KR102444745B1

KR102444745B1 - Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별방법

Info

Publication number: KR102444745B1
Application number: KR1020180113928A
Authority: KR
Inventors: 정원형; 남영도; 임미영; 이소영; 박용수; 강지수
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2022-09-19
Also published as: KR20190063376A

Abstract

본 발명은 Lactobacillus acidophilus 균주 및 Lactobacillus acidophilus LA1 균주 판별용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 빠르고 간편하게 해당 균주를 확인할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것이다.

Description

Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별방법{composition for identification of Lactobacilus acidophilus strain and method of determination thereof}

본 발명은 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 빠르고 간편하게 해당 균주를 확인 할 수 있는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것이다.

우리 인체는 외부 병원균의 침입을 막기위한 장관벽의 물리적 화학적 방어 시스템(defense system)을 구축하고 있다. 장관벽의 물리 화학적 방어 시스템 외에 장내에 존재하는 장내미생물 또한 숙주로의 외부 병원균의 침입을 막기 위해 박테리오신(Bacteriocin)과 같은 항생물질을 생산하거나, 단쇄지방산(short chain fatty acids:SCFA) 생산을 통한 pH 조절, 병원균 유전자 발현의 직접 관여를 통해 병원균의 증식을 방어한다. 또한 장내미생물은 숙주의 면역 시스템을 자극함으로서 외부 병원균에 대한 감수성을 높이고, 장관벽의 활성을 자극하는 등의 간접적인 방법으로 병원균 침입을 방어하는데 일조하고 있다.

이러한 장내미생물의 붕궤(dysbiosis)는 E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Clostridium difficile과 같은 병원균 감염에 직간접적으로 관련있는 것으로 보고 되고 있으며, 병원균 감염으로 인한 항생제 사용은 오히려 장내미생물의 붕궤를 가속시키고 이로인해 추가적인 항생제 내성의 2차 병원균 감염을 유발할 수 있다.

최근에는 프로바이오틱스의 Escherichia, Klebsiella, Shigella, Enterobacter, Pseudomonas, Clostridium, Helicobacter 등과 같은 병원균 감염에대한 예방 및 치료 효과가 보고되고 있으며, 프로바이오틱스의 사용은 장내미생물의 붕궤 없이 병원균의 침입을 효과적으로 막을 수 있는 대안으로 각광받고 있다.

한국의 유제품에서 분리된 Lactobacillus acidophilus LA1은 Salmonella 감염 예방에 효능을 가지는 프로바이오틱스로 향후 상업적인 활용이 클 것으로 기대되나, 병원균 감염 예방의 기능을 가지는 Lactobacillus acidophilus LA1의 균주만을 구별할 수 있는 선택 판별 마커는 존재하고 있지 않다.

미생물 종(species) 판정에 가장 중요하게 사용되는 16S rRNA 유전자 염기서열 정보로는 현재까지 상용화 되었거나 의약학적으로 중요한 Lactobacillus acidophilus 균주들(ex: L. acidophilus NCFM, Lacidophilus La-14, L. acidophilus FSI4)을 구분할 수 없기 때문에, 타 Lactobacillus acidophilus 균주가 Lactobacillus acidophilus LA1으로 사용된다거나, 혹은 상용화 제품이 Lactobacillus acidophilus LA1을 제대로 포함하고 있는지 등의 확인이 매우 어렵고, 설사 가능하더라도 각 샘플을 일일이 전체 게놈 정보를 분석하여야 하는 번거롭고, 민감하며 장시간이 필요한 실험을 거쳐야 비로소 확인이 가능하다.

따라서 빠르고 간편하게 해당 균주를 확인 할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

특허문헌 1. 대한민국 등록특허 제10-1771697호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 서열번호 1, 2로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 키트를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 Lactobacillus acidophilus 균주를 판별하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 1로 기재되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물을 제공한다.

상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 조성물을 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 키트를 제공한다.

상기 키트는 완충용액, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, a) 판별 대상 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및

b) 상기 PCR 산물을 분석하는 단계;를 포함하는 Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 판별하는 방법을 제공한다.

상기 PCR 산물은 150 내지 250bp인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 대상 시료로부터 Lactobacillus acidophilus 균주 존재유무를 신속하고 간편하게 검출할 수 있고, Lactobacillus acidophilus에 속하는 4종 strain(L. acidophilus NCFM, Lacidophilus La-14, L. acidophilus FSI4 및 L. acidophilus LA1)를 각각 특이적으로 검출할 수 있으면서, 이 중에서도 L. acidophilus LA1만을 정확하고 쉽게 확인가능한 효과가 있다.

도 1은 실시예 2를 통해 분석한 Lactobacillus acidophilus LA1의 전체 게놈 구성도이다.
도 2a는 실시예 3을 통해 확인한 Lactobacillus acidophilus LA1를 비롯한 10종 균주의 16S rRNA 유전자를 활용한 계통도이다.
도 2b는 실시예 3을 통해 확인한 Lactobacillus acidophilus LA1비롯한 10종 균주의 ANI genome 비교를 활용한 계통도이다.
도 3은 실시예 3을 통해 확인한 Lactobacillus acidophilus LA1를 비롯한 10종 균주들 중에서, L. acidophilus NCFM, Lacidophilus La-14, L. acidophilus FSI4 및 L. acidophilus LA1의 CRISPR 구조 분석 결과이다.
도 4는 L. acidophilus LA1를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트와 상기 프라이머 세트로 PCR하였을 때 인 실리코 분석(in silico)을 통해 각 균주의 PCR 산물 크기를 도시화한 것이다.
도 5는 인 실리코(in silico)에서, 본 발명의 L. acidophilus LA1 균주 판별용 프라이머 세트를 NCBI 사이트로부터 제공되는 데이터베이스와 대조하여, BLASTN 검색으로 sequence를 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 L. acidophilus LA1 균주 판별용 프라이머 세트를 이용하여, 각각의 균주(Lactobacillus acidophilus LA1, Lactobacillus helveticus ATCC 13866, Lactobacillus amylovorus ATCC 33620, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus acidophilus NCFM)에 대해 PCR을 수행하여 분석한 결과이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명에서 프라이머(primer)란, 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)을 가지는 핵산서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍(base pair)를 형성할 수 있고, 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라아제)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 프라이머 세트(primer set)란 특정 서열 DNA를 증폭하기 위한 프라이머의 조합을 의미하고 하나의 프라이머 세트에는 통상 2가지 프라이머가 포함되나 이를 초과하는 경우도 있다.

본 발명에서 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)란 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보올리고뉴클레오티드 또는 리보올리고뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지않는 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 발명의 일 측면은 Lactobacillus acidophilus 균주를 특이적으로 탐지할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로, 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 Lactobacillus acidophilus 균주와 유사하거나 동일한 종 및 속을 갖는 유사 균주들과 혼합되어 있는 시료에서도, Lactobacillus acidophilus 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은 후술하는 실험예에서 확인된 바와 같이, Lactobacillus acidophilus 균주를 제외한 다른 Lactobacillus 균주에서는 전혀 PCR 산물을 합성하지 않으며, 대상이 되는 Lactobacillus acidophilus 균주의 'CRISPR' 영역 유전자가 존재할 때만 이를 주형으로 하여 PCR 산물을 합성하므로, 상기 조성물을 사용하여 시료로부터 명확하게 Lactobacillus acidophilus 균주의 존재여부를 특이적으로 판별할 수 있다.

