JP2021184708A

JP2021184708A - 低分子ｒｎａを検出する方法

Info

Publication number: JP2021184708A
Application number: JP2021077424A
Authority: JP
Inventors: クンチョ，ソク; Seok Keun Cho
Original assignee: Xenohelix Co Ltd
Current assignee: Xenohelix Co Ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2021-12-09
Anticipated expiration: 2041-04-30
Also published as: US20210198725A1; EP3845666A1; JP7242081B2

Abstract

【課題】感染症および癌などの様々な疾患の診断に利用される、低分子ＲＮＡの定量的な検出方法を提供する。【解決手段】低分子ＲＮＡを検出する方法であって、ａ）検出される標的低分子ＲＮＡの相補的配列を含むセンサーＤＮＡを前記標的低分子ＲＮＡとハイブリダイズすること；ｂ）テンプレートとしての前記センサーＤＮＡのモジュール領域およびプライマーとしての前記標的低分子ＲＮＡを使用して、ポリメラーゼによって重合を実行すること；ｃ）前記センサーＤＮＡの前記モジュール領域および、ステップｂ）で重合した鎖に対応するプライマーを使用してアンプリコンを増幅および生成すること；ならびに、ｄ）前記アンプリコンの配列を分析すること、を含む、方法である。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月８日に出願された韓国特許出願第２０２０−００５５４２９号の優先権および利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

技術分野
本発明は、低分子ＲＮＡの分析方法および検出方法に関する。特に、本発明は、短い塩基配列を有するＲＮＡでも分析でき、当該ＲＮＡを高感度かつ高精度で定量的に検出できるため、感染症および癌などの様々な疾患の診断に幅広く利用できる。

背景技術
生活の質が向上するにつれて、疾患の早期診断への関心が高まり、分子診断技術が疾患の原因となる病原体の遺伝情報を直接検出するため、分子診断技術は、既存の抗体／抗原反応に基づいて疾患の間接的な要因を検出する免疫学的診断技術の欠点を解決し得る技術として注目されている。

さらに、近年、コロナウイルス感染症−１９（ＣＯＶＩＤ−１９）が大幅に拡大しているため、その発生により世界中で多くの死者が出ており、世界保健機関（ＷＨＯ）でさえもこの発生をパンデミックと宣言している。このようなＲＮＡウイルスが原因の疾患の場合、突然変異の発生率が高いと被害が大きくなり、患者が感染しているかどうかの早期診断がさらに必要となる。

一方、ｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡは、ｉｎｖｉｖｏに存在するタンパク質非コードＲＮＡであり、特定の遺伝子の転写後プロセスに作用して、対応する遺伝子の発現を調節し得る。特に、低分子ＲＮＡは、細胞周期、分化、発達、代謝、発癌、老化などの生物学的機能を調節して生物の恒常性を媒介する、重要な遺伝的要素として認識されており、特に、その異常なネットワークの形成は、細胞生理学の観点から致命的な欠陥を示し得る。

さらに、血液中のｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡの発現パターンは、前記低分子ＲＮＡが癌の初期段階で敏感に反応するため、癌の早期かつ予測的検出において強力な利点を示す。また、簡単な採血で様々な癌を検査し得るため、患者の体への負担を軽減し得る。さらに、前述の感染症および癌に加えて、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの様々な難病の診断において、低分子ＲＮＡを高感度で迅速に検出することで、前記疾患を早期に診断できる技術を開発する必要性が高まっている。

