JP7242081B2 - 低分子rnaを検出する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2020年5月8日に出願された韓国特許出願第2020-0055429号の優先権および利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本発明は、低分子RNAの分析方法および検出方法に関する。特に、本発明は、短い塩基配列を有するRNAでも分析でき、当該RNAを高感度かつ高精度で定量的に検出できるため、感染症および癌などの様々な疾患の診断に幅広く利用できる。
生活の質が向上するにつれて、疾患の早期診断への関心が高まり、分子診断技術が疾患の原因となる病原体の遺伝情報を直接検出するため、分子診断技術は、既存の抗体/抗原反応に基づいて疾患の間接的な要因を検出する免疫学的診断技術の欠点を解決し得る技術として注目されている。
技術的課題
本発明によって解決されるべき技術的課題は、低分子RNAを検出する方法を提供することである。
本発明の一態様は、低分子RNAを検出する方法であって、a)検出される標的低分子RNAの相補的配列を含むセンサーDNAを前記標的低分子RNAとハイブリダイズすること;b)テンプレートとしての前記センサーDNAのモジュール領域およびプライマーとしての前記標的低分子RNAを使用して、ポリメラーゼによって重合を実行すること;c)前記センサーDNAの前記モジュール領域および、ステップb)で重合した鎖に対応するプライマーを使用してアンプリコンを増幅および生成すること;ならびに、d)前記アンプリコンの配列を分析すること、を含む、方法である。
本発明の低分子RNAを検出する方法および検出に使用されるセンサーDNAの構成は、フェムトモル(fmol)およびアトモル(amol)レベルにおいて検出限界が非常に低く、感度および精度の両方が従来の低分子RNA検出技術に比べて著しく優れている。
以下、本発明について、実施例を通じて詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
標的としての低分子RNAおよびセンサーDNAを添加した後、DNAポリメラーゼ(XenoT-POL)を使用して、95℃で30秒間、63℃で10分間の重合反応を行った。その後、センサーおよびRNAをエンドヌクレアーゼを使用して消化した。センサーDNAは、標的低分子RNAに相補的な配列を含む感知領域を含み、感知領域は、標的低分子RNAを感知し、標的低分子RNAとハイブリダイズし、本発明では「センサーDNA」と名付けられる。センサーDNAはバーコード領域を含み得て、標的の低分子RNAの数は、バーコード領域のみを数えることによって定量的に測定され得る。
標的低分子RNAとして20fmolのmiR210およびセンサー21(miRNA21センシング領域を含むセンサーDNA)およびセンサー210(miR210センシング領域を含むセンサーDNA)をそれぞれ20fmol混合した後、実施例1の方法を用いて様々な種類のセンサーDNAを混合した状態でさえも、標的miRNAが正確に検出されたかどうかを確認した。
miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen社製)を使用して、ヒト血液サンプルからRNAを精製および抽出した。実施例1の方法を用いて、標的miRNAが正確に検出されたかどうかを確認した。
3-1.1種類の標的低分子RNAに複数のセンサーを混合した場合の定量的検出能力の確認
標的低分子RNAとして20fmolのmiRNA21とセンサー21およびセンサー210のそれぞれ20fmolを混合した後、実施例1の方法を用いて、様々な種類のセンサーDNAを混合した状態でも標的miRNAの検出が定量的に確認できるかどうかを検証した。センサー21、センサー210、およびmiRNA21のそれぞれ20fモルを実験条件下で適切に混合した後、2μlの反応緩衝液(200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2SO4、100mM KCl、20mM MgSO4、1%Triton X-100、および(25℃、pH 8.8))、1μlの10mM dNTP、および2ユニットのXenoT-POLを添加し、得られた混合物を30秒間95℃で加熱した後、63℃で10分間インキュベートした。MEGAquick-spinTMPlusTotalFragment DNA Purification Kitを使用して反応サンプルをクリーンアップし、60μlの蒸留水で溶出した。20μlのサンプルをヌクレアーゼ混合物(40mM酢酸ナトリウム、25℃、pH 4.5、300mM NaCl、2mM ZnSO4、および200ユニットのS1ヌクレアーゼ)に添加し、得られた混合物を37℃で11分間インキュベートした。その後、MEGAquick-spinTMPlus Total Fragment DNA Purification Kitを使用して混合物をクリーンアップし、60μlの蒸留水で溶出した。5’末端にリン酸が結合したプライマーを用いて、98℃で2分間の1サイクル、ならびに98℃で10秒間および64.5℃で10秒間の30サイクルの条件でPCRを行い、そしてアンプリコンをクリーンアップした。