상기 조성물을 적용할 경우, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus acidophilus NCFM 및 Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 각각 특이적으로 확인할 수 있고, 이들의 PCR 산물 크기는 약 100~1000 bP로 검출되는 것을 통해 Lactobacillus acidophilus 균주의 존재여부를 특이적으로 판별할 수 있다. 진단 대상이 되는 Lactobacillus acidophilus 균주의 'CRISPR' 영역 유전자가 존재할 때만 이를 주형으로 하여 PCR 산물을 합성하게 되므로, PCR 검출시 Lactobacillus acidophilus 균주만이 100~1000 bp의 산물이 검출되게 된다.

이 중에서도 Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주의 PCR 산물 크기는 약 100 내지 200 bp이며, 동일속 다른 종의 균주와 PCR 산물 형성 여부에 차이를 가지므로, 상기 조성물을 사용하여 시료로부터 명확하게 Lactobacillus acidophilus 균주, 바람직하게는 Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 검출 및 판별할 수 있다. 구체적으로 150 내지 200 bp이다.

다시 말해, DNA 증폭을 위한 표적은 Lactobacillus acidophilus 속종의 균주 염색체 서열 중에서 "CRISPR 영역의 유전자 서열"이고, 상기 Lactobacillus acidophilus 균주에는 종래 Lactobacillus acidophilus에 속하는 균주라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 L. acidophilus ATCC 4356, L. acidophilus NCFM, L. acidophilus La-14, L. acidophilus FSI4 및 L. acidophilus LA1 등의 다양한 균주일 수 있다.

본 발명에 따른 증폭을 위한 표적이 되는 예시적인 "CRISPR 영역의 유전자 서열"은 하기 도 3, 4에 개략적으로 개시되어 있으며, Lactobacillus acidophilus LA1의 완전한 게놈의 예시적인 뉴클레오티드 서열은 Genbank Accession No. NZ_CP017062 에서 확인할 수 있고, L. acidophilus NCFM, L. acidophilus La-14, L. acidophilus FSI4의 CRISPR 영역의 전체 게놈의 예시적인 뉴클레오티드 서열은 각각 Genbank Accession No. NC_006814.3, NC_021181.2, NZ_CP010432.1에서 확인할 수 있다.

상기 본 발명의 조성물에 포함되어 있는 프라이머 세트는 일반적으로 전체 프라이머의 길이가 18 내지 23(최적길이 20)이고, Melting temperature(Tm)가 57 ℃ 내지 62 ℃이며, 프라이머 간의 최대 Tm 차이는 5도 이내이며, GC%가 35 내지 65%인 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명의 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들은 동일한 어닐링 온도 및 시간을 갖는 하나의 조건에서, 동일한 종속의 Lactobacillus acidophilus 균주들 각각 165bp, 837bp, 898bp, 900bp, 1000bp로 나타나는 서로 다른 크기의 PCR 산물을 합성하는데 반해, 동일한 속에 속하지만, 다른 종의 균주(Lactobacillus helveticus ATCC 13866, Lactobacillus amylovorus ATCC 33620)에 대해서는 전혀 PCR 산물이 합성되지 않았음을 확인하였다. 이를 통해 동일한 속의 균주가 시료 상에 존재하더라도, 본 발명의 Lactobacillus acidophilus 균주만을 특이적이고 명확하게 검출 및 판별할 수 있음을 확인하였으므로, 시료 내에 Lactobacillus acidophilus 균주 존재 여부를 판별하는데 필요한 시간 및 노력을 절감할 수 있음을 알 수 있다.

상기 정방향 프라이머 혹은 역방향 프라이머의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 "표지(lable)" 또는 "검출가능한 표지(detectable label)"는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 중합체, 또는 핵산 결합 인자에 결합된 어떠한 화학적 모이어티를 의미할 수 있으며, 상기 결합은 공유결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지는 검출 가능하며, 본 발명의 실험자에게 검출될 수 있는 상기 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 검출가능한 표지는 발광 분자, 화학 발광 분자, 형광 색소, 형광 퀀칭제(quenching agent), 색깔 분자, 방사성 동위원소 또는 신틸런트(scintillant)를 포함한다. 검출가능한 표지는 또한, 임의의 유용한 링커 분자(예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트랩트아비딘, HRP, protein A, protein G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni²⁺, FLAG 태그, myc 태그), 중금속, 효소(예를 들어. 알칼라인 포스파타제, 퍼옥시다제 및 루시퍼라제), 전자 공여체(donor)/수용체(acceptor), 아크리디늄 에스테르, 염료(dye) 및 열량 측정 기질(calorimetric substrate)를 포함한다. 또한, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 검출의 경우와 같이, 질량의 변화(a change in mass)를 나타내는데 검출가능한 표지가 고려될 수 있다. 당업자는 상기 언급되지 않은 유용한 검출가능한 표지에 대해서도 용이하게 인식할 수 있을 것이며, 이들 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상기 조성물을 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 등을 추가로 포함할 수 있다.

완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 증류수를 포함할 수 있으며, 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 용액, 효소 등이 제한업이 사용될 수 있다. 또한 상기 키트는 상기 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

상기 완충용액(buffer)은 증폭 반응에 첨가되어 상기 증폭 반응을 조절함으로서 상기 증폭 반응의 하나 이상의 요소를 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 화합물이다. 본 발명의 상기 완충액은 PCR 증폭 및 RNase H 절단 활성과 양립할 수 있다. 완충용액은 구체적으로, HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)(3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산) 및 아세테이트 또는 포스페이트를 포함하는 완충액 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 또한, PCR 완충용액은 일반적으로 약 70 mM 이하의 KCl 및 약 1.5 mM 또는 그 이상의 MgCl₂, 약 50-200 uM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 완충액은 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화시키기 위해 첨가물을 포함할 수 있다.

상기 첨가물은 오염된 효소의 불활성화, 단백질 접힘의 안정화, 및/또는 응집의 감소에 영향을 미친다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 첨가물의 예는 베타인, 포름아미드, KCl, CaCl₂, MgOAc, MgCl₂, NaCl, NH₄OAc, NaI, Na(CO₃)₂, LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로스, 데미에틸술폭시드(DMSO), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨(DTT), 피로포스파타제(Thermoplasma acidophilum 무기 피로포스파타제(inorganic pyrophosphatase, TAP)를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.), 우혈청 알부민(BSA), 프로필렌 글리콜, 글리신아미드, CHES, 퍼콜(Percoll), 아우린트리카르복실산, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO(N-도데실-N,N-디메틸아민-N-옥시드), Zwittergent 3-10, Xwittergent 3-14, Xwittergent SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, E. Coli SSB, RecA, 닉킹 엔도뉴클레아제(nicking endonucleases), 7-디아자G, dUTP, 음이온 디터전트(anionic detergent), 양이온 디터전트(cationic detergent), 비-이온 디터전트(nonionic detergent), zwittergent, 스테롤, 삼투조절물질(osmolyte), 양이온, 및 증폭의 효율을 변화시킬 수 있는 기타 화합물, 단백질, 또는 보조인자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 일 구체예에서, 2 이상의 첨가물이 증폭 반응에 포함된다. 상기 첨가물이 RNase H의 활성을 방해하지 않는다면, 첨가물은 프라이머 어닐링의 선택성을 향상시키기 위해 선택적으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 특이적으로 탐지할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로, 서열번호 1로 기재되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 Lactobacillus acidophilus LA1 균주 판별용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 Lactobacillus acidophilus LA1 균주와 유사하거나 동일한 종 및 속을 갖는 유사 균주들과 혼합되어 있는 시료에서도, Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은 시료에 적용시, 다른 유전자에는 PCR 산물을 합성하지 않으면서, 진단 대상이 되는 Lactobacillus acidophilus 균주의 'CRISPR' 영역 유전자가 존재할 때만 이를 주형으로 하여 PCR 산물을 합성하게 되고, 이 중에서도 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 PCR 산물의 크기는 150 내지 250 bp로, 다른 종래 동일 종속의 균주와 최대 750 bp의 차이를 가지므로, 상기 조성물을 사용하여 시료로부터 명확하게 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 존재여부를 특이적으로 판별할 수 있다.

