KR20230057147A - 에르위니아 아밀로보라 및/또는 에르위니아 피리폴리애 검출용 프라이머 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 프라이머 세트; 이를 포함하는 조성물; 이를 포함하는 키트; 및 이를 이용한 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 프라이머 세트; 이를 포함하는 조성물; 이를 포함하는 키트; 및 이를 이용한 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출 방법에 관한 것이다.
에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)는 과수 화상병(fire blight)을 일으키는 원인균으로 밝혀져 있고, 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)는 가지검은마름병(black shoot blight)을 일으키는 원인균으로 밝혀져 있다.
에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)는 배나무를 비롯한 사과나무, 살구나무 등 70여 종의 식물을 침해하는 세균병으로 한국에서는 배나무와 사과나무에 피해가 많다. 병이 주로 꽃, 잎, 가지, 열매, 줄기에 발생하며, 특히 어린가지와 꽃에 발병이 많다. 과수의 궤양 등에서 월동한 원인균이 봄철 생육적기가 되면 세균액(Ooze)을 형성하고, 비, 바람 등을 타고 이동하다가 나무의 꽃, 어린가지, 상처 등으로 침입하여 물관을 타고 이동하며, 잎은 시들고 흑색으로 변하여 화상을 입은 것처럼 마른다. 적절한 환경에서는 1년 안에 나무를 고사시킬 수 있다.
에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 기주(host) 범위는 아시아 배와 몇몇 유럽 배 및 일부 사과품종으로 한정되지만, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)는 사과, 배뿐만 아니라 섬개야광나무(cotoneaster), 산사나무(hawthorn), 마르멜로(quince), 라즈베리(raspberry) 및 관상수도 감염시키는 것으로 알려져 있다.
국내에서 두 병원균 모두 식물방역법에 근거한 예찰 및 방제 대상 균으로 연 4회 정기적 예찰을 실시하고, 발병시 발생주 및 발생과원을 제거하는 공적방제를 실시하고 있다. 이 두 병원균은 사과, 배 등에 발병시 병징이 매우 유사하여 육안으로는 병의 구분이 어렵다. 그러나 공적방제시 화상병과 가지검은마름병의 방제 기준이 달라 두 병의 구분은 필수적이다. 따라서 신속하고 효율적인 병의 진단과 방제를 위해 두 병원균의 동시 검출은 소요되는 시간, 비용, 노력을 효과적으로 절감시켜 매우 유용하다.
에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 검출 프라이머로서 A/B 프라이머가 알려져 있다(Bereswill et al., "Sensitive and Species-Specific Detection of Erwinia amylovora by Polymerase Chain Reaction Analysis" 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58(11):3522-3526.). 또한 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출 프라이머로서 CPS1/2C 프라이머가 알려져 있다(Kim et al., "Molecular Detection and Differentiation of Erwinia pyrifoliae and Host Range Analysis of the Asian Pear Pathogen" 2001. Plant Dis. 85:1183-1188.). 또한 한국특허공개 제10-2018-0129253호는 에르위니아 아밀로보라 검출용 LAMP(loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트를 개시하고 있다.
그러나 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 동시에 검출할 수 있는 방법이나 프라이머 세트에 대해서는 현재까지 공개된 바가 없다.
이에, 본 발명은 과수 화상병의 원인균인 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 가지검은마름병의 원인균인 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 동시에 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.
본 발명자들은 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 동시에 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) CFBP1430 균주의 유전체 정보(GenBank accession NC_013961.1, 1606178..1606828, protein ID WP_162010770.1)의 가상(hypothetical) 단백질 유전자를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하였다.
이에, 상기 가상 단백질 유전자에 기초하여 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에서 각각 205 bp와 761 bp 크기의 단편을 동시에 증폭시키는 RS24580-205F와 RS24580-205R 프라이머 세트를 제작하고 이를 사용하여 여러 미생물 균주를 대상으로 PCR 증폭 시험을 수행한 결과 상기 프라이머 세트가 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 균주에서만 특이적으로 동시에 증폭 산물을 생성함을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
이상에 기초하여, 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출 방법을 제공한다:
(i) 과수 화상병(fire blight) 및/또는 가지검은마름병(black shoot blight) 의심 시료에 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
(ii) DNA 증폭 산물을 검출하는 단계.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 과수 화상병의 원인균인 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 가지검은마름병의 원인균인 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 동시에 특이적으로 우수한 효율로 단시간 내에 검출할 수 있다. 따라서 과수 화상병 및 가지검은마름병의 동시 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
특히 본 발명에 따른 프라이머 세트는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)에 대해 기존의 A/B 프라이머보다 검출 민감도가 높아 시료의 양이 적은 경우에도 우수한 효율로 검출할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 프라이머 세트는 세계 최초로 하나의 프라이머로 두 가지 균을 동시에 검출할 수 있어, multiplex PCR이 필요 없이 매우 간편하게 동시 진단을 할 수 있다.