実施形態の概要
技術的課題
本発明によって解決されるべき技術的課題は、低分子ＲＮＡを検出する方法を提供することである。

また、本発明によって解決されるべき技術的課題は、低分子ＲＮＡを検出するためのセンサーＤＮＡを提供することである。

技術的解決策
本発明の一態様は、低分子ＲＮＡを検出する方法であって、ａ）検出される標的低分子ＲＮＡの相補的配列を含むセンサーＤＮＡを前記標的低分子ＲＮＡとハイブリダイズすること；ｂ）テンプレートとしての前記センサーＤＮＡのモジュール領域およびプライマーとしての前記標的低分子ＲＮＡを使用して、ポリメラーゼによって重合を実行すること；ｃ）前記センサーＤＮＡの前記モジュール領域および、ステップｂ）で重合した鎖に対応するプライマーを使用してアンプリコンを増幅および生成すること；ならびに、ｄ）前記アンプリコンの配列を分析すること、を含む、方法である。

一実施形態では、前記センサーＤＮＡは、その３’末端に修飾アミン領域を有し得る。そのような修飾は、ステップｂ）においてポリメラーゼによる重合の過程でセンサーＤＮＡの重合が起こるのを防ぎ得る。したがって、センサーＤＮＡの重合を防止し得る限り、修飾された形態を適用し得て、形態は限定されない。

一実施形態では、ステップｃ）における前記プライマーが、５’末端に結合したリン酸を有し得る。ステップｃ）のプライマーは、増幅反応によってアンプリコンを生成するために使用され、プライマーの塩基配列は、５’末端に結合したリン酸を介して増幅される鎖に塩基配列が結合し得る限り、制限なく適用され得る。

すなわち、検出される標的低分子ＲＮＡまたはセンサーＤＮＡのモジュール領域に応じて、塩基配列を変化し得る。

一実施形態では、前記方法は、複数の前記アンプリコンがステップｃ）で生成される場合、ｄ）生成された前記アンプリコンをライゲーションすること、をさらに含み得る。

ライゲーションにより、短い塩基配列を分析できない関連技術のオックスフォードナノポアシーケンシングシステム（オックスフォードナノ）であっても、低分子ＲＮＡの塩基配列を分析し得る。

一実施形態では、アンプリコンのライゲーションの後、方法はさらに、ｄＡＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを加えることにより３’末端にアデニン（Ａ）を付加すること、を含み得て、ＤＮＡポリメラーゼとしてのＴａｑポリメラーゼを使用し得るが、本発明に限定されない。

一実施形態では、ステップｄ）はさらに、アンプリコンのライゲーションの後に、シーケンシングのためのアダプターをライゲーションされたアンプリコンの両端に結合すること、を含み得る。アダプターは、シーケンシング装置によって認識され得て、オックスフォードナノポアシーケンシング装置および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）装置など、適用するシーケンシング装置に応じてアダプターを変更することで結合させ得る。

一実施形態では、前記方法は、ステップｄ）の後に、ライゲーションされた前記アンプリコンの配列を分析することをさらに含み得る。ステップｅ）において、前記シーケンシングは、ナノポアシーケンシングであり得る。

ナノポアシーケンシングは、典型的な「ナノポアシーケンシング」を意味し得る。「ナノポアシーケンシング」とは、ＤＮＡ鎖を生物学的細孔に通しながら電気伝導率の差を測定することにより、様々な塩基を識別する技術を指す。ナノポアシーケンシングは、配列を細孔に通しながら塩基配列を分析するため、ナノポアシーケンシングは、短い塩基配列を分析できないという点において、低分子ＲＮＡの検出および分析に適用できないという欠点を有する。

本発明は、アンプリコンをライゲーションすることによって低分子ＲＮＡを検出および分析することを可能にし、ナノポアシーケンシングであっても、分析することができるレベルの長さを提供する。さらに、本発明は、シーケンシング技術に限定されることなく適用され得る。

一実施形態では、前記センサーＤＮＡは、固有のバーコード領域を含み得る。バーコード領域は、標的低分子ＲＮＡの種類に応じて固有であり、バーコード領域の存在および検出されるバーコードの数を確認することにより、標的低分子ＲＮＡの存在および数に対応し得る。