구체적으로 본 발명의 조성물은 실험예에서 확인된 바와 같이, Lactobacillus acidophilus 균주를 제외한 다른 Lactobacillus 균주에서는 전혀 PCR 산물을 합성하지 않으며, 대상이 되는 Lactobacillus acidophilus 균주의 'CRISPR' 영역 유전자가 존재할 때만 이를 주형으로 하여 PCR 산물을 합성하며, 이 중에서도 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 PCR 산물의 크기는 150 내지 250 bp로, 다른 Lactobacillus acidophilus 균주들과는 PCR 산물의 크기가 명확히 구분되므로 상기 조성물을 사용하여 시료로부터 명확하게 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 존재여부를 특이적으로 판별할 수 있다.

상기 조성물을 적용할 경우, Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 PCR 산물 크기는 약 150 내지 250 bp, 바람직하게는 150 내지 200 bp이며, 동종 동속의 다른 균주들과 PCR 산물 크기에 현저한 차이를 가지므로, 상기 조성물을 사용하여 시료로부터 명확하게 Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 특이적으로 검출, 구분 및 판별할 수 있다.

다시 말해, DNA 증폭을 위한 표적은 Lactobacillus acidophilus 속종의 균주 염색체 서열 중에서 "CRISPR 영역의 유전자 서열"이고, 이는 L. acidophilus NCFM, L. acidophilus La-14, L. acidophilus FSI4 등의 다양한 균주를 포함한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명의 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들은 동일한 어닐링 온도 및 시간을 갖는 하나의 조건에서, 동일한 종속의 Lactobacillus acidophilus 균주들 각각 165bp(150bp + 8bp의 프라이머와 7bp의 다이서), 898bp(883bp + 8bp의 프라이머와 7bp의 다이서), 900bp, 1000bp로 나타나는 서로 다른 크기의 PCR 산물을 합성할 수 있음을 확인하였다. 이를 통해 동일한 종속의 균주가 시료 상에 존재하더라도, 본 발명의 Lactobacillus acidophilus LA1 균주(150 내지 250 bp; 바람직하게는 150 내지 200 bp)만을 특이적이고 명확하게 판별할 수 있음을 확인하였으므로, 시료 내에 Lactobacillus acidophilus LA1 균주 존재 여부를 판별하는데 필요한 시간 및 노력을 절감할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상기 조성물을 포함하는 Lactobacillus acidophilus LA1 균주 판별용 키트에 관한 것이다.

상기 완충용액(buffer)은 증폭 반응에 첨가되어 상기 증폭 반응을 조절함으로서 상기 증폭 반응의 하나 이상의 요소를 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 화합물이다. 본 발명의 상기 완충액은 PCR 증폭 및 RNase H 절단 활성과 양립할 수 있다. 완충용액은 구체적으로, HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)(3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산), 및 아세테이트 또는 포스페이트를 포함하는 완충액 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 또한, PCR 완충용액은 일반적으로 약 70 mM 이하의 KCl 및 약 1.5 mM 또는 그 이상의 MgCl₂, 약 50-200 uM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 완충액은 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화시키기 위해 첨가물을 포함할 수 있다.

본 발명자들은 시료 내에 존재하는 미생물들 중에서, Lactobacillus acidophilus 균주들의 CRISPR 영역 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트(정방향 프라이머와 역방향 프라이머)를 개발하였고, 상기 증폭된 CRISPR 영역의 염기서열들의 길이를 비교 분석함으로써, Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 정확하고, 신속하게 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. 구체적으로 상기 증폭된 CRISPR 영역의 염색체 중에서도 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 서열 길이가 종래 다른 균주들과는 달리 165 bp(150bp + 8bp의 프라이머와 7bp의 다이서)를 가지고 있으므로, 결과적으로 이를 이용하여 Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 판별할 수 있다. 실제 PCR 분석에 상기 조성물을 이용할 경우, Lactobacillus acidophilus LA1 균주에서는 약 150~200 bp의 PCR 산물 크기를 갖고 있는 것으로 확인되었고, 이는 프라이머 세트로 증폭된 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 CRISPR 구간에 대한 PCR 산물 165 bp(150bp + 8bp의 프라이머와 7bp의 다이서)과 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 서열(40 bp)가 합해져서 측정된 것이므로, PCR 분석시 PCR 산물 크기 150 내지 250 bp에 속한다면 Lactobacillus acidophilus LA1 균주라 판별할 수 있다. 다른 Lactobacillus acidophilus 균주는 Lactobacillus acidophilus LA1 균주와 달리 PCR 산물 크기가 800 내지 1500 bp, 바람직하게는 800 내지 1000 bp에 해당되므로, 명확하고 확연하게 구별가능하다.

본 발명의 또 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 상기 조성물을 이용하여 Lactobacillus acidophilus 균주 혹은 Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 판별하는 방법에 관한 것이다.

a) 판별 대상 시료로부터 DNA를 분리하고, 상기 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여, PCR 산물을 얻는 단계; 및

b) 상기 PCR 산물을 분석하는 단계;를 포함한다.

우선 a) 판별 대상 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여, PCR 산물을 얻는다.

상기 시료로부터 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으나, 상기 DNA 추출법은 바람직하게는 알카라인 추출법(Alkaline extraction method), 열수추출법, 컬럼(Column) 추출법 또는 페놀/클로로포름(Phenol/Chloroform) 추출법일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알카라인 추출법(Alkaline extraction method)일 수 있다.

상기 판별 대상 시료는 Lactobacillus acidophilus 균주 혹은 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 존재유무를 검출하고자 하는 다양한 시료를 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이 프라이머가 설계되고, 판별 대상 시료로부터 DNA가 준비되면, 이의 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 리가제 연쇄 반응(LCR), 및 롤링 서클 증폭(RCA)을 포함한 다양한 방법에 의해 수행될 수 있으나, 상기 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 특이적인 표적 DNA 서열을 증폭하는데 가장 일반적이고, 바람직하다.