도 1a 및 1b는 본 발명에 따른 프라이머 세트로 에르위니아 아밀로보라 CFBP1430 균주의 증폭되는 부위를 blast한 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 검색되는 모든 균주의 리스트이고, 도 1b는 해당 균주의 매치되는 부위를 그림으로 나타냈을 때 결과이다.
도 1c 및 1d는 본 발명에 따른 프라이머 세트로 에르위니아 피리폴리애 DSM12163의 증폭되는 부위를 blast한 결과를 나타낸 것으로, 도 1c는 검색되는 모든 균주의 리스트이고, 도 1d는 해당 균주의 매치되는 부위를 그림으로 나타냈을 때 결과이다.
도 2는 본 발명의 프라미어 세트를 사용하여 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 포함한 여러 세균 균주의 게놈 DNA를 PCR 증폭시킨 후 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1 내지 4는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 균주에 해당하고, 레인 5 내지 10은 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 균주에 해당하며, 레인 11 내지 23은 그 외의 에르위니아(Erwinia) 종의 균주(레인 11 내지 13), 펙토박테리움(Pectobacterium) 종의 균주(레인 14 내지 19), 딕케야(Dickeya) 종의 균주(레인 20), 판토에아(Pantoea) 종의 균주(레인 21 내지 23)에 해당하고, (-)로 표시된 레인은 음성 대조군(증류수)이고, M 레인은 크기 마커로서 1 kb+(Ⅰ) DNA ladder(Inclone biotech)이다.
도 3은 프라이머 종류 및 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 게놈 DNA 농도에 따른 PCR의 검출 민감도 분석 결과를 나타낸 것이다. (A): A/B 프라이머, (B): 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머, (C): CPS1/2C 프라이머, (D): 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머. (A) 및 (B)는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) TS3128 균주에 대한 결과이고, (C) 및 (D)는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) CP12327 균주에 대한 결과이다. 각각의 레인 1 내지 7은 각 균주의 게놈 DNA의 10배 연속 희석으로서 각각 5ng, 500 pg, 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg에 해당하고, (-)로 표시된 레인은 음성 대조군(증류수)이고, M 레인은 크기 마커로서 1 kb+(Ⅰ) DNA ladder(Inclone biotech)이다.
도 4는 과수 화상병 나뭇가지 시료와 가지검은마름병균 현탁액 시료에 대하여 각각 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 검출 여부를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 A/B 프라이머(좌측) 및 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머(우측)를 사용하여 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)를 검출한 결과이다. (B)는 CPS1/2C 프라이머(좌측) 및 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머(우측)를 사용하여 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 검출한 결과이다. (A)의 레인 1 내지 10은 과수 화상병 나뭇가지 시료에 해당하고, (B)의 레인 1 내지 10은 가지검은마름병균 현탁액 시료에 해당하며, (+)로 표시된 레인은 양성 대조군이고, (-)로 표시된 레인은 음성 대조군(증류수)이고, M 레인은 크기 마커로서 1 kb+(Ⅰ) DNA ladder(Inclone biotech)이다.
도 1c 및 1d는 본 발명에 따른 프라이머 세트로 에르위니아 피리폴리애 DSM12163의 증폭되는 부위를 blast한 결과를 나타낸 것으로, 도 1c는 검색되는 모든 균주의 리스트이고, 도 1d는 해당 균주의 매치되는 부위를 그림으로 나타냈을 때 결과이다.
도 2는 본 발명의 프라미어 세트를 사용하여 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 포함한 여러 세균 균주의 게놈 DNA를 PCR 증폭시킨 후 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1 내지 4는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 균주에 해당하고, 레인 5 내지 10은 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 균주에 해당하며, 레인 11 내지 23은 그 외의 에르위니아(Erwinia) 종의 균주(레인 11 내지 13), 펙토박테리움(Pectobacterium) 종의 균주(레인 14 내지 19), 딕케야(Dickeya) 종의 균주(레인 20), 판토에아(Pantoea) 종의 균주(레인 21 내지 23)에 해당하고, (-)로 표시된 레인은 음성 대조군(증류수)이고, M 레인은 크기 마커로서 1 kb+(Ⅰ) DNA ladder(Inclone biotech)이다.
도 3은 프라이머 종류 및 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 게놈 DNA 농도에 따른 PCR의 검출 민감도 분석 결과를 나타낸 것이다. (A): A/B 프라이머, (B): 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머, (C): CPS1/2C 프라이머, (D): 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머. (A) 및 (B)는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) TS3128 균주에 대한 결과이고, (C) 및 (D)는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) CP12327 균주에 대한 결과이다. 각각의 레인 1 내지 7은 각 균주의 게놈 DNA의 10배 연속 희석으로서 각각 5ng, 500 pg, 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg에 해당하고, (-)로 표시된 레인은 음성 대조군(증류수)이고, M 레인은 크기 마커로서 1 kb+(Ⅰ) DNA ladder(Inclone biotech)이다.