その後、500ユニットのT3 DNAリガーゼを、66mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、1 mM DTT、および7.5%ポリエチレングリコール(PEG 6000)(25℃、pH 7.6)の条件下で、500ngのアンプリコンへと添加した後、得られた混合物を25℃で10分間インキュベートした。その後、混合物をクリーンアップした後、40μlの溶出DNA、1μlの1mM dATP、1μl(5ユニット)のtaq DNAポリメラーゼ、5μlの反応バッファー(200mM Tris-HCl/pH 8.8)、500mM KCl、25mM MgCl2、100mM β-メルカプトエタノールおよび蒸留水を混合することにより、50μlの混合物を生成し、72℃で20分間インキュベートした。MEGAquick-spinTMPlusTotal Fragment DNA Purification Kitを使用して、dATPテールDNA産物をクリーンアップした。その後、ナノポアシーケンシングのためのアダプターライゲーション(SQK-LSK109)、AMPure XPビーズを使用したクリーンアップ、フローセルのプライミング、およびフローセルのロードのプロセスを、ナノポアシーケンシングプロトコルに従って実行した。その後、得られたナノポアシーケンシングファイル内のセンサー21およびセンサー210のバーコード領域シーケンスをカウントすることにより、検出結果を確認した。
標的RNAとしてのmiRNA21およびmiRNA210は、それぞれ7fmolおよび20fmolの異なる濃度で混合され、Sensor21およびSensor210はそれぞれ20fmol混合された。その後、実施例1の方法を用いて、様々な種類のセンサーDNAを複数の標的低分子RNAと混合した状態でも、標的miRNAの検出が定量的に確認し得るかどうかを検証した。
miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen社製)を使用して、ヒト血液サンプルからRNAを精製および抽出した。
Claims (10)
- 低分子RNAを検出する方法であって、
a)検出される標的低分子RNAの相補的配列を含むセンサーDNAを前記標的低分子RNAとハイブリダイズすること;
b)テンプレートとしての前記センサーDNAのモジュール領域およびプライマーとしての前記標的低分子RNAを使用して、ポリメラーゼによって重合を実行すること;
c)前記センサーDNAの前記モジュール領域および、ステップb)で重合した鎖に対応するプライマーを使用してアンプリコンを増幅および生成すること;
複数の前記アンプリコンが前記ステップc)で生成される場合、d)生成された前記アンプリコンをライゲーションすること;ならびに、
e)前記アンプリコンの配列を分析すること、を含み、
前記センサーDNAが、前記標的低分子RNAの種類に応じた固有のバーコード領域を含み、
前記ステップc)において、前記センサーDNAのバーコード領域を含むことによって前記アンプリコンが増幅され、
前記検出により、前記アンプリコンの数を測定することによって、標的低分子RNAの数の定量的な検出が可能であり、
前記アンプリコンに含まれるバーコードの数を測定することによって前記アンプリコンの数を確認する、方法。 - 前記センサーDNAが3’末端に修飾アミン領域を有する、請求項1に記載の方法。
- ステップc)における前記プライマーが、5’末端に結合したリン酸を有する、請求項1に記載の方法。
- ステップd)が、アンプリコンのライゲーションの後に、シーケンシングのためのアダプターをライゲーションされたアンプリコンの両端に連結することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- e)ステップd)の後に、ライゲーションされた前記アンプリコンの配列を分析することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ステップe)において、前記配列の分析がナノポアシーケンシングによって行われる、請求項5に記載の方法。
- フェムトモル(fmol)またはアトモル(amol)レベルで低分子RNAを検出することが可能である、請求項1に記載の方法。
- 低分子RNAを検出するためのセンサーDNAであって、
a)標的低分子RNAの相補的配列を含む低分子RNA感知領域と;
b)感知された前記標的低分子RNAをプライマーとして使用した重合を行い得るようなテンプレートであるモジュール領域と;
c)3’末端の修飾アミン領域と;
を含み、
前記標的低分子RNAの種類に応じた固有のバーコード領域を含む、センサーDNA。 - フェムトモル(fmol)またはアトモル(amol)レベルで低分子RNAを検出することが可能である、請求項8に記載のセンサーDNA。
- 前記センサーがナノポアシステムによってシーケンシングされる、請求項8に記載のセンサーDNA。
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