또한 상기 PCR은 실시간(real-time) PCR, qRT-PCR 또는 RT-PCR일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 "중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"란, 일반적으로 원하는 표적 서열을 인 비트로(in vitro)에서 증폭하는 방법을 말하는 것으로, 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 과정이라면 특별히 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 상기 PCR 과정은 2배 몰농도 이상 과량의, 상기 이중 가닥 표적 서열의 반대 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 표적 서열(들)을 포함하는 반응 혼합물에 넣는 단계로 이루어져 있다. 상기 반응 혼합물은 DNA 중합효소의 존재 하에 온도 싸이클링(thermal cycling) 프로그램에 적용하여, 상기 DNA 프라이머 세트 사이의 원하는 표적 서열을 증폭하도록 한다.

또한, 상기 과정을 통해 얻은 PCR 산물은 "PCR 절편(PCR fragment)" 또는 "역전사 효소-PCR 절편(reverse transcriptase-PCR fragment)" 또는 "앰플리콘(amplicon)"이라고도 하며, 특정한 표적 핵산의 증폭에 따라 생성되는 폴리뉴클레오티드 분자(또는 집합적으로 분자의 다수)를 의미한다. PCR 절편은 일반적으로, DNA PCR 절편을 의미하나, 이에 한정하는 것은 아니다. PCR 절편은 단일 가닥 또는 이중 가닥, 또는 임의의 농도비에 따른 그의 혼합물일 수 있다. PCR 절편 또는 역전사 효소-PCR 절편은 100-500개의 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.

상기 증폭된 PCR 산물을 분석하여, Lactobacillus acidophilus 균주의 존재를 확인 및 판별하거나, Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 존재를 확인 및 판별할 수 있다. 상기 분석을 위한 방법으로는 PCR 산물의 염기서열을 분석하거나, 서열의 수에 따라 달라지는 증폭산물의 크기를 분석하여 분류함으로써 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에서는 증폭된 PCRT 산물의 생성 유무를 분석하여 Lactobacillus acidophilus 균주를 검출하거나, 판별할 수 있다. 나아가 본 발명에서는 증폭된 PCR 산물의 유전자 단편을 분석하여 정확하게 Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 분류하거나, 증폭산물의 크기를 분석하여 Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 판별한다.

즉, Lactobacillus acidophilus LA1 균주에 특이적으로 나타나는 PCR 산물에 대한 정보를 축적하고, 축적된 정보에 근거하여 Lactobacillus acidophilus LA1 균주와 동일한 속종의 균주들과의 유전자 정보를 비교함으로써, 특이적으로Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 높은 신뢰도로 정확하고 빠르게 판별 및 분석할 수 있다.

이때 상기 상기 PCR 산물 중에서 150 내지 250 bp, 바람직하게 150 내지 200 bp인 것이 있을 경우, 시료 내에 Lactobacillus acidophilus 균주 중에서도 Lactobacillus acidophilus LA1 균주가 존재함을 분명하게 판별할 수 있다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

실시예 1. Lactobacillus acidophilus LA1 균주 배양

Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 게놈 해독을 위해, Lactobacillus acidophilus LA1 균주를 MRS 배지(Difco, 288110)로 37 ℃, 18 시간동안 배양하였다.

실시예 2. Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 게놈 확보

Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 게놈 해독을 위해, 실시예 1의 배양액으로부터 균체를 회수하여 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, Germany)으로 Genomic DNA를 추출하고, PacBio RS II 시퀀싱 플랫폼(sequencing platform)을 이용하여 전체 게놈 염기서열을 확보하였다.

유전체 결과는 HGAP 3.0을 이용하여, 각 염기서열(sequence read) 조립(assembly)을 수행하였으며, 수행과정에서 전체 유전체의 시작점을 확정하기 위해 chromosomal replication 개시 유전자인 dnaA의 위치를 확인하였다.

실시예 3. Lactobacillus acidophilus 균주의 게놈 비교

Lactobacillus acidophilus LA1 게놈상에 존재하는 유전자의 기능을 확인하기 위하여 NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline(PGAAP)를 활용하였다.

이후, Lactobacillus acidophilus LA1 게놈과 동일 속의 유사균주 9종들의 게놈을 비교 분석하였다. 구체적으로 상기 9종의 균주는 다음과 같다. L. acidophilus NCFM(assembly accession: GCF_000011985.1), L. acidophilus La-14(GCF_000389675.2), L. acidophilus FSI4(GCF_000934625.1), L. gallinarum HFD4(GCF_001314245.2), L. helveticus CNRZ32(GCF_000422165.1), L. crispatus ST1(GCF_000091765.1), L. kefiranofaciens ZW3(GCF_000214785.1), L. amylovorus GRL1118(GCF_000194115.1), L. acetotolerans NBRC 13120(GCF_001042405.1). 이러한 9종 균주의 게놈을 확보하여 전체 게놈 정보를 실시예 2와 동일한 방법으로 분석하였다.

9종 균주의 16S rRNA 유전자 정보를 활용하여 Tamura-Nei model에 근거한 maximum likelihood 방법으로 분자 계통도를 작성하였고, 전체 게놈의 유사도 분석을 위해 Orthologous average nucleotide identity(OrthoANI)를 이용하여 게놈 비교 후 전체 게놈정보에 기반한 분자 계통도를 함께 작성하여 실제로 Lactobacillus acidophilus 연관 미생물들이 얼마나 관련이 있는지를 확인하였다.

추가적으로, 각 균주에서, 파지(phage) 감염 정보를 알수 있는 CRISPR 지역을 CRISPR finder 통해 분석하였고, 각 균주의 CRISPR 구성을 비교하였다.

도 1은 실시예 2를 통해 분석한 Lactobacillus acidophilus LA1의 전체 게놈 구성도로, 이를 살펴보면, Lactobacillus acidophilus LA1 게놈 분석결과 LA1의 전체 게놈은 1.99-Mbp의 circular chromosome(34.7% G+C content)이며, 1,953개의 유전자를 가지고 있고, 76개의 RNA gene와 33개의 psedo gene을 가지고 있는 것으로 확인 되었다.

도 2a는 실시예 3을 통해 확인한 Lactobacillus acidophilus LA1를 비롯한 10종 균주의 16S rRNA 유전자를 활용한 계통도이고, 도 2b는 실시예 3을 통해 확인한 Lactobacillus acidophilus LA1를 비롯한 10종 균주의 ANI genome 비교를 활용한 계통도이다.

도 2에 나타난 바와 같이 16S rRNA 유전자 및 OrthoANI를 이용한 분자계통도를 통해 Lactobacillus acidophilus LA1를 포함하여 총 10종의 균주들의 유연관계를 확인할 수 있었다. 구체적으로 Lactobacillus acidophilus에 속하는 4종 strain(L. acidophilus NCFM, Lacidophilus La-14, L. acidophilus FSI4 및 L. acidophilus LA1)은 각 균주간의 차이를 거의 확인할 수 없을 정도로 매우 유사하였다.

도 3은 실시예 3을 통해 확인한 Lactobacillus acidophilus LA1를 비롯한 10종 균주들 중에서, L. acidophilus NCFM, Lacidophilus La-14, L. acidophilus FSI4 및 L. acidophilus LA1의 CRISPR 구조 분석 결과이다.

구체적으로 도 3은 실시예 3으로부터 분석한 L. acidophilus NCFM, Lacidophilus La-14, L. acidophilus FSI4 및 L. acidophilus LA1의 전체 게놈 정보 중에서 CRISPR 지역만을 따로 분석한 결과이다.