도 4는 과수 화상병 나뭇가지 시료와 가지검은마름병균 현탁액 시료에 대하여 각각 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 검출 여부를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 A/B 프라이머(좌측) 및 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머(우측)를 사용하여 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)를 검출한 결과이다. (B)는 CPS1/2C 프라이머(좌측) 및 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머(우측)를 사용하여 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 검출한 결과이다. (A)의 레인 1 내지 10은 과수 화상병 나뭇가지 시료에 해당하고, (B)의 레인 1 내지 10은 가지검은마름병균 현탁액 시료에 해당하며, (+)로 표시된 레인은 양성 대조군이고, (-)로 표시된 레인은 음성 대조군(증류수)이고, M 레인은 크기 마커로서 1 kb+(Ⅰ) DNA ladder(Inclone biotech)이다.
본 발명자들은 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 동시에 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) CFBP1430 균주의 유전체 정보(GenBank accession NC_013961.1, 1606178..1606828, protein ID WP_162010770.1)의 가상(hypothetical) 단백질 유전자를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하였다.
이에, 상기 가상 단백질 유전자에 기초하여 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에서 각각 205 bp와 761 bp 크기의 단편을 동시에 증폭시키는 신규의 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머 세트의 염기서열은 아래와 같다.
● RS24580-205F : 5'-CAC TGC GCC TGT TGT TCA-3' (18mer, 서열번호 1)
● RS24580-205R : 5'-ATG TAT CTG GTA GCC GGG TAA GTT-3' (24mer, 서열번호 2)
본 발명자들은 상기 프라이머 세트를 사용하여 여러 미생물 균주를 대상으로 PCR 증폭 시험을 수행한 결과 상기 프라이머 세트가 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 균주에서만 특이적으로 동시에 증폭 산물을 생성함을 확인하였다.
이에, 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 프라이머 세트는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 동시 검출용일 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 RS24580-205F 프라이머는 정방향(forward) 프라이머이고, 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 RS24580-205R 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머이다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭시 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에서 각각 205 bp와 761 bp 크기의 밴드(band)가 뚜렷하게 검출되므로 정확하고 용이한 검출이 가능하다.
보다 구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 가상 단백질(hypothetical protein) 유전자의 384번 위치의 염기에서부터 588번 위치의 염기까지 205 bp 크기의 단편을 특이적으로 증폭시킬 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 파타틴-유사 포스포리파제 패밀리 단백질(patatin-like phospholipase family protein) 유전자의 768번 위치의 염기에서부터 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 금속-의존성 하이드롤라제(metal-dependent hydrolase) 유전자의 499번 위치의 염기까지 761 bp 크기의 단편을 특이적으로 증폭시킬 수 있다.
본 명세서에 있어서 용어 "화상병균(Erwinia amylovora)"은 "에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)"와 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 있어서 용어 "가지검은마름병균(Erwinia pyrifoliae)"은 "에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)"와 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 있어서 용어 "프라이머(primer)"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열에 대하여 1개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 포함할 수 있다. 즉, 염기서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡핑화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머 세트는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol.68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국특허 제4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 PCR(consensus sequence primed PCR; CP-PCR), 임의적 프라이밍 PCR(arbitrarily primed PCR; AP-PCR), 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 PCR(multiplex PCR), 이중 PCR(nested-PCR), 단일 튜브 이중 PCR(single tube nested-PCR), 역전사-PCR(reverse transcription PCR; RT-PCR), 역 PCR(inverse PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 및 실시간 정량적 PCR(real-time quantitative PCR; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
"중합효소 연쇄반응(PCR)"이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭 반응을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 증폭 반응 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 형광 측정, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 에르위니아 아밀로보라와 에르위니아 피리폴리애의 동시 검출용일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 PCR(consensus sequence primed PCR; CP-PCR), 임의적 프라이밍 PCR(arbitrarily primed PCR; AP-PCR), 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 PCR(multiplex PCR), 이중 PCR(nested-PCR), 단일 튜브 이중 PCR(single tube nested-PCR), 역전사-PCR(reverse transcription PCR; RT-PCR), 역 PCR(inverse PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 및 실시간 정량적 PCR(real-time quantitative PCR; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 PCR(중합효소 연쇄반응)에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 키트는 PCR에 사용될 수 있고, 이때 상기 키트는 DNA 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트에는 프라이머 세트 및 DNA 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 외에도 핵산 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 핵산 추출용 시약, 데옥시뉴클레오티드, 핵산 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정 핵산 중합효소, 완충액(버퍼) 및 dNTP 등이 포함될 수 있다. 상기 프라이머 세트 및 핵산 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약은 동결 건조된 상태로 플라스틱 튜브에 담아 제공될 수 있으며, 상기 핵산은 바람직하게 DNA일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 동시 검출용 키트일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 하기 단계를 포함하는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출 방법에 관한 것이다:
(i) 과수 화상병(fire blight) 및/또는 가지검은마름병(black shoot blight) 의심 시료에 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
(ii) DNA 증폭 산물을 검출하는 단계.
