CN113528543B - 松树脂溃疡病病原菌检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1及应用 - Google Patents

松树脂溃疡病病原菌检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种松树脂溃疡病病原菌(Fusariumcircinatum)的特异性检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1，该检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1的DNA序列如SEQIDNO：1所示，CDS序列如SEQIDNO:1所示，蛋白序列如SEQIDNO：2所示。同时，还公开了特异性检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1的引物组合，其正向引物序列如SEQIDNO：3所示，反向引物序列如SEQIDNO：4所示。本发明所发掘的检测靶标和其设计的引物组合用于普通PCR，其特异性强，灵敏度高，证明Fcir_CM004512.1.g2067.t1适合作为松树脂溃疡病原菌(Fusariumcircinatum)的检测靶标，本发明发掘的新靶标和基于该靶标建立的检测方法对于港口的进境植物上携带的F.circinatum实现即检即防，保护我国生态安全具有重要作用。

Description

松树脂溃疡病病原菌检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1及 应用
技术领域
本发明属于松树脂溃疡病病原菌检测技术领域，具体一种松树脂溃疡病病原菌(F.circinatum)的特异性检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1及应用。
背景技术
松树脂溃疡病病原菌(Fusarium circinatum)最早于1945年在美国东南部的北卡罗来纳州和南卡罗来纳州发现。目前世界上发生并报告了松树脂溃疡病病原菌(F.circinatum)的国家共有14个，分别是：巴西、智利、哥伦比亚、法国、海地、意大利、日本、韩国、墨西哥、葡萄牙、西班牙、南非、乌拉圭、美国。其中原本有松树脂溃疡病病原菌(F.circinatum)引起病害记录的意大利和法国，经过严格监控，被认为已经完全消除。
在目前，我国仍未发现有松树脂溃疡病病原菌(F.circinatum)。但由于它的传播和建立强烈地依赖于气候条件，松树脂溃疡病病原菌常在地中海气候和亚热带气候中发病率较高，所以东南亚和中国的大部分地区被预测为松树脂溃疡病病原菌最适宜生存的地区。松树脂溃疡病病原菌侵染苗木引起的松苗立枯病是一种危害苗木的重要病害，可以对超过60种松属植物引起病害，有研究表明在菊科、唇形科、蔷薇科、禾本科中也有检测到松树脂溃疡病病原菌的存在。松树脂溃疡病病原菌在种子园里也有病害的发生，在播种后损失很大。种植的所有幼苗中，约有42％死于松树脂溃疡病病原菌感染。在大多数死亡发生在种植后的前30-140天，1年后平均幼苗存活率为36-53％。在更具耐受性的物种中，如湿地松，严重的情况下，湿地松林人工林的干材期林分中的死亡率可能达到25％，高达98％的树木显示出感染的迹象。
为了阻止松树脂溃疡病病原菌的传播，需要对其进行快速、准确地检测。发掘特异性好的靶基因是目前所有检测技术的核心。不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距，因选择的目标靶序列不同、片段大小不同，结果都会有很大差别。靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株间的高度保守，而在种间变异性较高。虽然现有技术中也有针对松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的快速分子检测，但是其检测靶标灵敏度并不高。
综上所述，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确的检测技术体系对提升对松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。
发明内容
针对现有技术中松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低、特异性检测靶标较少的问题，本发明提供一种新的松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1及基于新检测靶标其PCR检测引物组合物。本发明的另一目的是提供上述松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的PCR检测试剂盒。
第一方面，本发明提供了一种松树脂溃疡病原菌(Fusarium circinatum)的特异性检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1，所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
第二方面，本发明提供了一种松树脂溃疡病原菌(Fusarium circinatum)的特异性检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1，其CDS序列如SEQ ID NO:1所示。
第三方面，本发明还提供了一种松树脂溃疡病原菌(Fusarium circinatum)的特异性检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1，其编码的蛋白质序列如SEQID NO:2所示。
第四方面，本发明还提供了一种检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的引物组合，其正向引物Fci67PCR-F1序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物Fci67PCR-R1序列如SEQ IDNO：4所示。
第五方面，本发明还提供了上述第四方面中的引物组合在检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)中的应用。
第六方面，本发明还提供了一种检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的试剂盒，至少包括1次用量的含有第四方面中的引物组合的检测溶液，其中所述引物组合浓度为20μM。
在某些实施例中，所述检测溶液还包括：4种dNTP各2000μM，100μL10×PCR反应缓冲液，80mM Mg2+，100μL 1％BSA，50单位Taq酶。
第七方面，本发明提供了上述第六方面的试剂盒在检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)中的应用。
