다. 다양한 조건 하에서, 후보 검정 유전자 발현의 변이는 geNorm, NormFinder 및 BestKeeper에 의해 분석되었다.
BestKeeper 분석(http://www.gene-quantification.de/bestkeeper.html):
BestKeepr 툴은 각 검정 후보 유전자의 유도된 Ct값의 표준편차(SD) 및 유전자의 변동계수(coefficient of variation)로서 발현의 변이를 표현한다. 다양한 조건하에서 가장 안정적으로 표현된 유전자에 대해 낮은 SD가 예측된다.
BestKeepr 툴은 각 검정 후보 유전자의 유도된 Ct값의 표준편차(SD) 및 유전자의 변동계수(coefficient of variation)로서 발현의 변이를 표현한다. 다양한 조건하에서 가장 안정적으로 표현된 유전자에 대해 낮은 SD가 예측된다.
유전자들(EF1B 및 GAPDH 제외)의 SD 값은 CM 액체 배지에서 6일의 균사체 성장 단계 동안 1.0 (2배 변이)보다 높지 않았다. 이러한 조건하에서 낮은 발현 수준을 가진 유전자는 GzC2H044로 0.24의 표준 편차를 가지는데, 이는 발현에서 1.18배 허용가능한 변화를 나타내는 것이다. GzUBH 및 GzFLO 의 발현도 또한 동일하게 변화한다(표 1).
6일간의 당근 배지의 균사체 성장 조건에서, EF1A 는 표준편차 0.16으로 가장 안정적인 유전자였으며, 다음으로, GzRPS16, EF1B, GzSNC1, GzUBH 및 GzRBP1 였다; 나머지 유전자들은(BTUB 제외) 여전히 2배 범위(SD<1.0) 내에서 발현된다(표 2).
당근배지에서 자낭각 유도 단계하에서 유전자 발현의 변이는 당근 배지에서 균사체 성장 조건하에서 보다 대략 2배 높다. 이러한 조건하에서 가장 안정적인 유전자는 GzRPS16 (SD=0.46)이며, 다음은 EF1A, GzFLO이었다. 4개의 유전자(GzDGA, GzC2H044, GAPDH, 및 GzRBP1) 1.3 이상의 SD 값을 나타내었다(표 2).
당근 배지에서 전체 유성생식 단계에 걸쳐 분석한 경우에는 GzRPS16 (SD=0.37)가 가장 안정적이었으며, GzFLO 와 GzSNC1 가 뒤를 이었다(표 2). 6일간의 트리코데센 생산 조건하에서 GzRBP1 (SD=0.32)가 가장 안정적이었다. GzRPS16, EF1A, 및 GzRBP1 는 0.4 이하의 SD 값을 나타내었다(표 1).
모든 조건을 결합한 경우, 3 개의 유전자(GzUBH, GzRBP1, 및 UBC) 가 동일한 SD 수준을 나타내었음에도 불구하고(표 3), 가장 안정적인 유전자는 EF1A (SD=0.64)이었다.
geNorm 분석 : 이 알고리즘은 다른 모든 검정 유전자와 비교하여 한 검정유전자에서의 쌍별(pairwise) 변이(V)를 결정함으로써, 상기 검정 유전자의 안정도(M 값)를 정의하며, 이는 정규화를 위한 최적의 검정 유전자의 선택을 가능하도록 한다. 가장 낮은 M 값을 갖는 유전자는 가장 안정적으로 발현된다. 각각의 조건하에서, 후보 검정 유전자 및 최적의 검정 유전자쌍의 순위를 표 1 및 도 5에 나타내었다.
높은 순위의 유전자는 가장 높고, 다음으로 높은 검정 목표 안정성(각각 평균 M = 0.2, M=0.5)를 나타내며, 이는 검정 유전자가 안정적으로 발현될 때 또는 샘플의 상동 세트에서 후보 검정 타겟을 측정할 때에 전형적으로 나타난다(J. Hellemans, et al, Genome Biol. 8 (2007) R19).
CM에서 모든 유전자는 낮은 M 값(M=0.5의 디폴트 한계 이하)을 갖는 높은 발현 안정성을 가지며, 가장 안정적인 유전자는 GzUBH (M=0.12)이며, 다음으로 GzFLO 와 UBC 였다. GzFLO 와 GzUBH, 사이의 0.047의 낮은 V 값은 0.15의 일반적인 컷오프(cut-off) 한계점보다 훨씬 낮은 것으로서, 이러한 유전자들이 정규화를 위한 참조로서 사용될 수 있음을 나타낸다(표 1).