상기 (i) 단계의 시료는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 감염이 의심되는 것은 모두 포함될 수 있으며, 예컨대 이들 병균 자체, 또는 이들 병균이 감염된 것으로 예상되는 과수의 잎, 꽃, 가지, 줄기, 열매 등일 수 있다.
일 구현예에서, 화상병 및/또는 가지검은마름병에 걸린 과수로부터 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 순수 분리 및 동정은 다음과 같이 수행될 수 있다; ① 화상병 및/또는 가지검은마름병 과수의 잎 또는 가지/줄기를 표면 소독, ② 병 발생 부위 경계 영역을 5Х5 ㎜ 크기로 자른 후, 이들 5 내지 10조각을 증류수에 넣고 비드(bead)로 마쇄 및 30분 후 세균 추출, ③ 세균 추출액 10 μl를 TSA(Tryptic Soy Agar)에 떨어뜨려 도말(streaking) 후 27℃에서 2일간 배양 ④ 대조군과 비교하여 균총 선발.
일 구현예에서, 상기 (i) 단계의 DNA 증폭 반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 PCR(consensus sequence primed PCR; CP-PCR), 임의적 프라이밍 PCR(arbitrarily primed PCR; AP-PCR), 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 PCR(multiplex PCR), 이중 PCR(nested-PCR), 단일 튜브 이중 PCR(single tube nested-PCR), 역전사-PCR(reverse transcription PCR; RT-PCR), 역 PCR(inverse PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 및 실시간 정량적 PCR(real-time quantitative PCR; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 PCR(중합효소 연쇄반응)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 (i) 단계에 있어서, 과수 화상병 및/또는 가지검은마름병 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다.
일 구현예에서, 상기 (i) 단계에 있어서, 과수 화상병 및/또는 가지검은마름병 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 경우, DNA 증폭 반응은 PCR에 의해 수행될 수 있다.
상기 (ii) 단계의 DNA 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정에 의해 수행될 수 있으며, 이를 통해 표적 유전자의 증폭 여부를 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (ii) 단계의 DNA 증폭 산물의 검출은 전기영동에 의해 수행될 수 있으며, 이때 표적 유전자의 증폭 여부는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 가상 단백질(hypothetical protein) 유전자의 384번 위치의 염기에서부터 588번 위치의 염기까지 205 bp 크기의 단편의 증폭 여부를 통해 확인하고/하거나 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 파타틴-유사 포스포리파제 패밀리 단백질(patatin-like phospholipase family protein) 유전자의 768번 위치의 염기에서부터 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 금속-의존성 하이드롤라제(metal-dependent hydrolase) 유전자의 499번 위치의 염기까지 761 bp 크기의 단편의 증폭 여부를 통해 확인할 수 있다.
구체적으로는 PCR 증폭 산물을 전기영동하여 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)의 경우는 205 bp 크기의 표적 밴드, 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 경우는 761 bp 크기의 표적 밴드 형성 여부의 확인을 통해 시료 내 화상병균 및/또는 가지검은마름병균의 포함 여부를 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 세균 균주 배양 및 총 DNA 추출
(1) 세균 균주 및 배양 조건
본 발명에서 사용된 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 포함한 기타 미생물은 대한민국 농촌진흥청에서 진단 확진용 검정 균주(CP/TS), 벨기에의 the Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms(BCCMTM) 및 Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea(KACC)에서 분양받았으며, 이들의 출처를 하기 표 1에 정리하였다. 에르위니아(Erwinia), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea) 균주들은 TSA 배지로 27℃에서 각각 이틀 배양하였다.
[표 1] PCR 특이도(specificity) 시험에 사용된 세균 균주
KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea;
LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms(BCCMTM), Belgium;
TS/CP, Rural Development Administration(RDA), Republic of Korea;
N.D., Not determined.
(2) 총 DNA의 추출
배양된 균주의 총 DNA는 PromegaTM (Madison, USA)사의 게놈 DNA 추출 키트(Wizard® Genomic DNA Purification Kit)를 이용하여 추출하였다.
실시예 2: 특이 프라이머 세트 제작
(1) 염기서열 정보 탐색을 위한 blastn 프로그램 이용 분석
에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 동시에 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) CFBP1430 균주의 유전체 정보(GenBank accession NC_013961.1, 1606178..1606828, protein ID WP_162010770.1)의 가상 단백질(hypothetical protein) 유전자를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하였다(도 1).
도 1a 및 1b는 본 발명에 따른 프라이머 세트로 에르위니아 아밀로보라 CFBP1430 균주의 증폭되는 부위를 blast한 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 검색되는 모든 균주의 리스트이고, 도 1b는 해당 균주의 매치되는 부위를 그림으로 나타냈을 때 결과로, 에르위니아 아밀로보라 외 다른 종은 동일한 서열을 가지는 것이 없음을 확인한 결과이다.