第八方面，本发明还提供了一种检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的方法，包括以下步骤：取1μL检测对象的DNA溶液，加入23μL权利要求7中所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；60℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸7分钟。
相比于现有技术，本发明的优点为：
1)本发明首次公开了高信赖度特异性分子检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1，并基于该新靶标建立灵敏、准确PCR检测技术体系，对提升对松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。
2)采用本发明提供的检测引物组合针对松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)菌株和其他镰刀菌、真菌以及松材线虫、病原卵菌等进行检测，结果显示仅有松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的检测结果为阳性，能够扩增出特异性条带，条带大小为313bp；同时，经过特异性实验证明，PCR法检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)基因组DNA的灵敏度为10pg.μL-1。
3)本发明为松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的检测提供了新的检测靶标的发掘方法和技术平台，在病害侵染初期鉴定出病原物，本发明可以用于带菌植株组织中松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的快速检测，能够对出入境苗木的样品中含有的检疫性病原物进行快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是基于松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)新检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1设计的特异性引物Fci67PCR-F1/Fci67PCR-R1在镰孢菌种间普通PCR特异性验证电泳图；特异性引物上游引物Fci67PCR-F1和下游引物Fci67PCR-R1只能从供试的松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)菌株中特异地扩增出一条313bp的条带，而其余镰刀菌未产生目的条带；其中，从左边到右边，依次为：1，Marker；2，松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)；3，藤仓镰孢菌(F.fujikuroi)；4，茄腐镰孢菌(F.solani)；5，轮枝镰孢菌(F.verticillioides)；6，亚洲镰孢菌(F.asiaticum)；7，层出镰孢菌(F.proliferatum)；8，禾谷镰孢菌(F.graminearum)；9，尖镰孢菌(F.oxysporum)；10，N阴性对照。
图2是基于松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)新检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1设计的特异性引物在其他真菌和卵菌中的普通PCR特异性验证电泳图；特异性引物上游引物FciPCR-F1和下游引物FciPCR-R1只能从供试的松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)菌株中特异地扩增出一条313bp的条带，而其余真菌或卵菌未产生目的条带；
图3实施例3是基于松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)新检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1设计的检测引物组合的灵敏度验证电泳图，结果显示该引物的检测灵敏度仅能达到10pg.μL-1。
图4实施例4的实验接种及检测结果图。其中图4A中1为人工接种琼脂块松针样品，图4A中2-4为人工接种松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的松针；图4B为人工接种松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的发病松针的PCR检测结果图。PCR检测结果图中从左边到右边分别为Marker(1000bp)、松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)、人工接种松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的松针(Cedrus dedara)提取的DNA、人工接种琼脂块的松针(Cedrusdeodara)提取的DNA、NC(阴性对照)、Marker(1000bp)。
图5对比例中以靶标Fcir_CM004517.1.g9093.t1为例检测引物组合PCR检测的结果。
图6对比例中检测靶标Fcir_CM004511.1.g536.t1设计的其余引物PCR检测的结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本研究根据镰刀菌部分属基因组序列(Fusarium circinatum、F.oxysporum、F.graminearum、F.solani、F.fujikuroi、F.odoratissimum、F.verticillioides、F.odoratissimum、F.vanettenii、F.virguliforme、F.clavum、F.mangiferae、F.cerealis、F.redolens、F.sacchari、F.flagelliforme、F.sporotrichioides等共计16种镰刀菌属的全基因组序列分析，通过Blast序列搜索，序列提取、比对与分析，挖掘大规模的基因组数据库，从而发掘疫霉菌的检测靶标。通过全基因组比对，共计获得F.circinatum特异性检测靶标1000个以上；随机从F.circinatum 1000多个特异性基因中挑选出部分基因作为候选基因，设计了并筛选特异性引物，表1列出其中6个靶标基因(表1)。采用PCR技术对设计的特异性引物进行验证。特异性评价选择与F.circinatum不同种(尖镰刀菌Fusarium oxysporum；禾谷镰孢菌F.graminearum)；尖镰孢菌(F.oxysporum)；藤仓镰孢菌(F.fujikuroi)；茄腐镰孢菌(F.solani)；轮枝镰孢菌(F.verticillioides)；层出镰孢菌(F.proliferatum)；亚洲镰孢菌(F.asiaticum)等)和不同属的菌(掘氏疫霉(Phytophthoraderchsleri)；辣椒疫霉(Phytophthora capsici)；冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)；杨树溃疡病菌(Botryospaeria dothidea)；Diaporthepescicole；Diaporthe biconispra；橡胶树炭疽(Colletotrichum siamense)；苹果炭疽(Colletotrichum aenigma)；松材线虫(Bursaphelenchusxylophillus)等的DNA作为模板，进行PCR特异性和灵敏度验证，最终获得1个松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的检测新靶标基因Fcir_CM004512.1.g2067.t1。