이를 살펴보면, CRISPR 지역에서, L. acidophilus NCFM, Lacidophilus La-14, L. acidophilus FSI4과 L. acidophilus LA1 균주들의 염기서열에 명확한 차이가 있음을 확인하였다. 특히 L. acidophilus NCFM, Lacidophilus La-14, L. acidophilus FSI4 균주에서는 32개 spacer 지역이 존재하는 반면에 L. acidophilus LA1에서는 6~17번 spacer 지역이 전부 소실 되어 있다.

따라서 CRISPR 구조의 차이를 이용하여, 일반 시료에서 L. acidophilus 균주를 특이적으로 구분 및 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 구체적으로는 상기 균주들 중에서 L. acidophilus LA1 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 마커를 설계하고자 하였고, 이를 도 4에 나타내었다. 보다 상세하게 도 4는 L. acidophilus LA1를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트와 상기 프라이머 세트로 PCR하였을 때 인 실리코 분석(in silico)을 통해 각 균주의 PCR 산물 크기를 도시화한 것이다.

도 4에 나타난 바와 같이, L. acidophilus 균주는 종래 다른 균주들과는 달리 CRISPR 영역을 포함하고 있으므로, 이를 통해 특이적으로 구분할 수 있음을 알 수 있다. 또한 L. acidophilus LA1 균주는 다른 균주들과는 달리, CRISPR 6~17번 영역의 염기서열이 소실되어 있다는 점에 특징이 있으므로, 이러한 특징을 통해 L. acidophilus LA1 균주를 분명히 구분할 수 있음을 확인하였다. 이를 위해 상기 CRISPR 6~17번 영역을 포함하는 프라이머를 개발함으로써, L. acidophilus 균주 바람직하게는 L. acidophilus LA1 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 마커를 제작하였다. 구체적으로 L. acidophilus NCFM, Lacidophilus La-14 및 L. acidophilus FSI4 기준으로 6번 spacer 지역에서 left primer를 제작하였고, 20번 spacer 지역에서 right primer 제작하였고, 이를 통해 본 발명의 L. acidophilus LA1 균주를 확실히 구별할 수 있음을 알 수 있다.

또한 본 발명을 통해 설계된 프라이머 세트를 이용하여, 각 균주에 PCR을 수행하여 PCR 산물을 얻을 경우, PCR 산물의 길이를 인실리코 모델링(in silico modeling)을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 4의 하단에 표기하였다. 분석 결과 L. acidophilus NCFM, Lacidophilus La-14, L. acidophilus FSI4 등의 타 L. acidophilus 균주에서는 PCR 산물의 길이가 약 898bp(883bp + 8bp의 프라이머와 7bp의 다이서)임을 확인하였고, L. acidophilus LA1의 PCR 산물의 길이는 165 bp(150bp + 8bp의 프라이머와 7bp의 다이서)로 확인되었다.

즉, 본 발명에 다른 프라이머 세트를 이용할 경우, 시료에서 L. acidophilus 균주의 존재 유무를 검출할 수 있고, PCR 산물의 길이만으로도 상기 L. acidophilus 균주들 중에서 L. acidophilus LA1를 확실히 구별할 수 있음을 알 수 있다.

도 5는 인 실리코(in silico)에서, 본 발명의 L. acidophilus 균주 판별용 프라이머 세트를 NCBI 사이트로부터 제공되는 데이터베이스와 대조하여, BLASTN 이란 서열검색 프로그램으로 sequence를 분석한 결과이다.

20bp 가량의 짧은 서열을 검색하기 위하여 BLAST 검색조건 중 task 는 "blastn-short" 로, e-value 는 1.0, low-complexity 필터링 조건인 dust을 제외하고 검색했다. 검색한 결과는 도 5의 "align_code" 열 에서 보듯이 일치하는 코드는 'O', 불일치하는 코드는 '/', 그리고 align 되지 않은 부분은 '-'로 표시하여 시각적으로 유사도를 판단했다. 검색결과 L. acidophilus 종은 모두 프라이머 세트와 동일했고, 나머지 종에서는 최소 2개 이상 코드에서 불일치 또는 align 없음으로 판별되었다.

본 발명에서 L. acidophilus 판별용 프라이머 세트를 제조하기 위하여, 가장 중요하게 여긴 것은 전체 프라이머의 길이로, 18 내지 23(최적길이 20)을 가지도록 디자인하였다. 또한 상기 프라이머는 Melting temperature(Tm)이 57 ℃ 내지 62 ℃, 바람직하게는 59 ℃로 디자인 하였고, 프라이머 간의 최대 Tm 차이는 5도 이내로 한정하였다. 또한, 상기 프라이머는 GC%가 35 내지 65%, 바람직하게 50%로 설계하였다.

이렇게 제작된 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 조성물이 L. acidophilus 균주, 특히 L. acidophilus LA1에 대하여 특이성을 가지는지 여부를 in silico 분석 및 현존 NCBI DB상의 sequence match를 통해 분석하였고, 그 결과를 살펴보면(도 5), 본 발명을 통해 설계된 프라이머 세트 조성물은 Lactobacillus acidophilus 종만을 선택적으로 증폭시키는 것을 확인하였다. 나아가 검출된 Lactobacillus acidophilus 종의 균주들 중에서 LA1의 경우 PCR 산물이 720bp만큼 더 작은 것을 확인하였고, 이를 통해 LA1 균주를 명확하고 정확하게 판별할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물의 PCR 분석-1.

도 5에서 제작된 본 발명의 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물이 특이적으로 L. acidophilus 균주 특히, L. acidophilus LA1 균주를 판별하는지를 확인하고자 하였다. 이때, 도 5의 선명도를 고려하여, 도 5의 내용을 표 1 내지 표 8에 구체적으로 나타내었다.

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>> region for right primer 3
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>> region for right primer 4
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sbjct_title	Lactobacillus helveticus strain CAUH18, complete genome	Lactobacillus helveticus strain MB2-1, complete genome	PREDICTED: Jatropha curcas probable inactive receptor kinase At2g26730 (LOC105640414), mRNA	Lactobacillus helveticus strain KLDS1.8701, complete genome	PREDICTED: Populus euphratica peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase A-like (LOC105133547), mRNA	Spirometra erinaceieuropaei genome assembly S_erinaceieuropaei ,scaffold SPER_scaffold0005269

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sbjct_title	Nippostrongylus brasiliensis genome assembly N_brasiliensis_RM07_v1_5_4 ,scaffold NBR_scaffold0000318	Schistocephalus solidus genome assembly S_solidus_NST_G2 ,scaffold SSLN_contig0000609	Saprolegnia diclina VS20 hypothetical protein mRNA	Saprolegnia diclina VS20 hypothetical protein, variant mRNA	Prunus persica hypothetical protein (PRUPE_ppa000197mg) mRNA, complete cds	Lactobacillus helveticus H9, complete genome

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sbjct_title	Populus trichocarpa hypothetical protein (POPTR_0010s19250g) mRNA, complete cds	Lactobacillus helveticus CNRZ32, complete genome	Lactobacillus helveticus R0052, complete genome	Dicentrarchus labrax chromosome sequence corresponding to linkage group 1, top part, complete sequence	Lactobacillus helveticus H10, complete genome	Lactobacillus helveticus DPC 4571, complete genome

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sbjct_title	Zebrafish DNA sequence from clone CH211-117N7 in linkage group 13, complete sequence	Zebrafish DNA sequence from clone DKEY-6A5 in linkage group 4, complete sequence	L.helveticus pepD gene for dipeptidase	Lactobacillus helveticus hypothetical XylS/AraC-type transcription factor gene, partial cds, and dipeptidase gene, complete cds

우선, Lactobacillus acidophilus LA1, Lactobacillus helveticus ATCC 13866, Lactobacillus amylovorus ATCC 33620, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 및 Lactobacillus acidophilus NCFM 균주들을 각각 MRS 배지(Difco, 288110)로 37 ℃, 18 시간동안 배양하였다. 이후 상기 각각의 균주의 배양액으로부터 균체를 회수하여 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, Germany)으로 Genomic DNA를 추출하였다.