또한 도 1c 및 1d는 본 발명에 따른 프라이머 세트로 에르위니아 피리폴리애 DSM12163의 증폭되는 부위를 blast한 결과를 나타낸 것으로, 도 1c는 검색되는 모든 균주의 리스트이고, 도 1d는 해당 균주의 매치되는 부위를 그림으로 나타냈을 때 결과이다. 에르위니아 피리폴리애 외에 identity가 90% 이상인 균으로 Erwinia sp. Ejp617와 에르위니아 아밀로보라가 확인되었다. Ejp617은 일본형 에르위니아 피리폴리애로 볼 수 있으며(Thapa et al., "Comparative genomics of Japanese Erwinia pyrifoliae strain Ejp617 with closely related erwinias" 2013. Genome. 56:83-90), 에르위니아 아밀로보라는 염기서열이 매우 유사하나 761 bp의 증폭산물이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2 참조).
(2) 특이 프라이머 제작
에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에서 각각 205 bp와 761 bp 크기의 단편을 동시에 증폭하는 RS24580-205F와 RS24580-205R 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
● RS24580-205F : 5'-CAC TGC GCC TGT TGT TCA-3' (18mer, 서열번호 1)
● RS24580-205R : 5'-ATG TAT CTG GTA GCC GGG TAA GTT-3' (24mer, 서열번호 2)
상기 프라이머는 NCBI GenBank에 등록된 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) CFBP1430 균주의 hypothetical protein 유전자 정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작하였다.
실시예 3: PCR 검정
PCR 진행 시 PCR 반응액 조성은 10X reaction buffer(25 mM MgCl2 포함) 0.2 mM, dNTP 0.2 mM, Taq DNA 중합효소 1.25 unit(CellSafe Gyeonggi, Korea), 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 각각 10 pM을 혼합하여 총 25 μl 반응액을 조성하였다. PCR 반응액에 넣은 에르위니아(Erwinia), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea) 균주들의 게놈 DNA의 양은 25 ng이었다. PCR은 C1000 Thermal Cycler PCR system(Bio-Rad laboratories, Inc., USA)을 사용하였다. 반응 조건은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 61℃ 60초, 72℃ 60초로 35회(cycle) 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 반응 후 10 μl의 PCR 산물을 LoadingStar(DYNEBIO, Republic of Korea)로 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 겔에서 전기영동 한 후 UV transilluminator에서 확인하였다. 전기영동 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 레인 1 내지 4는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 균주에 해당하고, 레인 5 내지 10은 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 균주에 해당하며, 레인 11 내지 23은 그 외의 에르위니아(Erwinia) 종의 균주(레인 11 내지 13), 펙토박테리움(Pectobacterium) 종의 균주(레인 14 내지 19), 딕케야(Dickeya) 종의 균주(레인 20), 판토에아(Pantoea) 종의 균주(레인 21 내지 23)에 해당하고(이상 표 1 참조), (-)로 표시된 레인은 음성 대조군(증류수)이고, M 레인은 크기 마커로서 1 kb+(Ⅰ) DNA ladder(Inclone biotech)이다.
도 2의 레인 1 내지 4에 나타난 바와 같이, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 균주에서 205 bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 2의 레인 5 내지 10에 나타난 바와 같이, 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 균주에서 761 bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 그 외 레인 11 내지 23에서는 어떠한 밴드도 관찰되지 않았다.
이와 같이 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)만 특이적으로 증폭시키고, 그 외의 에르위니아(Erwinia) 종은 증폭시키지 않으며, 에르위니아(Erwinia) 종과 형태적으로 유사하거나 유전적으로 매우 가까운 펙토박테리움(Pectobacterium) 종, 딕케야(Dickeya) 종, 판토에아(Pantoea) 종도 증폭시키지 않음을 알 수 있었다. 따라서 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하면 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 균주만을 특이적으로 동시에 우수한 효율로 검출할 수 있다.