表1 松树脂溃疡病原菌10个特异性基因序列表
Figure BDA0003166082240000061
Figure BDA0003166082240000071
新靶标基因Fcir_CM004512.1.g2067.t1其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，CDS序列如SEQ ID NO：1，其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示，并基于该新靶标建立灵敏、准确的PCR检测技术体系。
该检测技术体系所使用的PCR检测引物组合物：由上游引物Fci67PCR-F1和下游引物Fci67PCR-R1，各引物序列具体如下：
Fci67PCR-F1：AATCCACGAATAGCACAATG(SEQ ID NO：3)
Fci67PCR-R1：CCTCGGCTTCCAGCCGCACT(SEQ ID NO：4)
提取待检微生物的DNA，取1μL DNA溶液，加入23μL试剂盒中的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；60℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸7分钟。其中，所述1mL所述的检测溶液包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10×PCR反应缓冲液，80mM Mg2+，100μL 1％BSA，50单位Taq酶(TaKaRa)、特异引物Fci67PCR-F1和Fci67PCR-R1 20μM引物，加入超纯水制备成1mL检测溶液。
反应结束后取7μL扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照。每个实验至少重复3次。
实施例2
为了验证松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的特异性引物序列，本实施例以3株松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)菌株和病原真菌以及其它卵菌为供试材料(表2)，采用CTAB法提取发病组织中松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的DNA。具体方法如下：取少量菌丝粉，加900μL 2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩涡混匀，于60℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg/mL RNase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。
表2 用于松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)PCR检测的真菌和卵菌菌株
Figure BDA0003166082240000081
Figure BDA0003166082240000091
PCR检测结果如图1、图2所示，松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)菌株均可特异地扩增出一条313bp的条带，其余病原真菌以及卵菌琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。选择与松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)不同种(藤仓镰孢菌(F.fujikuroi)；茄腐镰孢菌(F.solani)；轮枝镰孢菌(F.verticillioides)；亚洲镰孢菌(F.asiaticum)；层出镰孢菌(F.proliferatum)；禾谷镰孢菌Fusarium graminearum)；尖镰孢菌(F.oxysporum))等和不同属的菌(掘氏疫霉(Phytophthora derchsleri)；辣椒疫霉(Phytophthora capsici)；冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；杨树溃疡病菌(Botryospaeria dothidea)；Diaporthe pescicole；Diaporthe biconispra；橡胶树炭疽(Colletotrichum siamense)；苹果炭疽(Colletotrichum aenigma)；松材线虫(Bursaphelenchus xylophillus)等的DNA作为模板，取1μL DNA溶液，加入23μL试剂盒检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；60℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸7分钟。
证明所设计的特异性引物上游引物和下游引物PCR特异性引物具有种的特异性,Fcir_CM004512.1.g2067.t1是一个特异性较强的新检测靶标。这说明该引物组可被用于生产实践中发病组织或者出入境检验检疫中冬生疫霉菌的快速可靠的检测鉴定。当用于发病组织中存在冬生疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取冬生疫霉菌的DNA，具体过程如下：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10μL 0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5μL上清液加入495μL 0.1mM Tris(pH 8.0)，混匀后取1μL直接用于PCR反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无PCR抑制物存在。
实施例3