추출한 DNA 30 ng에 대하여 thermal cycling(PCR)을 실시하였다. PCR 반응시 총 반응액은 20 ㎕이고, 2.0 mM dNTP(Fermentas, USA), 1.0 unit의 내열성 DNA 중합효소(e-taq polymerase, Solgent), 20 pmol CRISPR F(써열번호 1), 20 pmol CRISPR R 프라이머(서열번호 2), 20 ng 각각의 균주 DNA 및 완충액(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01 % 젤라틴)을 완전히 혼합한 용액을 준비한다.

PCR반응은 Dyad(Bio-rad)를 사용하여 실시하였고, 반응조건은 초기 95 ℃에서 300초간 유지한 뒤, 95 ℃에서 30초간 처리하여 DNA를 변성시키고, 55 ℃에서 30초간 어닐링한 후, 72 ℃에서 90초간 증폭(extension)(DNA 중합)하였고, 이러한 과정을 30회 반복(95 ℃, 30초(변성) → 55 ℃, 30초(재결합) → 72 ℃, 90초(DNA 중합) → 95 ℃, 30초(변성))하고, 72 ℃ 300 초간 마지막 합성을 실시하였다.

상기 과정으로 증폭된 증폭산물(PCR 산물)을 1.2%의 아가로스 젤에서 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology, Korea)로 염색하여 DNA 다형성 밴드를 UV로 조사하여 검출하였으며, Gel-Doc system(Bio-rad)으로 저장하고 인쇄하여 도 6에 나타내었다.

도 6은 본 발명의 L. acidophilus 균주 판별용 프라이머 세트를 이용하여, 각각의 균주(Lactobacillus acidophilus LA1, Lactobacillus helveticus ATCC 13866, Lactobacillus amylovorus ATCC 33620, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus acidophilus NCFM)에 대해 PCR을 수행하여 분석한 결과이다.

이때, M은 DNA 크기 표준 마커(Sizer^™ 100bp DNA Marker(cat.No,24073)이고, 1은 Lactobacillus helveticus ATCC 13866이고, 2는 Lactobacillus amylovorus ATCC 33620이며, 3은 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356이며, 4는 Lactobacillus acidophilus NCFM 균주이고, 5는 Lactobacillus acidophilus LA1(CB_LA1이라고도 한다)이다.

나타난 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물은 Lactobacillus acidophilus 균주에 대해서만 특이적으로 PCR 산물(100~1000 bp)을 형성함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물은 Lactobacillus acidophilus LA1에서 약 200bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰음을 확인하였다.

게놈분석을 통해 Lactobacillus acidophilus LA1 균주는 특이적으로 CRISPR 구간에서의 염기서열이 다른 균주(동속, 동종의 균주)들과 달리 6~17 번의 spacer 지역이 소실되어 있으므로, 서열번호 1, 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 Lactobacillus acidophilus LA1 균주 판별용 조성물을 통해 회수한 PCR 산물(증폭된 DNA 단편, 엠플리콘(amplicon))의 크기가 165 bp(150bp + 8bp의 프라이머와 7bp의 다이서)이라 여겼다. 허나, 실질적으로는 약 200 bp의 크기에서 PCR 산물이 확인되었다. 이러한 차이는 PCR 산물의 확인에서 프라이머(primer)로 사용된 서열번호 1과 서열번호 2의 길이가 합해졌기 때문이다. 구체적으로 프라이머 세트로 증폭된 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 CRISPR 구간에 대한 PCR 산물(150 bp)과 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 서열(40 bp)가 합해져서 약 190bp에서 측정된 것이라 볼 수 있다.

게다가 전기영동 겔(gel electrophoresis) 상에서 미세한 차이(전기영동이 1base단위 정밀한 resolution을 보여주지 않음)를 고려하면, PCR 산물이 200 bp에서 검출되었다 하더라도, 증폭된 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 CRISPR 구간에 대한 PCR 산물 165 bp(150bp + 8bp의 프라이머와 7bp의 다이서)를 근간으로 도출된 결과이므로, 본 발명의 범주에 속하는 결과라 할 것이다.

따라서, PCR 산물은 정확하게는 165 bp(150bp + 8bp의 프라이머와 7bp의 다이서)인 것이 바람직하나, 상술한 다양한 조건들을 고려하였을 때, 실제 적용하여 도출된 PCR 산물이 150 내지 250 bp, 바람직하게는 150 내지 200 bp에 해당한다면 Lactobacillus acidophilus LA1 균주인 것으로 판별할 수 있다(마커로 측정가능한 영역에도 영향을 받음).

이를 증명하기 위하여 본 실시예에서 회수된 상기 L. acidophilus 3 종의 균주의 PCR 산물에 대해 DNA 염기서열을 확인하였습니다.

이에 반해 LA1 균주와는 다른 종의 Lactobacillus helveticus ATCC 13866, Lactobacillus amylovorus ATCC 33620에 대해서는 전혀 증폭된 DNA 단편이 발견되지 않았으며, 동일한 종의 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus acidophilus NCFM 균주에 대해서는 약 900bp, 1000bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머는 Lactobacillus acidophilus종의 균주만 선택적으로 CRISPR 타겟 부위의 서열을 증폭시키므로, 다양한 균주들 중에서 Lactobacillus acidophilus 균주를 검출 및 판별할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머는 Lactobacillus acidophilus 종간에도 각 균주(strain) 별로 다른 크기의 앰플리콘(amplicon)을 생성하기에 신속, 정확하게 Lactobacillus acidophilus LA1 균주 판별용 조성물로 활용가능하다.

실시예 5. Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물의 PCR 분석-2.

앞선 실험예 4로부터 측정된 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물을 Lactobacillus acidophilus LA1, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus acidophilus NCFM로부터 분리된 각각의 DNA에 처리하여, 중합효소연쇄반응을 수행함으로써, PCR 산물을 얻고, 이의 크기를 분석하고자 하였다.

우선, Lactobacillus acidophilus LA1, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus acidophilus NCFM 균주들을 각각 MRS 배지(Difco, 288110)로 37 ℃, 18 시간동안 배양하였다. 이후 상기 각각의 균주의 배양액으로부터 균체를 회수하여 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, Germany)으로 Genomic DNA를 추출하였다.