실시예 4: 일반 PCR 민감도 분석
일반 PCR 민감도 분석은 A/B 프라이머(Bereswill et al., 1992), CPS1/2C 프라이머(Kim et al., 2001) 서열번호 1 및 2의 RS24580-205F/R 프라이머를 이용하여 진행하였다. PCR 반응액 조성은 10X reaction buffer(25 mM MgCl2 포함) 0.2 mM, dNTP 0.2 mM, Taq DNA 중합효소 1.25 unit(CellSafe Gyeonggi, Korea), 상기 프라이머 각각 10 pM을 혼합하여 총 25 μl 반응액을 조성하였다. PCR 반응액에 넣은 주형(template) DNA는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 5 ng, 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 5 ng을 각각 500 pg, 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg으로 연속 희석(serial dilution)하여 PCR 반응액에 넣었다. PCR은 C1000 Thermal Cycler PCR system(Bio-Rad laboratories, Inc., USA)을 사용하였다. A/B 프라이머, CPS1/2C 프라이머의 PCR 반응 조건은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 50초로 31회(cycle) 반복시킨 후 72℃에서 7분간 반응하였다. 프라이머 RS24580-205F/R의 반응 조건은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 61℃ 60초, 72℃ 60초로 35회(cycle) 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 반응 후 10 μl의 PCR 산물을 LoadingStar(DYNEBIO, Republic of Korea)로 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 겔에서 전기영동 한 후 UV transilluminator에서 확인하였다. 전기영동 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 있어서 (A)는 A/B 프라이머, (B)는 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머, (C)는 CPS1/2C 프라이머, (D)는 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머를 사용한 결과를 나타낸 것이다. (A) 및 (B)는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) TS3128 균주에 대한 결과이고, (C) 및 (D)는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) CP12327 균주에 대한 결과이다. 레인 1 내지 7은 각 균주의 게놈 DNA의 10배 연속 희석으로서 각각 5ng, 500 pg, 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg에 해당하고, (-)로 표시된 레인은 음성 대조군(증류수)이고, M 레인은 크기 마커로서 1 kb+(Ⅰ) DNA ladder(Inclone biotech)이다.
도 3의 (B)에 나타난 바와 같이, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 균주에 대하여 본 발명의 RS24580-205F/R 프라이머를 사용한 결과 205 bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 3의 (D)에 나타난 바와 같이, 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 균주에 대하여 본 발명의 RS24580-205F/R 프라이머를 사용한 결과 761 bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다.
도 3의 전기영동 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2] 프라이머 유형별 에르위니아 아밀로보라(
Erwinia amylovora
)와 에르위니아 피리폴리애(
Erwinia pyrifoliae
) 균주의 PCR 민감도
도 3의 (A) 및 (B)의 결과를 비교해보면, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)의 경우 기존의 프라이머 A/B보다 본 발명의 프라이머 RS24580-205F/R에서 gDNA를 최대 5 fg까지 안정적으로 검출할 수 있었다. 또한 도 3의 (C) 및 (D)의 결과를 비교해보면, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 경우 기존의 프라이머 CPS1/2C와 본 발명의 프라이머 RS24580-205F/R에서 gDNA를 50 pg까지 유사하게 검출할 수 있었다.
실시예 5: 현장 시료를 이용한 PCR 검정
경기도 안성시 과수 화상병(Erwinia amylovora) 발생 농가 내 배나무로부터 병징이 있는 나뭇가지 시료를 채취하였다. 나뭇가지의 껍질을 벗겨낸 후 형성층 부분을 잘라 멸균수에 용출 한 후 PCR를 수행하였다. 가지검은마름병(Erwinia pyrifoliae)은 균 현탁액을 이용하여 PCR를 수행하였다. PCR 반응액 조성은 10X reaction buffer(25 mM MgCl2 포함) 0.2 mM, dNTP 0.2 mM, Taq DNA 중합효소 1.25 unit(CellSafe Gyeonggi, Korea), 프라이머 각각 10 pM을 혼합하여 총 25 μl 반응액을 조성하였다. 프라이머는 A/B, CPS1/2C, RS24580-205F/R를 사용하였다. PCR은 C1000 Thermal Cycler PCR system(Bio-Rad laboratories, Inc., USA)을 사용하였다. 프라이머 A/B, CPS1/2C의 PCR 반응 조건은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 50초로 31회(cycle) 반복시킨 후 72℃에서 7분간 반응하였다. 프라이머 RS24580-205F/R의 반응 조건은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 61℃ 60초, 72℃ 60초로 35회(cycle) 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 반응 후 10 μl의 PCR 산물을 LoadingStar(DYNEBIO, Republic of Korea)로 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 겔에서 전기영동 한 후 UV transilluminator에서 확인하였다. 전기영동 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 과수 화상병 나뭇가지 시료와 가지검은마름병균 현탁액 시료에 대하여 각각 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 검출 여부를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 A/B 프라이머(좌측) 및 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머(우측)를 사용하여 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)를 검출한 결과이고, (B)는 CPS1/2C 프라이머(좌측) 및 본 발명에 따른 RS24580-205F/R 프라이머(우측)를 사용하여 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 검출한 결과이다. (A)의 레인 1 내지 10은 과수 화상병 나뭇가지 시료에 해당하고, (B)의 레인 1 내지 10은 가지검은마름병균 현탁액 시료에 해당하며, (+)로 표시된 레인은 양성 대조군이고, (-)로 표시된 레인은 음성 대조군(증류수)이고, M 레인은 크기 마커로서 1 kb+(Ⅰ) DNA ladder(Inclone biotech)이다.