一実施形態では、前記センサーＤＮＡのバーコード領域を含むことによって前記アンプリコンが増幅され得る。標的低分子ＲＮＡの種類とは異なる固有のバーコード領域がセンサーＤＮＡに存在する場合、そのアンプリコンが増幅されて生成されるプロセス中に生成される各アンプリコンは、すべてのセンサーＤＮＡに含まれる固有のバーコード領域が含まれるアンプリコンであり得る。

一実施形態では、前記「検出」により、アンプリコンの数を測定することによって、標的低分子ＲＮＡの数の定量的な検出が可能である。

一実施形態では、前記アンプリコンに含まれるバーコードの数を測定することによって前記アンプリコンの数を確認し得る。

本発明の例示的な実施形態では、複数の標的低分子ＲＮＡ用の複数のセンサーを混合した場合でも、定量的な数の標的低分子ＲＮＡを高精度かつ高感度で検出し得ることが確認され（図６）、さらに、血液から抽出したＲＮＡサンプルでさえも確認できる標的低分子ＲＮＡ用のセンサーＤＮＡを導入することにより、定量的な数の標的低分子ＲＮＡを高精度かつ高感度に検出し得ることが確認された（図７）。

特に、本発明の低分子ＲＮＡを検出する方法および検出に使用されるセンサーＤＮＡの構成は、フェムトモル（ｆｍｏｌ）およびアトモル（ａｍｏｌ）レベルにおいて、検出限界が非常に低く、したがって、感度および精度の両方が、従来の低分子ＲＮＡ検出技術のものと比較して著しく優れていることを示している。

本発明の別の態様は、低分子ＲＮＡを検出するためのセンサーＤＮＡであって、ａ）標的低分子ＲＮＡの相補的配列を含む低分子ＲＮＡ感知領域と；ｂ）感知された前記標的低分子ＲＮＡをプライマーとして使用した重合を行い得るようなテンプレートであるモジュール領域と；ｃ）３’末端の修飾アミン領域と；を含む、センサーＤＮＡである。

一実施形態では、前記モジュール領域が固有のバーコード領域を含み得る。「バーコード領域」は上記の通りである。

一実施形態では、前記センサーは、ナノポアセンサーであり得る。「ナノポアセンサー」はナノポアベースのセンサーであり、ナノポアシーケンシングを適用し得ることを意味する。

発明の有利な効果
本発明の低分子ＲＮＡを検出する方法および検出に使用されるセンサーＤＮＡの構成は、フェムトモル（ｆｍｏｌ）およびアトモル（ａｍｏｌ）レベルにおいて検出限界が非常に低く、感度および精度の両方が従来の低分子ＲＮＡ検出技術に比べて著しく優れている。

したがって、本発明は、人間などの個人に疾患が発生しているかどうか、疾患がどの段階に進行したか、および潜在段階で個人がウイルスに感染しているかどうか、の診断など、既存の技術の検出限界を克服するための細かいレベルでの分子診断を可能にすることにより、疾患の非常に初期の段階および潜在的な段階での診断にも有効に利用され得る。

本発明の効果は、前述の効果に限定されず、詳細な説明または本発明の特許請求の範囲に記載された本発明の構成から推定されるすべての可能な効果を含むことを理解されたい。

図面の簡単な説明
図１は、本発明の例示的な実施形態による、低分子ＲＮＡを検出する方法の概略図を示す。センサーＤＮＡが標的低分子ＲＮＡを感知して結合した後、低分子ＲＮＡを検出するためのシーケンシングが実行される。図２は、本発明の例示的な実施形態によるセンサーＤＮＡの構造図を示している。図３は、例示的な検出標的であるｍｉＲ２１０が、本発明のセンサーを使用して正確に検出されることを確認した結果を示している。血液サンプル中の本発明のセンサーＤＮＡを使用して低分子ＲＮＡ検出技術の感度を確認した結果を示す。図５は、１つの種類の標的低分子ＲＮＡに対して複数のセンサーが混合された場合の定量的検出能力を確認した結果を示している。図６は、複数の低分子ＲＮＡに対して複数のセンサーが混合された場合の定量的検出能力を確認した結果を示している。図７は、血液から抽出されたＲＮＡサンプル中の標的低分子ＲＮＡの定量的検出能力を確認した結果を示している。