추출한 DNA에 대하여 하기 표 9의 PCR 반응액을 통해 thermal cycling(PCR)을 실시하였다. 추출한 Lactobacillus acidophilus LA1 균주 DNA 및 완충액(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01 % 젤라틴)을 완전히 혼합한 용액을 준비하였다.

PCR반응은 Dyad(Bio-rad)를 사용하여 실시하였고, 반응조건은 초기 95 ℃에서 5 분간 유지한 뒤, 95 ℃에서 30초간 처리하여 DNA를 변성시키고, 55 ℃에서 30초간 어닐링한 후, 72 ℃에서 90초간 증폭(extension)(DNA 중합)하였고, 이러한 과정을 30회 반복(95 ℃, 30초(변성) → 55 ℃, 30초(재결합) → 72 ℃, 90초(DNA 중합) → 95 ℃, 30초(변성))하고, 72 ℃ 5분 간 마지막 합성을 실시하였다.

PCR 반응 용액	함량(㎕)
SP taq.	0.5
10x SP taq buffer	2.5
dNTPs	2.0
Tuning Buffer	5.0
Template(균주 DNA)	1.0
Forward primer (5 uM) CRISPR F 프라이머(서열번호 1)	1.0
Reverse primer (5 uM) CRISPR R 프라이머(서열번호 2)	1.0
D.W	12

상기 과정으로 증폭된 증폭산물(PCR 산물)을 1.2%의 아가로스 젤에서 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology, Korea)로 염색하여 DNA 다형성 밴드를 UV로 조사하여 검출하였으며, Gel-Doc system(Bio-rad)으로 저장하고 인쇄하여 도 7 내지 9에 나타내었다.

도 7은 DNA 크기 표준 마커에 대해 PCR을 수행하여 분석한 결과이고, 도 8은 본 발명의 L. acidophilus 균주 판별용 프라이머 세트를 이용하여, 각각의 균주(Lactobacillus acidophilus LA1, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus acidophilus NCFM)에 대해 PCR을 수행하여 아가로스 겔 전기영동으로 분석한 결과이며, 도 9는 본 발명의 L. acidophilus 균주 판별용 프라이머 세트를 이용하여, 각각의 균주(Lactobacillus acidophilus LA1, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus acidophilus NCFM)에 대해 PCR을 수행하여 얻은 PCR 증폭산물을 정제한 후, 이를 아가로스 겔 전기영동으로 분석한 결과이다.

이때, 양쪽에 별도의 표기가 없는 lane은 DNA 크기 표준 마커이고, 1, 4, 7, 10은 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356이고, 2, 5, 8, 11은 Lactobacillus acidophilus NCFM 균주이고, 3, 6, 9, 12은 Lactobacillus acidophilus LA1(CB_LA1이라고도 한다)이다.

도 7 내지 9로부터 확인된 증폭산물에 대하여 시퀀스를 분석하였다. 우선 Lactobacillus acidophilus NCFM 균주의 경우 프라이머(primer)를 제외하고 898 bp인 것으로 측정되었고, 증폭서열은 다음과 같다.

[서열번호 3]

CATCAATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATTAGGCAAATAGCCAATTTTTATCATACATTCCGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCGGCAATTTTTGAAACAAACAACTATGTATATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATAAATAAGGAAGATATTGCCACCCTCGGTACCCAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATACAAGTTTTGCTCTAACCATGATGTTGTAAACAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATACGTTAAAGCGGACAATAAGCTTCAACGTTTTAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCGTGCTTGAAATTGCTCTCGGGGTTTCGCCTAAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATATTTGCTGCGAGTAACTCTGACTTGTTTACCCGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATTTTAGCTAAGTTTAAGACCGAAGATGGCCAAAGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCGGCAATTTTTGAAACAAACAACTATGTATATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCGGCAATTTTTGAAACAAACAACTATGTATATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATACAAGTTTTGCTCTAACCATGATGTTGTAAACAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATAGCTATCCAAATATTAAATTTGCACTAGTTAAGGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATGAAGAATTTTATCTTCTAGGTGGCTTTTTTGTGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATAGAAATATTTGATTTTGATAGTGAAAAAGAATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAATTCAGTCC

Lactobacillus acidophilus NCFM 균주의 예측길이는 Lactobacillus acidophilus NCFM 균주의 CRISPR 영역을 기준으로 하고, 초기 예측길이는 프라이머 기준이 아닌 프라이머에 인접한 다이서(dicer) 서열을 기준으로 하기 때문에, 예측시 누락된 left 프라이머와 인접 다이서(dicer) 사이의 8 bp 서열과, right 프라이머와 인접 다이서 사이의 7 bp 서열을 포함할 경우 실제 예측길이는 898 bp임을 확인하였다.

유전체 서열 Lactobacillus acidophilus NCFM과 비교하여 1 bp 결손( deletion) 부분이 890 bp에서 확인되었는데, 이는 Sanger 시퀀싱의 품질저하 때문에 발생한 결손인 것으로 여겨진다. 따라서 본 발명에서 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물을 Lactobacillus acidophilus NCFM 균주에 적용할 경우, 예상되는 크기만큼 증폭한 것을 확인하였다.

다음으로, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 균주의 경우 프라이머(primer)를 제외하고 837 bp인 것으로 측정되었고, 증폭서열은 다음과 같다.

[서열번호 4]

CATCAATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATTAGGCAAATAGCCAATTTTTATCATACATTCCGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCGGCAATTTTTGAAACAAACAACTATGTATATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATAAATAAGGAAGATATTGCCACCCTCGGTACCCAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATACGTTAAAGCGGACAATAAGCTTCAACGTTTTAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCGTGCTTGAAATTGCTCTCGGGGTTTCGCCTAAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATATTTGCTGCGAGTAACTCTGACTTGTTTACCCGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATTTTAGCTAAGTTTAAGACCGAAGATGGCCAAAGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCGGCAATTTTTGAAACAAACAACTATGTATATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCGGCAATTTTTGAAACAAACAACTATGTATATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATACAAGTTTTGCTCTAACCATGATGTTGTAAACAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATAGCTATCCAAATATTAAATTTGCACTAGTTAAGGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATGAAGAATTTTATCTTCTAGGTGGCTTTTTTGTGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATAGAAATATTTGATTTTGATAGTGAAAAAGAATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAATTCAGATAC

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 균주의 예측길이는 Lactobacillus acidophilus NCFM 균주의 CRISPR 영역을 기준으로 하였고, 초기 예측길이는 프라이머 기준이 아닌 프라이머에 인접한 다이서(dicer) 서열을 기준으로 하기 때문에, 예측시 누락된 left 프라이머와 인접 다이서(dicer) 사이의 8 bp 서열과, right 프라이머와 인접 다이서 사이의 7 bp 서열을 포함할 경우 실제 예측길이는 898 bp이였다.

그러나, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356의 CRISPR 영역은 Lactobacillus acidophilus NCFM의 9 번째 스페이서(spacer)(33 bp)와 다이서(28 bp)가 삭제된 형태임을 확인하였는 바, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356의 CRISPR 영역은 Lactobacillus acidophilus NCFM 보다 61 bp 짧은 837 bp일 것이라 예상할 수 있었다.