도 4의 (A)에 나타나 바와 같이, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)의 경우, 프라이머 A/B을 이용한 PCR 결과에서는 모든 시료에서 검출되지 않았으나 프라이머 RS24580-205F/R을 이용한 결과에서는 3개의 시료에서 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)가 검출되었다. 또한 도 4의 (B)에 나타난 바와 같이, 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 현탁액을 이용하여 PCR을 진행한 결과 CPS1/2C와 RS24580-205F/R 모두 동일하게 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)를 안정적으로 검출할 수 있었다.
결론적으로, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 가상 단백질 유전자의 특이 DNA 단편으로부터 제작된 RS24580-205F/R 프라이머는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 특이적인 검출을 위한 PCR 프라이머로 이용이 가능하다는 것을 알 수 있으며, 특히 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)의 경우 기존에 보고된 A/B 프라이머보다 검출 민감도가 높은 것을 확인하였다. 또한 제작한 프라이머는 세계 최초로 하나의 프라이머로 두 가지 균을 동시에 검출할 수 있어, multiplex PCR이 필요 없이 매우 간편하게 동시 진단을 할 수 있다.
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<400> 1
cactgcgcct gttgttca 18
<210> 2
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<212> DNA
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<220>
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<400> 2
atgtatctgg tagccgggta agtt 24
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ttgaaattga tgcgcaaaat tcatattttc aaaaatgtcg ccagatcaaa aggtaaaaac 60
tttgccataa aattagcacg tctgagcatg acaaaatttt tccacaaaac aaagttgagg 120
gcatccgatc gcgttgccct attcttgatg ccgacaaaag gtattggcga cggaataatt 180
tttacaggct tattcaaggc aatgaatgac tctggttata aggtgtatgt tttatccaga 240
aaggacaatt ccttcttcta cagtaaaaac acagatattt caggagttat tgattatgat 300
cttaacagcg gagtgacccg acaggatatt gtggatcagg tcggatttaa tgattttgac 360
atcctaattg aaatgtatgg agacactgcg cctgttgttc atcgcgtcaa tgcaatggct 420
gccatcaatg ccaggcacag attgggcttc aacggtgatg ggatattacg cgcatgcatg 480
gatcatgttt tagagtattc tgaacttgac aaacacctta gccatcgtgg tacatatttg 540
atgcaatact tatccattaa tggaaactta cccggctacc agatacatct tagtgaaatt 600
gacagacagc tcgcttccgg gcttttaaac aagtttgaaa aaacttcata a 651
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ttgggcatac atattccgat tacccctggc aacaccgagc cgttaaggtt gcagcgattc 60
cggccaggca agcttgccct ggtgtgtgaa ggcggcggac agcgcggtat ctttactgcg 120
ggcgtgcttg acgaatttca acgtgctctc ttcaacccct ttcatttaat gcttggcacc 180
tccgctggtg cgcaaaacct ttcagccttt gtctgcgctc aaccgggtta tgcccgccgg 240
gtgatcacgc gttacaccac cagcaaattg ttctttgatc ctctgcggtt tatgcgcggc 300
gggcatttgc tcgatcttga ctggctgatt gatatcacgc gccaggagct gccgctggcg 360
attgacgccg gtgagaagct gtttgcatcc gggcgcgaat tctatatgtg tgcctgccgc 420
agcgacgatt acagcgccag ctacttcgcg cccacttcag aaaactggca cgatttaatc 480
agggcttcca gcgccattcc gggcttctat cgtcccggcg ttaacctgtc gggcgtcagc 540
tatctggatg gcggtatcag cgatgccatt ccggtgcgtg aggcggcgcg gcgcggggct 600
gaaactatcg tcgttatccg caccgtgcca ccgcaaacta ccttgacgcc gcactggctg 660
aaaagggcgg aatgctggtt gagcgatggc gcactgcaac cgctaattaa cattatgcgg 720
ctgcatgaag aaagctatct tcagaccgag catttcatca accagccgcc gggtaagtta 780
cgcattattg aaatctatcc gccgcatccg ctgtccagca tggcgctcgg cagccgggtg 840
gcctcgttga ataaagatta tcatctgggc agacgctgcg gacgttactt ccttgccacg 900
cttggccagc ggctgaacga tgatgctcaa cagatgcgtc agcagattgt gataccgcct 960
gcccccgtgg ccaatgaggc agaccgtctg ggagctgata ctgattatga caaggggtcg 1020
ctggcatga 1029
<210> 5
<211> 777
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Erwinia pyrifoliae DSM12163 metal-dependent hydrolase
<400> 5
atgacgccat gttttgtcga tacgcactgc catttcgatt ttccgccctt cgttggcgat 60
gaagaggcaa gtctgcaacg ggcggctcag gccggggttg agaaaatgat tgccgtcagc 120
gtatcggcca cgcgttttga tcgggtgatg gcgctggcag aacggcatta tgcggtgtat 180
gccgcgcttg ggctgcatcc gatggcggtg gcagagcata atgagcaaag ccttgtcgca 240
cttgaacagc atctgcaacg gcgtcatcac aaagtggtcg ccatcggcga aatcggcctc 300
gatctgttta tcgataaccc gcagtttgag cggcaacagg cactgcttga tgcgcagctg 360
cgcctggcgc gtgattacag tctgccggtg atcctgcatt cgcgccgcac tcatgacaag 420
ctggcgcagc agctgcggcg tttcgatctg gccaggcgtg gcgtggtgca cggttttgcc 480
ggaagtgaac agcaggcgct ggcgtttatc cgtgccggat atgcgattgg cgtcgggggt 540