用松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的菌株的不同浓度的基因组DNA作为扩增模板，进行PCR扩增反应，使用Nanodro 2000微量分光光度计测出实施例1提取DNA的浓度为100ng·μL-1。将其依次稀释为1ng·μL-1、100pg·μL-1、10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1、10fg·μL-1、1fg·μL-1，根据实施例1-2采用的引物、反应体系和反应条件，对不同浓度的DNA进行PCR检测。结果如图3所示，25μL的反应体系中分别含有1ng·μL-1、100pg·μL-1、10pg·μL-1F.circinatum DNA的出现313bp特异性阳性条带，呈阳性反应，25μL的反应体系中分别含有1pg·μL-1、100fg·μL-1、10fg·μL-1、1fg·μL-1F.circinatum DNA的未出现特异性条带呈阴性反应；结果表明PCR检测的灵敏度达到10pg·μL-1(图3)；
实施例4
活体组织中松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的PCR检测
采用NaOH碱裂解法提取接种樟疫霉菌的发病松针的DNA，将其作为模板用于PCR扩增。取1uL DNA溶液，按实施例3的方法，进行PCR反应。结果如图4所示，其中图4A(1)为人工接种琼脂块的健康松针，图4A(2-4)为人工接种松树脂溃疡病原菌的松针，图4B为PCR扩增反应后，琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果显示，阳性对照(F.circinatum DNA)和接种松树脂溃疡病原菌的发病松针能显示313bp特异性阳性条带，目标条带单一清析，特异性引物能检测出松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)。而健康松针和CK对照未出现特异性条带。
对比例
针对松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的特异性检测靶标的选择和PCR引物组的设计，本发明共初步选择了6个靶标(Fcir_CM004517.1.g9093.t1、Fcir_CM004512.1.g2067.t1、Fcir_CM010400.1.g13749.t1、Fcir_CM004513.1.g3430.t1、Fcir_CM004511.1.g536.t1、Fcir_CM004519.1.g12072.t1)并基于6个靶标设计了多对符合条件的引物，最终筛选出1个特异性检测新靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1，且基于该靶标设计了1组最为特异并灵敏度极高的引物，即实施例1中所使用的引物组合物(上游引物Fci67PCR-F1和下游引物Fci67PCR-F1)。采用其余5个检测靶标设计的引物，通过PCR检测结果显示其特异性不高，以靶标Fcir_CM004517.1.g9093.t1为例，其实际的引物序列为：Fci93PCR-F2:ATCCATCAGTCAACGCTGGT(SEQ ID NO：6)；Fci93PCR-F2:GGAACTGGATTGCCGTGTGG(SEQ ID NO：7)；实施例2中所采用的菌株为供试材料(松树脂溃疡病原菌菌株和其它镰刀菌以及多种病原真菌)，PCR检测结果显示剩余所选引物的特异性差，结果如图5所示。
采用分子检测靶标Fcir_CM004511.1.g536.t1设计的其余引物，引物序列如下：上游引物Fci11PCR-F1和下游引物Fci11PCR-F1，其实际的引物序列为：Fci11PCR-F1:CCATCCTGGACACTTCAGTA(SEQ ID NO：15)；Fci11PCR-R1:GAGGTAGGATGTCAGTGCTG(SEQ IDNO：16)；以实施例2中所采用的菌株为供试材料(3株松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)菌株和其它卵菌以及病原真菌)，PCR检测结果显示该引物的特异性高，但灵敏度差，仅10ng·μL-1，结果如图6所示。
而本发明最终筛选出高信赖度特异性分子检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1及基于该靶标设计的特异性引物(Fci67PCR-F1、Fci67PCR-R1)，经过灵敏度检测，25μL的反应体系中分别含有1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)DNA；用不同浓度的松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的标准菌株的基因组DNA作为扩增模板，进行PCR扩增，反应重复实验3次。3次重复实验的结果一致，扩增结果如图3所示。在基因组DNA浓度为10pg·μL-1时，PCR检测能够检测出特异性条带，证明发生特异性扩增，检测结果判为阳性。而在基因组DNA浓度为1pg·μL-1时，PCR产物经检测没有发现特异性条带，证明没有发生特异性扩增，检测结果判为阴性，即PCR法检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)基因组DNA的灵敏度为10pg·μL-1。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 松树脂溃疡病病原菌检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1及应用
<130> 2021
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 543
<212> DNA
<213> Fusarium circinatum
<400> 1
atggcctcaa aaccagtttt acagctccgc aaatgtttgg tgcgggccta caacgacgaa 60
gatactcact ccttggccaa ggcagcaaac aatccacgaa tagcacaatg gatgtgcaac 120
acatttccac agccttacac cataaaggac gcagaaaatt ggatatctat caccaacaca 180
ccatcaaaac ttcgcgattt tgcgatttgc gaaaccagtg gatctctggt cattggcggc 240
attggcctca aagcacgagg cgacattcac taccgtacca tggaaattgg ctactggatc 300
tgcgaggagt attggcatca tggaattgcc accgaagtcg tctctgcctt ctcggactgg 360
gcttttgaaa actttgcgca cctagtgcgg ctggaagccg aggtgttcga aggaaacttc 420
ggaagttgtc gtgttcttga gaaggctggc tttgagtttg aagtaaagcg gagagcagcc 480
atcgaaaagt ttggggatgt gaaggacacc ttcatatatg tcaaatttag agctggatac 540
tag 543
<210> 2
<211> 180
<212> PRT
<213> Fusarium circinatum
<400> 2
Met Ala Ser Lys Pro Val Leu Gln Leu Arg Lys Cys Leu Val Arg Ala
1 5 10 15