例示的な実施の詳細な説明
以下、本発明について、実施例を通じて詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。

例１．センサーＤＮＡを使用した重合、増幅、およびシーケンシング
標的としての低分子ＲＮＡおよびセンサーＤＮＡを添加した後、ＤＮＡポリメラーゼ（ＸｅｎｏＴ−ＰＯＬ）を使用して、９５℃で３０秒間、６３℃で１０分間の重合反応を行った。その後、センサーおよびＲＮＡをエンドヌクレアーゼを使用して消化した。センサーＤＮＡは、標的低分子ＲＮＡに相補的な配列を含む感知領域を含み、感知領域は、標的低分子ＲＮＡを感知し、標的低分子ＲＮＡとハイブリダイズし、本発明では「センサーＤＮＡ」と名付けられる。センサーＤＮＡはバーコード領域を含み得て、標的の低分子ＲＮＡの数は、バーコード領域のみを数えることによって定量的に測定され得る。

その後、アンプリコンは、センサーＤＮＡのモジュール領域および重合鎖の増幅のために５’末端に結合したリン酸を有するプライマーを使用するＰＣＲによって生成された。ＰＣＲは、通常のＰＣＲと同様の方法で実施され得て、ＰＣＲの温度条件、サイクル数などは、重合鎖および重合鎖に結合したプライマーの配列に応じて適切に改変および適用し得る。

その後、生成されたアンプリコンをＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションした後、ライゲーションされたアンプリコンをシーケンシングに供した。

センサーＤＮＡはナノポアベースのセンサーであり、ナノポアを使用したシーケンシング（ナノポアシーケンシング、ナノポアシーケンシング）をシーケンシング（シーケンシング）に適用し得る。具体的には、ナノポアアダプターがライゲーションされたアンプリコンに結合された後、ナノポアシーケンシングが実行され得て、ナノポアシーケンシングは、既知の製品を使用する既知の製品のマニュアルに従って実行され得る。例えば、サンプルがナノポアシーケンシング装置であるミニオンチップにロードされた後、シーケンシングを実行し得る。

本発明の検出方法の精度および感度は、以下の実施例により確認され、実験は、ｍｉＲＮＡ２１、ｍｉＲＮＡ２１０、およびｍｉＲＮＡ４８６を標的として使用して例示的に実施された。標的ｍｉＲＮＡの配列は、次の表１に要約されている。

例示的な標的ｍｉＲＮＡを検出するためのセンサーＤＮＡの感知領域の配列は、以下の表２に要約される。本感知領域の配列は、必要に応じて変更され得て、本例に限定されない。

例示的な標的ｍｉＲＮＡを検出するためのセンサーＤＮＡのモジュール領域の配列は、以下の表３に要約されている。モジュール領域に含まれるバーコード領域の配列には下線が引かれている。本モジュール領域の配列は、必要に応じて変更され得て、本例に限定されない。

例示的な標的ｍｉＲＮＡを検出するためのセンサーＤＮＡのバーコード領域の配列は、以下の表４に要約される。本バーコード領域の配列は、必要に応じて変更され得て、そして本例に限定されない。

モジュール領域はバーコード領域を含み、上記のように感知領域に結合されているため、前記モジュール領域は、感知領域および／またはバーコード領域によって分類され得る。

さらに、例示的に、センサーＤＮＡのモジュール領域および重合された鎖の増幅に使用される５’末端に結合したリン酸を有するプライマーの配列は以下の通りである。本プライマーは、リン酸が５’末端に結合していることのみを特徴とし、プライマーの配列は、必要に応じて変更され得て、本例に限定されない。