실질적으로 증폭된 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356의 서열길이가 837 bp임을 확인하였고, Lactobacillus acidophilus NCFM 보다 61 bp 짧은 서열이 검출된 것을 확인하였다.

이를 통해 본 발명에 따른 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물은 Lactobacillus acidophilus NCFM와 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356을 정확하게 구분할 수 있음을 확인하였을 뿐만 아니라, Lactobacillus acidophilus LA1과도 명백히 구별할 수 있음을 다시한번 확인하였다.

마지막으로 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 경우 프라이머(primer)를 제외하고 165 bp인 것으로 측정되었고, 증폭서열은 다음과 같다.

[서열번호 5]

CATCAATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATGAAGAATTTTATCTTCTAGGTGGCTTTTTTGTGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATAGAAATATTTGATTTTGATAGTGAAAAAGAATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATTCAAGAT

Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 예측길이는 Lactobacillus acidophilus LA1 균주의 CRISPR 영역을 기준으로 하였고, 초기 예측길이는 프라이머 기준이 아닌 프라이머에 인접한 다이서(dicer) 서열을 기준으로 하기 때문에, 예측시 누락된 left 프라이머와 인접 다이서(dicer) 사이의 8 bp 서열과, right 프라이머와 인접 다이서 사이의 7 bp 서열을 포함할 경우 실제 예측길이는 165 bp이였다.

실질적으로 증폭된 Lactobacillus acidophilus LA1의 서열길이가 165 bp임을 확인한 바, 예측된 길이와 100% 일치함을 확인하였다. 즉, 전기영동시 육안으로 약 200 bp에 가까운 것으로 보였으나, 실질적으로 증폭된 서열의 길이는 165 bp로, 예측길이와 완벽하게 일치하고 있음을 알 수 있다.

이를 통해 본 발명에 따른 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 Lactobacillus acidophilus 균주 판별용 조성물은 Lactobacillus acidophilus LA1을 동종 동속의 균주들 속에서 명백히 구별가능함을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머는 Lactobacillus acidophilus종의 균주만 선택적으로 CRISPR 타겟 부위의 서열을 증폭시키므로, 다양한 균주들 중에서 Lactobacillus acidophilus 균주를 검출 및 판별할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머는 Lactobacillus acidophilus 종간에도 각 균주(strain) 별로 다른 크기의 앰플리콘(amplicon)을 생성하기에 신속, 정확하게 Lactobacillus acidophilus LA1 균주 판별용 조성물로 활용가능함을 다시한번 확인할 수 있었다.

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> composition for identification of Lactobacilus acidophilus strain and method of determination thereof <130> HPC7904 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_F <400> 1 ttgacttgcg ctaggtgttg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_R <400> 2 gcgtggcaaa tgaatggttg 20 <210> 3 <211> 897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Lactobacillus acidophilus NCFM <400> 3 catcaatagg atcacctcca catacgtgga gaaaattagg caaatagcca atttttatca 60 tacattccgg gatcacctcc acatacgtgg agaaaatcgg caatttttga aacaaacaac 120 tatgtatata ggatcacctc cacatacgtg gagaaaataa ataaggaaga tattgccacc 180 ctcggtaccc aggatcacct ccacatacgt ggagaaaata caagttttgc tctaaccatg 240 atgttgtaaa caggatcacc tccacatacg tggagaaaat acgttaaagc ggacaataag 300 cttcaacgtt ttaggatcac ctccacatac gtggagaaaa tcgtgcttga aattgctctc 360 ggggtttcgc ctaaggatca cctccacata cgtggagaaa atatttgctg cgagtaactc 420 tgacttgttt acccgggatc acctccacat acgtggagaa aattttagct aagtttaaga 480 ccgaagatgg ccaaagggat cacctccaca tacgtggaga aaatcggcaa tttttgaaac 540 aaacaactat gtatatagga tcacctccac atacgtggag aaaatcggca atttttgaaa 600 caaacaacta tgtatatagg atcacctcca catacgtgga gaaaatacaa gttttgctct 660 aaccatgatg ttgtaaacag gatcacctcc acatacgtgg agaaaatagc tatccaaata 720 ttaaatttgc actagttaag gggatcacct ccacatacgt ggagaaaatg aagaatttta 780 tcttctaggt ggcttttttg tgggatcacc tccacatacg tggagaaaat agaaatattt 840 gattttgata gtgaaaaaga ataggatcac ctccacatac gtggagaaat tcagtcc 897 <210> 4 <211> 837 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 <400> 4 catcaatagg atcacctcca catacgtgga gaaaattagg caaatagcca atttttatca 60 tacattccgg gatcacctcc acatacgtgg agaaaatcgg caatttttga aacaaacaac 120 tatgtatata ggatcacctc cacatacgtg gagaaaataa ataaggaaga tattgccacc 180 ctcggtaccc aggatcacct ccacatacgt ggagaaaata cgttaaagcg gacaataagc 240 ttcaacgttt taggatcacc tccacatacg tggagaaaat cgtgcttgaa attgctctcg 300 gggtttcgcc taaggatcac ctccacatac gtggagaaaa tatttgctgc gagtaactct 360 gacttgttta cccgggatca cctccacata cgtggagaaa attttagcta agtttaagac 420 cgaagatggc caaagggatc acctccacat acgtggagaa aatcggcaat ttttgaaaca 480 aacaactatg tatataggat cacctccaca tacgtggaga aaatcggcaa tttttgaaac 540 aaacaactat gtatatagga tcacctccac atacgtggag aaaatacaag ttttgctcta 600 accatgatgt tgtaaacagg atcacctcca catacgtgga gaaaatagct atccaaatat 660 taaatttgca ctagttaagg ggatcacctc cacatacgtg gagaaaatga agaattttat 720 cttctaggtg gcttttttgt gggatcacct ccacatacgt ggagaaaata gaaatatttg 780 attttgatag tgaaaaagaa taggatcacc tccacatacg tggagaaatt cagatac 837 <210> 5 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Lactobacillus acidophilus LA1 <400> 5 catcaatagg atcacctcca catacgtgga gaaaatgaag aattttatct tctaggtggc 60 ttttttgtgg gatcacctcc acatacgtgg agaaaataga aatatttgat tttgatagtg 120 aaaaagaata ggatcacctc cacatacgtg gagaaaattc aagat 165

Claims

서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주 판별용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주 판별용 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주 판별용 키트.
서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 LA1 (Lactobacillus acidophilus LA1) 균주 판별용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스 LA1 (Lactobacillus acidophilus LA1) 균주 판별용 조성물.
제4항의 조성물을 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 LA1 (Lactobacillus acidophilus LA1) 균주 판별용 키트.
제6항에 있어서,
상기 키트는 완충용액, DAN 중합효소 및 dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스 LA1 (Lactobacillus acidophilus LA1) 균주 판별용 키트.
a) 판별 대상 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제4항의 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및
b) 상기 PCR 산물을 분석하는 단계;를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 LA1 (Lactobacillus acidophilus LA1) 균주를 판별하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 PCR 산물은 150 내지 250 bp인, 락토바실러스 애시도필러스 LA1 (Lactobacillus acidophilus LA1) 균주를 판별하는 방법.