Tyr Asn Asp Glu Asp Thr His Ser Leu Ala Lys Ala Ala Asn Asn Pro
20 25 30
Arg Ile Ala Gln Trp Met Cys Asn Thr Phe Pro Gln Pro Tyr Thr Ile
35 40 45
Lys Asp Ala Glu Asn Trp Ile Ser Ile Thr Asn Thr Pro Ser Lys Leu
50 55 60
Arg Asp Phe Ala Ile Cys Glu Thr Ser Gly Ser Leu Val Ile Gly Gly
65 70 75 80
Ile Gly Leu Lys Ala Arg Gly Asp Ile His Tyr Arg Thr Met Glu Ile
85 90 95
Gly Tyr Trp Ile Cys Glu Glu Tyr Trp His His Gly Ile Ala Thr Glu
100 105 110
Val Val Ser Ala Phe Ser Asp Trp Ala Phe Glu Asn Phe Ala His Leu
115 120 125
Val Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Glu Gly Asn Phe Gly Ser Cys Arg
130 135 140
Val Leu Glu Lys Ala Gly Phe Glu Phe Glu Val Lys Arg Arg Ala Ala
145 150 155 160
Ile Glu Lys Phe Gly Asp Val Lys Asp Thr Phe Ile Tyr Val Lys Phe
165 170 175
Arg Ala Gly Tyr
180
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
aatccacgaa tagcacaatg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
cctcggcttc cagccgcact 20
<210> 5
<211> 519
<212> DNA
<213> Fusarium circinatum
<400> 5
atgcgcacca acttcgaccc cgttgataag catacgaaag acaagtcaat atccgcttat 60
gagcgcataa cgactgtttt ctttcggtct caccactttg tccctctgaa atccatcagt 120
caacgctggt tgaaagacat cactgtctgc acgggttgct acgacagctt tgacgatctc 180
tggtcatgca ctcaggcctc agcaccagcg gttcatctct accttgcaaa attcggcgcg 240
agctacatgt acagcagggg ctcggtggct cagaagcagg cccgtgataa gcctgccagc 300
atcatcgcat ggacaaatga ccgtttccac acggcaatcc agttccgcga cccagatacc 360
agctgcagta acactctcct tgaccaggga cctcagattc ccgatgaaaa cgagtatagc 420
ggcaactctt tcctcgcccc ggctcgaggc gcaattgctg gacgacggac atcacggcgc 480
tcctcaagat ccacctcacc ttggcactca cagagatga 519
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
atccatcagt caacgctggt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
ggaactggat tgccgtgtgg 20
<210> 8
<211> 546
<212> DNA
<213> Fusarium circinatum
<400> 8
atggacactc ctatgatgta ttcgccaacc ttcgagccac ctttcgccat tgataagtca 60
agagacagac tacaggtgcg actccgtaag gatcaccttg aaggatacgt cctcgtcaat 120
ctccctcact acgatcccat tcgggctttg gaagctgcca tgtctgtggt taacgatttt 180
gacatcacga cgctgaacaa gccgcatggg agcaactcgt ctggttggat gtctttgacc 240
gagcatcctt cgtgcaatgc cacgaccctg agcgccggtg ttcacttctc ccttccttta 300
gccgcgctgc gagggaacca taaccagacg agacttgttc ctccggccga caagcagcag 360
gacaaccacc agaaggttgt tgctcctacc ttgaaggctc ctcctgtcgg cgtgaagggg 420
acgaagagaa cccgtcccga ggacggcggt tacgaacaac cttctcccaa gcgtccggat 480
acccaaggct tgtctcggtg gttcccctgg agtagtacca gtccagagcc aaacagtgga 540
aattga 546
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
aggatcacct tgaaggatac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
accttctggt ggttgtcctg 20
<210> 11
<211> 558
<212> DNA
<213> Fusarium circinatum
<400> 11
atgacaccct tcacactcga ccaaaccaaa gttccttctg cggccatctt ggacgagaat 60
gatgttcttc cgagccttta tccgggagcg aaccaggatg aactcgccgg gaaggccaag 120
gcttaccttg ccaactacgg cgccaacttt aagaaagata ttattactgg gacccgaggt 180
ctctatgtct atactgcatc cggtcacagg gtcctggatt ggacatctgg ccaaatgtcc 240
tgtcttttgg gccacggcca ttctgagatt gtcaaagtga tcgtagagca tgccatgaat 300
ctcgaccatc tgttctctgg catgatcttg ccgcctgtca tctccctcgg agaacgcctt 360
tgcaacgctc tcccttctgg ccttgataag tccttcttcc tctccacagg tggcgaaagc 420