実施例１．本発明のセンサーＤＮＡを用いた低分子ＲＮＡ検出技術の精度の確認（センサーＤＮＡを混合した場合）
標的低分子ＲＮＡとして２０ｆｍｏｌのｍｉＲ２１０およびセンサー２１（ｍｉＲＮＡ２１センシング領域を含むセンサーＤＮＡ）およびセンサー２１０（ｍｉＲ２１０センシング領域を含むセンサーＤＮＡ）をそれぞれ２０ｆｍｏｌ混合した後、実施例１の方法を用いて様々な種類のセンサーＤＮＡを混合した状態でさえも、標的ｍｉＲＮＡが正確に検出されたかどうかを確認した。

最初に、センサー２１およびセンサー２１０をそれぞれ２０ｆｍｏｌの濃度で実験条件下で適切に混合した後、２μｌの反応バッファー（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＳＯ_４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（２５℃、ｐＨ８．８））、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ、および２ユニットのＸｅｎｏＴ−ＰＯＬを添加し、得られた混合物を９５℃で３０秒間加熱し、次に６３℃で１０分間インキュベートした。ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ^ＴＭＰｌｕｓＴｏｔａｌＦｒａｇｍｅｎｔＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して反応サンプルをクリーンアップし、６０μｌの蒸留水で溶出した。２０μｌのサンプルをヌクレアーゼ混合物（（４０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５℃、ｐＨ４．５）、３００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＺｎＳＯ_４および２００ユニットのＳ１ヌクレアーゼ）と混合し、得られた混合物を３７℃で１１分間インキュベートした。その後、ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ^ＴＭＰｌｕｓＴｏｔａｌＦｒａｇｍｅｎｔＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して混合物をクリーンアップし、６０μｌの蒸留水で溶出した。ＰＣＲは、５’末端にリン酸が結合したプライマーを用いて、９８℃で２分間の１サイクル、ならびに９８℃で１０秒間および６４．５℃で１０秒間の３０サイクルの条件下で行った。ＰＣＲ産物を１５％ポリアクリルアミドゲル（１９：１）で電気泳動した後、ＧｅｌＤｏｃを使用して結果を確認した。

その結果、図３に示すように、標的低分子ＲＮＡに対応しないセンサーＤＮＡを混合した場合でも、標的低分子ＲＮＡであるｍｉＲＮＡ２１０をセンサー２１０で正確に感知・検出し得ることを確認した。また、センサー２１との非特異的反応が現れないことを確認した。

これらの結果は、本発明のセンサーＤＮＡを用いた低分子ＲＮＡ検出技術が、様々なタイプのセンサーが混合された場合でも精度を維持し得ることを示している。

実施例２．血液サンプルにおける本発明のセンサーＤＮＡを用いた低分子ＲＮＡ検出技術の感度の確認
ｍｉＲＮｅａｓｙＳｅｒｕｍ／ＰｌａｓｍａＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、ヒト血液サンプルからＲＮＡを精製および抽出した。実施例１の方法を用いて、標的ｍｉＲＮＡが正確に検出されたかどうかを確認した。

具体的には、血液から精製した８００ｎｇのＲＮＡを、センサー２１、センサー２１０およびセンサー４８６（ｍｉＲＮＡ４８６センシング領域を含むセンサーＤＮＡ）のそれぞれ２００ａｍｏｌと混合した後、２μｌの反応バッファー（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＳＯ_４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（２５℃、ｐＨ８．８））、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ、および２ユニットのＸｅｎｏＴ−ＰＯＬを添加し、次に、得られた混合物を９５℃で３０秒間加熱し、次に６３℃で１０分間インキュベートした。ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ^ＴＭＰｌｕｓＴｏｔａｌＦｒａｇｍｅｎｔＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して反応サンプルをクリーンアップし、６０μｌの蒸留水で溶出した。２０μｌのサンプルをヌクレアーゼ混合物（４０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５℃、ｐＨ４．５、３００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＺｎＳＯ_４、および２００ユニットのＳ１ヌクレアーゼ）に添加し、得られた混合物を３７℃で１１分間インキュベートした。その後、ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ^ＴＭＰｌｕｓＴｏｔａｌＦｒａｇｍｅｎｔＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して混合物をクリーンアップし、６０μｌの蒸留水で溶出した。ＰＣＲは、５’末端にリン酸が結合したプライマーを用いて、９８℃で２分間の１サイクル、ならびに９８℃で１０秒間および６４．５℃で１０秒間の３０サイクルの条件下で行った。ＰＣＲ産物を１５％ポリアクリルアミドゲル（１９：１）で電気泳動した後、ＧｅｌＤｏｃを使用して結果を確認した。