당근 배지에서 유성생식 발달단계 동안, 당당근 배지에서 유성생식 발달단계 동안, EF1A 와 GzRPS16, 및 CYP1와 GzRPS16이 각각 6일간의 영양 성장(vegetative growth) 및 이후의 자낭각 생산단계(perithecial production stages)에 걸쳐 가장 안정적인 쌍이다. 2가지의 단계가 결합되었을 경우, GzRPS16 와 EF1A 가 검정유전자의 가장 좋은 결합이다(표 2). 이들은 모두 결합된 조건하에서, 가장 좋은 검정 유전자 결합으로 밝혀졌다(표 3). 결합된 데이터 세트에 대해, UBC 와 GzHSP70에서 쌍별 변이는 0.15 이상이었으므로, 세번째 유전자(GzRPS16)는 유전자의 발현을 정규화하기 위해 부가되었다(표 3).
NormFinder 분석 : geNorm 알고리즘과는 달리. NormFinder는 그룹들간의 유전자 발현의 안정성에 기초하여 후보 유전자 세트 간의 최적의 검정 유전자를 밝히는 것으로서, 최적의 검정유전자는 도 6에 나타내었다.
NormFinder 분석 : geNorm 알고리즘과는 달리. NormFinder는 그룹들간의 유전자 발현의 안정성에 기초하여 후보 유전자 세트 간의 최적의 검정 유전자를 밝히는 것으로서, 최적의 검정유전자는 도 6에 나타내었다.
CM 조건하에서, 8개의 유전자는 0.1 이하의 발현 안정성 값을 가진다. 가장 안정적인 유전자는 GzFLO 이며, GzRPS16 와 GzRBP1 가 뒤이었다. 2개의 유전자가 정규화에 참조로서 사용되었을 경우, GzFLO 와 GzRPS16가 단일의 가장 안정적인 유전자의 값(GzFLO, 안정성 값, 0.011)보다 적은 안정성 값(0.009)를 가지기 때문에, 가장 좋은 결합이다(표 1).
당근 배지에서 영양 성장(vegetative growth)동안, 3개의 유전자가 0.2보다 낮은 안정성 값을 나타내었다. 가장 안정적인 3개의 유전자는 GzSNC1, EF1A 및 GzRPS16 이며; GzSNC1 와 EF1A는 가장 좋은 결합이다.
자낭각 유도 단계 동안, UBC 만 0.2 이하의 값을 가졌으며, 다음으로 GzUBH이었다; 이러한 유전자들은 0.104 값을 가진다(표 2). 유성생식에 대한 결합 데이터 세트에 대해서, UBS 는 가장 안정적으로 발현되는 유전자로 1순위로 랭크되었으며(>0.2), 다음으로는 EF1A와 GzUBH 이었으나, 2순위 및 3순위 유전자의 결합(EF1A와 GzUBH)은 UBC의 순위의 안정성 값보다 낮은 값을 나타내었다(표 2).
AG 조건하에서, GzC2H044 와 EF1A는 가장 좋은 유전자로 나타났으나, EF1A 와 8순위의 GzUBH 유전자(SV=0.297)는 최적의 검정 쌍(reference pair)으로 확인되었다(표 1). 모든 조건을 결합했을 때, 검정 유전자 순위는: GzUBH > EF1A > CYP1 이다(표 3).
3가지 프로그램의 결합에 의한 최적의 후보 검정 유전자 동정 : geNorm과 NormFinder로부터 나온 데이터는 모두 동일한 입력데이터(1차 발현 값)를 사용하기 때문에 쉽게 비교될 수 있는 반면, BestKeeper의 데이터는 Ct 값을 사용하기 때문에 다를 수 있다. 그럼에도 불구하고, 각 분석에 의해 가장 안정적인 톱 3 유전자로부터 가장 좋은 검정 유전자를 선택하는 것이 가능하다.
CM에서, GzFLO 는 가장 좋은 검정 유전자로서 동정되었다(BestKeeper에서 세번째, geNorm에서 두번째, NormFinder에서 첫번째). 다음으로, GzUBH는 BestKeeper에서 두번째, geNorm에서 첫번째, NormFinder에서 다섯번째로서, 2순위로 나타났다.