actatcacct atgaacgcgc cagcaaaact cgtcaaacca ttgcccgtct gccgctgacc 600
tcactggtgc tggaaaccga ctcacccgat atgccgctgc aaggttttca ggggcagccc 660
aaccgccctg agcgagtcag agatatctgg cacgccctgt gcgctctgcg cgatgaatcc 720
ccgcaacaaa taaccgaaac gctacgcgag aatacccgta ctctgtttgg cgtgtga 777
Claims (20)
- 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및
서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 동시 검출용인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 프라이머 세트가 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 PCR(consensus sequence primed PCR; CP-PCR), 임의적 프라이밍 PCR(arbitrarily primed PCR; AP-PCR), 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 PCR(multiplex PCR), 이중 PCR(nested-PCR), 단일 튜브 이중 PCR(single tube nested-PCR), 역전사-PCR(reverse transcription PCR; RT-PCR), 역 PCR(inverse PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 또는 실시간 정량적 PCR(real-time quantitative PCR; RQ-PCR)에 사용되는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 프라이머 세트가 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 가상 단백질(hypothetical protein) 유전자의 384번 위치의 염기에서부터 588번 위치의 염기까지 205 bp 크기의 단편을 특이적으로 증폭시키는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 프라이머 세트가 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 파타틴-유사 포스포리파제 패밀리 단백질(patatin-like phospholipase family protein) 유전자의 768번 위치의 염기에서부터 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 금속-의존성 하이드롤라제(metal-dependent hydrolase) 유전자의 499번 위치의 염기까지 761 bp 크기의 단편을 특이적으로 증폭시키는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 조성물.
- 제6항에 있어서, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 동시 검출용인, 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 키트.
- 제8항에 있어서, 키트가 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 PCR(consensus sequence primed PCR; CP-PCR), 임의적 프라이밍 PCR(arbitrarily primed PCR; AP-PCR), 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 PCR(multiplex PCR), 이중 PCR(nested-PCR), 단일 튜브 이중 PCR(single tube nested-PCR), 역전사-PCR(reverse transcription PCR; RT-PCR), 역 PCR(inverse PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 또는 실시간 정량적 PCR(real-time quantitative PCR; RQ-PCR)에 사용되는 것인, 키트.
- 제9항에 있어서, 키트가 PCR(중합효소 연쇄반응)에 사용되는 것인, 키트.
- 제10항에 있어서, DNA 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함하는, 키트.
- 제8항에 있어서, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 동시 검출용인, 키트.
- (i) 과수 화상병(fire blight) 및/또는 가지검은마름병(black shoot blight) 의심 시료에 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
(ii) DNA 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는,
에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및/또는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출 방법. - 제13항에 있어서, (i) 단계의 DNA 증폭 반응이 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 PCR(consensus sequence primed PCR; CP-PCR), 임의적 프라이밍 PCR(arbitrarily primed PCR; AP-PCR), 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 PCR(multiplex PCR), 이중 PCR(nested-PCR), 단일 튜브 이중 PCR(single tube nested-PCR), 역전사-PCR(reverse transcription PCR; RT-PCR), 역 PCR(inverse PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 또는 실시간 정량적 PCR(real-time quantitative PCR; RQ-PCR)인, 방법.
- 제13항에 있어서, (i) 단계에 있어서 과수 화상병 및/또는 가지검은마름병 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제15항에 있어서, (i) 단계의 DNA 증폭 반응이 PCR인, 방법.
- 제13항에 있어서, (ii) 단계의 DNA 증폭 산물의 검출이 전기영동에 의해 수행되는, 방법.
- 제17항에 있어서, 표적 유전자의 증폭 여부는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 가상 단백질(hypothetical protein) 유전자의 384번 위치의 염기에서부터 588번 위치의 염기까지 205 bp 크기의 단편의 증폭 여부를 통해 확인하는 것인, 방법.
- 제17항에 있어서, 표적 유전자의 증폭 여부는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 파타틴-유사 포스포리파제 패밀리 단백질(patatin-like phospholipase family protein) 유전자의 768번 위치의 염기에서부터 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 금속-의존성 하이드롤라제(metal-dependent hydrolase) 유전자의 499번 위치의 염기까지 761 bp 크기의 단편의 증폭 여부를 통해 확인하는 것인, 방법.
- 제13항에 있어서, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 에르위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)의 동시 검출이 가능한, 방법.
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