その結果、図４に示すように、センサーの濃度が２００ａｍｏｌと非常に低くとも、存在する場合に低分子ＲＮＡを感知し得ることが確認され、検出限界が非常に低く、高感度を示し得ることが確認された。

実施例３．本発明のセンサーＤＮＡを用いた低分子ＲＮＡ検出技術の定量的検出活性の確認
３−１．１種類の標的低分子ＲＮＡに複数のセンサーを混合した場合の定量的検出能力の確認
標的低分子ＲＮＡとして２０ｆｍｏｌのｍｉＲＮＡ２１とセンサー２１およびセンサー２１０のそれぞれ２０ｆｍｏｌを混合した後、実施例１の方法を用いて、様々な種類のセンサーＤＮＡを混合した状態でも標的ｍｉＲＮＡの検出が定量的に確認できるかどうかを検証した。センサー２１、センサー２１０、およびｍｉＲＮＡ２１のそれぞれ２０ｆモルを実験条件下で適切に混合した後、２μｌの反応緩衝液（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＳＯ_４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および（２５℃、ｐＨ８．８））、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ、および２ユニットのＸｅｎｏＴ−ＰＯＬを添加し、得られた混合物を３０秒間９５℃で加熱した後、６３℃で１０分間インキュベートした。ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ^ＴＭＰｌｕｓＴｏｔａｌＦｒａｇｍｅｎｔＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して反応サンプルをクリーンアップし、６０μｌの蒸留水で溶出した。２０μｌのサンプルをヌクレアーゼ混合物（４０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５℃、ｐＨ４．５、３００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＺｎＳＯ_４、および２００ユニットのＳ１ヌクレアーゼ）に添加し、得られた混合物を３７℃で１１分間インキュベートした。その後、ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ^ＴＭＰｌｕｓＴｏｔａｌＦｒａｇｍｅｎｔＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して混合物をクリーンアップし、６０μｌの蒸留水で溶出した。５’末端にリン酸が結合したプライマーを用いて、９８℃で２分間の１サイクル、ならびに９８℃で１０秒間および６４．５℃で１０秒間の３０サイクルの条件でＰＣＲを行い、そしてアンプリコンをクリーンアップした。その後、５００ユニットのＴ３ＤＮＡリガーゼを、６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭＤＴＴ、および７．５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）（２５℃、ｐＨ７．６）の条件下で、５００ｎｇのアンプリコンへと添加した後、得られた混合物を２５℃で１０分間インキュベートした。その後、混合物をクリーンアップした後、４０μｌの溶出ＤＮＡ、１μｌの１ｍＭｄＡＴＰ、１μｌ（５ユニット）のｔａｑＤＮＡポリメラーゼ、５μｌの反応バッファー（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８．８）、５００ｍＭＫＣｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび蒸留水を混合することにより、５０μｌの混合物を生成し、７２℃で２０分間インキュベートした。ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ^ＴＭＰｌｕｓＴｏｔａｌＦｒａｇｍｅｎｔＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して、ｄＡＴＰテールＤＮＡ産物をクリーンアップした。その後、ナノポアシーケンシングのためのアダプターライゲーション（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０９）、ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズを使用したクリーンアップ、フローセルのプライミング、およびフローセルのロードのプロセスを、ナノポアシーケンシングプロトコルに従って実行した。その後、得られたナノポアシーケンシングファイル内のセンサー２１およびセンサー２１０のバーコード領域シーケンスをカウントすることにより、検出結果を確認した。