마찬가지로, EF1A와 GzRPS16는 당근 배지에서, 영양 및 자낭각 유도 조건 모두에서 안정적으로 발현되었다. 이러한 두가지 유전자도 모두 AG 조건하에서, 최상의 검정 유전자로 동정되었다.
모든 조건을 결합했을 때, GzUBH (BestKeeper에서 두번째, geNorm에서 세번째, NormFinder에서 첫번째) 및 EF1A(BestKeeper에서 첫번째, geNorm에서 다섯번째, NormFinder에서 두번째)가 가장 안정적이다. GAPDH는 대부분의 조건하에서, 가장 덜 안정적으로 발현되는 것 중의 하나다.
본 발명은 사상균류에는 거의 알려져 있지 않던 qRT-PCR에 대한 최적의 검정 유전자(reference genes)를 선택하기 위한 다양한 배양 조건, 후보 유전자 및 알고리즘을 검정하였다. 본 발명에서 시험된 조건은 균류의 발달 및 생리학적 상태에 기초하여 다양한 카테고리로 나누어질 수 있다.
CM 및 AG 및 당근 아가에서의 조건은 F.graminearum의 균사체 성장에서만 유리하다; 무성생식 포자형성과정, 유성 자실체 형성(sexual fruiting body formation) 및 유성생식 포자형성과정과 같은 다른 발달과정에서는 촉진되지 않을 수 있다. 그러나, 생리적, 신진대사 상태는 이러한 조건들 가운데 다양하다.
CM에서는 많은 영양분의 사용과 연관된 신진대사 과정이 관여하는 반면, 당근 아가에서는 생식 재생산 모드로 변환하기 위한 전제조건으로 여겨지는 질소 부족(nitrogen starvation)에 적응하기 위한 신진대사과정이 관여한다.
AG 액체 배양은 특히 트리코데센(trichothecene)과 같은 여러 이차 대사산물을 생산하는 과정을 촉진한다. 반면에, 당근 아가에서 자낭각의 형성은 균류 발달과정의 관점에서 비균질적이다. 이것이 F.graminearum 에서 전형적인 유성생식과정을 나타냄에도 불구하고, 기초 균사체와 마찬가지로, 무성생식 포자를 포함한다. 배양 조건뿐만 아니라, 본 발명자들은 각 조건하에서 두-세 가지의 시간 포인트를 모니터링함으로써, 유전자 발현에서 시간 코스별 변이를 분석하였다. 이러한 다양한 조건은 F.graminearum 에서 1차 발달 및/또는 생리학적 단계를 나타내기 때문에, 이는 본 발명에서, 검정 유전자의 신뢰도를 증가시킨다. 본 발명에서 검정된 상기 후보 검정 유전자는 이 전의 연구들보다 수와 클래스의 측면에서 더 다양하다.
다양한 조직에서 내생 제어요소로 사용되는 일곱개의 하우스키핑 유전자는 3가지 알고리즘을 이용하여 다양한 조건하에서, 동시에 분석되었다. 대부분의 F.graminearum 연구에서, 액틴, BTUB, EF1A, EF1B 또는 18S rRNA와 같은 하나의 하우스키핑 유전자만이 면밀한 검정 없이 내부적인 대조군으로서 사용된다. Lysoe, et al은 BestKeeper를 이용하여 3가지 하우스피킹 유전자(BTUB, EF1A 및 UBC)를 검정하였으나, 상세한 데이터를 제공하지는 못하였다(E. Lysoe, et al, Phytopahtology 99 (2009) 176-184]).
본 연구의 결과는 qRT-PCR의 분석에서 내부적 대조군으로서, 하우스키핑 유전자의 신뢰성에 의문을 갖는다. 본 발명자는 동물에서 이전에 증명된 바와 같이, GAPDH 가 적합하지 않은 검정 유전자임을 밝혀내었다(R.D. Barber et al. Physiol. Genomics 21 (2005) 389-395). 또한, ef1B, CYP1 및 CYP2 와 같은 다른 하우스키핑 유전자는 특정 성장 조건하에서 가장 안정적이지 않은 유전자들에 랭크되었다. 단지 두 가지 하우스키핑 유전자(EF1A 및 UBC)만 모든 조건하에서, 상대적으로 안정적인 발현패턴을 나타내었다.