aatgaggcag caatcaagat ggccaagaca tataccgaca aatttgagat cgtcggcctc 480
ggcgcttcct ggcacggagt gacaggccag gccattgctt cgcaatacca ctggggcccc 540
aaggccacgg accattaa 558
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
aggcttacct tgccaactac 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
cttgattgct gcctcattgc 20
<210> 14
<211> 564
<212> DNA
<213> Fusarium circinatum
<400> 14
atggtctttg cccctcagga tcactcgggc tcttcagctg cccagctcga gattaatctc 60
aagctttgcg aactcagaga acactggctc gtctccgaac tcatcccctc gccacaacaa 120
gatgggacca tcctggacac ttcagtactt gatctacacc aaaactattt atatattttc 180
ctcaatatga caattctctt attatacgag cccgaggcac ttacactgca gaattaccag 240
acagcggaag cagttcaagt tcaaaaaagc tgccgacgta tcttgcaaag agtcgcctat 300
cttcacagcc gcagagtggt caatcttctc cctcttgaaa tcctcacagc ccttcaatca 360
gcactgacat cctacctcgt caggaaaacg gagaatgtgg ccagcaccgc tccggtatct 420
gaggtgcact ttcttcagtg catccaggca ttagataccc ttggccacat ccatggcggt 480
gtggcaagag acgctattca gtatatagac aatctctaca actcaacgat ccctacgatt 540
acggatgaag cattatggga ttaa 564
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
ccatcctgga cacttcagta 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
gaggtaggat gtcagtgctg 20
<210> 17
<211> 636
<212> DNA
<213> Fusarium circinatum
<400> 17
atgaagtccc catcaatgat tgaagaggat ccattgaact ctggcatgaa tgtcaccgaa 60
aactttctgc aaaactatcc aaatgattgg gatcttgcag aatgctttga tgacctgggt 120
gatctcacag aagcaattca gtgcagtcaa ggtcgcgaaa ccggccaaga tcagagccag 180
ttcgatcaag atacaagtgt catgatttgg acctcggata acgagtatgg cgcgcgatgc 240
aagcatcagc tatccgattc tgtgacctca gctaacaatc tctcacagag tgacgcaatc 300
ccagctacgc aaagtcaagc acaaaaacaa tcagggcgcg ctactacgga tcagaataca 360
ggtgcacata tttcacccca agaacccttg aataggccaa cagcgtcaag ctctcgatct 420
ttctcaaatt caaaccgcga tggctatgct acagactgca ccagggagcc gtacgacttc 480
ggctctccgg acgacgcagg ccatcctcga agaagatcgc gaaactgtcc gtccttggag 540
ttaccatttt ctaaggagat tggcagtcca gaagcggcgg ttgatacagg ttccagatcc 600
caatacttta aacaccataa gaacggaaac ccctga 636
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
gacctcggat aacgagtatg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
gaggatggcc tgcgtcgtcc 20

Claims (7)

1.一种松树脂溃疡病原菌(Fusarium circinatum)的特异性检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1，其特征在于，所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种检测权利要求1所述的特异性检测靶标Fcir_CM004512.1.g2067.t1的引物对，其特征在于，其正向引物Fci67PCR-F1序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物Fci67PCR-R1序列如SEQ ID NO：4所示。
3.权利要求2所述的引物对在检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)中的应用。
4.一种检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量的含有权利要求2所述的引物对的检测溶液，其中所述引物对浓度为20μM。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测溶液还包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10×PCR反应缓冲液，80mM Mg2+，100μL 1％BSA，50单位Taq酶。
6.权利要求5所述的试剂盒在检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)中的应用。
7.一种检测松树脂溃疡病原菌(F.circinatum)的方法，其特征在于，包括以下步骤：取1μL检测对象的DNA溶液，加入23μL权利要求5中所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；60℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸7分钟。
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