その結果、図５に示すように、センサーＤＮＡのバーコード領域をカウントした結果、６６６，８６０のｍｉＲＮＡ２１が測定され、２，２９３のｍｉＲＮＡ２１０がバックグラウンドとして現れることが確認された。

前述の結果は、本発明の技術が、非常に低濃度のフェムトモル（ｆｍｏｌ）においても、高感度かつ高精度で標的低分子ＲＮＡの数を測定し、標的低分子ＲＮＡを定量的に検出できることを示している。

３−２．複数の標的低分子ＲＮＡの複数のセンサーを混合した場合の定量的検出能力の確認
標的ＲＮＡとしてのｍｉＲＮＡ２１およびｍｉＲＮＡ２１０は、それぞれ７ｆｍｏｌおよび２０ｆｍｏｌの異なる濃度で混合され、Ｓｅｎｓｏｒ２１およびＳｅｎｓｏｒ２１０はそれぞれ２０ｆｍｏｌ混合された。その後、実施例１の方法を用いて、様々な種類のセンサーＤＮＡを複数の標的低分子ＲＮＡと混合した状態でも、標的ｍｉＲＮＡの検出が定量的に確認し得るかどうかを検証した。

センサー２１およびセンサー２１０のそれぞれ２０ｆｍｏｌを７ｆｍｏｌのｍｉＲＮＡ２１および２０ｆｍｏｌのｍｉＲＮＡ２１０と混合した。続くナノポアシーケンシングのプロセスは３−１で説明したものと同様である。その後、得られたナノポアシーケンシングファイル内のセンサー２１およびセンサー２１０のバーコード領域シーケンスをカウントすることにより、検出結果を確認した。

その結果、図６に示すように、７ｆｍｏｌの相対的に低濃度で混合されたｍｉＲＮＡ２１の場合、７６，８９１のｍｉＲＮＡ２１が測定され、２０ｆｍｏｌの濃度で混合されたｍｉＲＮＡ２１０の場合、１７９，２６１のｍｉＲＮＡ２１０が測定された。

前述の結果は、低分子ＲＮＡが異なる濃度で存在する場合でも、本発明の技術は、単にその存在または不在のみを検出するのではなく、サンプルに含まれる濃度または含有量を反映することによって定量的検出を可能にすることを示す。

３−３．血液から抽出したＲＮＡサンプル中の標的低分子ＲＮＡの定量的検出能力の確認
ｍｉＲＮｅａｓｙＳｅｒｕｍ／ＰｌａｓｍａＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、ヒト血液サンプルからＲＮＡを精製および抽出した。

血液から精製した８００ｎｇのＲＮＡを、センサー２１、センサー２１０およびセンサー４８６のそれぞれ２００ａｍｏｌと混合し、その後、実施例１の方法を用いて標的ｍｉＲＮＡの検出を定量的に確認し得るかどうかを検証した。続くナノポアシーケンシングのプロセスは、３−１で説明したものと同様である。その後、得られたナノポアシーケンシングファイル内のセンサー２１、センサー２１０およびセンサー４８６のバーコード領域シーケンスをカウントすることにより、検出結果を確認した。

その結果、図７に示すように、血液中に存在する各種類のｍｉＲＮＡの濃度に応じて、５，２７９のｍｉＲＮＡ２１、６８２のｍｉＲ２１０、および３４２，５３８のｍｉＲＮＡ４８６が測定された。

前述の結果は、本発明の技術が、正常段階、疾患が発症する段階、潜伏段階、発症段階などを、分子レベルで、以下のような低分子ＲＮＡの存在として迅速に診断し得ることを示している。ウイルスや細菌などによる感染症、癌などの指標は、単純な検出ではなく、定量的なレベルで測定される。