8개의 새로운 후보 유전자 중에서, 3가지는 하우스키핑 유전자와 동일한 발현 안정성을 가졌다. 흥미롭게도 3개의 유전자 중 2개는 흔히 사용되는 하우스키핑유전자와 동일한 특징을 나타내며, 이는 RNA-서열 데이터를 이용하여 새로운 검정 유전자를 선택하기 위한 과정의 신뢰도를 지지한다. 유비퀴틴 카르복실-말단 하이드로라제 도메인을 운반하는 가상적인 단백질로 설명되는 GzUBH 는 F. graminearum에서, 탈유비퀴틴화(폴리유비퀴틴화된 펩티드로부터 유비퀴틴 분자를 제거하는 과정)에 관여할지도 모른다.
유비퀴틴-접합 효소를 코팅하는 UBC 유전자가 F. graminearum 에서, 를 포함한 다양한 생물체에서 검정 유전자로서 자주 사용되기 때문에, 유비퀴틴-관여 단백질 분해 과정에 관여하는 GzUBH 와 같은 다른 유전자가 F. graminearum와 다른 조직체에서 여러 다른 조건하에서 안정적으로 발현될 수 있다. GzRPS16는 미토콘드리아의 리보솜 단백질 S16로 설명될 수 있으며, 인간의 하우스키핑유전자의 특징을 나타낸다(E. Eisenberg, et al, Trends Genet. 19 (2003) 362-365). 또한, 리보솜 단백질 S4는 균근 균류(mycorrhizal fungus)에서 qRT-PCR을 위한 검정 유전자로서 사용되어 왔다.
RPS3와 RPS18는 균류에 감염된 붉은 밀가루 갑충(red flour beetle)에서 가장 안정적으로 발현된다(J.C. Lord, et al, J. Microbiol. Methods 80 (2010) 219-221). 이들 유전자와는 반대로, GzFLO 는 세포 표면의 플로큘린(flocculin)과 유사한 가상의 단백질로서, 다른 조건하에서는 안정적이지 않기 때문에, CM 조건에 특이적인 훌륭한 검정 유전자이다.
본 연구는 F. graminearum 에서 뿐만 아니라, 다른 사상균에서 검정 유전자로 기능할 수 있음을 보여주고 있다. 또한, 이들 유전자는 본 연구에서 시험한 3가지 조건이 F. graminearum 에서 1차적인 생리적 과정을 나타내기 때문에 본 연구에서 관찰되지 않은 다른 조건에서도 적용될 수 있다. 그러나, 이들 유전자의 인플란타(in planta)가 필요하다.
본 발명에서는 전술한 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, HKG) 및 전체 전사체 서열 데이터로부터 선택되는 유전자를 포함하는 15개의 후보군 유전자를 검정유전자(reference gene)로 감정하였다. 3가지의 통계학적 알고리즘(BestKeeper, geNorm 및 NormFinder)의 조합에 의해, 각각 최적의 균사체 성장, 유성 생식(sexual development) 및 트리코데센(trichthecne) 진균독 생성 환경하에서 이러한 유전자들의 발현 변이를 분석하였다. 유리한 균사체 성장(mycelial growth)하에서 GzFLO 및 GzUBH 발현이 완전배지에서 가장 안정적이었다. EF1A와 GzRPS16 발현은 균사체 성장(mycelial growth) 및 이후의 자낭각 유도단계(perithecial induction stage)를 포함한 당근배지의 모든 조건 하에서 대체적으로 안정적이었다. 이러한 2개의 유전자는 모두 트리코데센(trichthecne, 진균류독소) 생산과정 동안에도 가장 안정적이었다. 결합된 데이터 세트로서는, GzUBH(서열번호 3 또는 서열번호 4) 와 EF1A(서열번호 20)가 가장 안정적인 것으로 선택되었다. 따라서, 이러한 유전자들은 F. graminearum 및 다른 관련 균류의 유전자 발현 분석을 위한 qRT-PCR의 정확한 정규화를 위해 적합한 검정 유전자(reference genes)이다.
<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation
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Fusarium graminearum under different culture conditions and the
kit comprising the same
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- 제1항의 프라이머 세트는 길이 15 ~ 30 뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용되는 푸자리움 그래미니아룸 검출용 프라이머 세트.
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| Vinod Kumar 등. Australian Journal of Crop Science. Vol. 5, No. 11, 페이지 1455-1468 (2011.10.) * |
| Vinod Kumar 등. Australian Journal of Crop Science. Vol. 5, No. 11, 페이지 1455-1468 (2011.10.)* |
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