特に、本発明の低分子ＲＮＡを検出する方法および検出に使用されるセンサーＤＮＡの構成は、フェムトモル（ｆｍｏｌ）およびアトモル（ａｍｏｌ）レベルで非常に低い検出限界を有し、したがって、感度および精度の両方が従来の低分子ＲＮＡ検出技術に比べて著しく優れている。

以上のように、本発明は、人間などの個体においての疾患の発生の有無、疾患がどの段階に進行するか、およびその個体が潜伏段階でウイルスに感染しているかどうか、の診断など、既存技術の検出限界を克服するための微細な分子診断を可能にすることにより、疾患のごく初期および潜伏期の診断にも適用され得る。

本発明の上記の説明は、例示の目的で提供され、本発明が関係する当業者は、本発明の技術的思想または本質的特徴を変更することなく、本発明を他の特定の形態に容易に変更し得ることを理解するであろう。

したがって、上記の実施形態は、すべての態様において例示的なものにすぎず、限定的ではないことを理解されたい。例えば、単数形として記述されている各構成要素は、分散形式で実装され得て、同様に、分散されているとして記述されている構成要素は、組み合わされた形で実装され得る。

本発明の範囲は、以下に説明する特許請求の範囲によって表され、請求項の意味および範囲、ならびにそれらの同等の概念から派生したすべての変更または修正された形式は、本発明の範囲内にあると解釈されるべきである。

Claims

低分子ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）検出される標的低分子ＲＮＡの相補的配列を含むセンサーＤＮＡを前記標的低分子ＲＮＡとハイブリダイズすること；
ｂ）テンプレートとしての前記センサーＤＮＡのモジュール領域およびプライマーとしての前記標的低分子ＲＮＡを使用して、ポリメラーゼによって重合を実行すること；
ｃ）前記センサーＤＮＡの前記モジュール領域および、ステップｂ）で重合した鎖に対応するプライマーを使用してアンプリコンを増幅および生成すること；ならびに、
ｄ）前記アンプリコンの配列を分析すること、
を含む、方法。
前記センサーＤＮＡが３’末端に修飾アミン領域を有する、請求項１に記載の方法。
ステップｃ）における前記プライマーが、５’末端に結合したリン酸を有する、請求項１に記載の方法。
複数の前記アンプリコンがステップｃ）で生成される場合、
ｄ）生成された前記アンプリコンをライゲーションすること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
ステップｄ）が、アンプリコンのライゲーションの後に、シーケンシングのためのアダプターをライゲーションされたアンプリコンの両端に連結することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
ｅ）ステップｄ）の後に、ライゲーションされた前記アンプリコンの配列を分析することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
ステップｅ）において、前記シーケンシングがナノポアシーケンシングである、請求項６に記載の方法。
前記センサーＤＮＡが固有のバーコード領域を含む、請求項１に記載の方法。
前記センサーＤＮＡのバーコード領域を含むことによって前記アンプリコンが増幅される、請求項１に記載の方法。
前記検出により、アンプリコンの数を測定することによって、標的低分子ＲＮＡの数の定量的な検出が可能である、請求項９に記載の方法。
前記アンプリコンに含まれるバーコードの数を測定することによって前記アンプリコンの数を確認する、請求項１０に記載の方法。
低分子ＲＮＡを検出するためのセンサーＤＮＡであって、
ａ）標的低分子ＲＮＡの相補的配列を含む低分子ＲＮＡ感知領域と；
ｂ）感知された前記標的低分子ＲＮＡをプライマーとして使用した重合を行い得るようなテンプレートであるモジュール領域と；
ｃ）３’末端の修飾アミン領域と；
を含む、センサーＤＮＡ。
前記モジュール領域が固有のバーコード領域を含む、請求項１２に記載のセンサーＤＮＡ。
前記センサーがナノポアシステムによってシーケンシングされる、請求項１２に記載のセンサーＤＮＡ。