JP2017502661A - カバーされた配列変換dnaおよび検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
資金提供
本明細書で開示される研究の少なくとも一部は、日本政府機関である国立研究開発法人科学技術振興機構(JST)の補助金による支援を受けた。
一態様において、本開示は、試料中の標的核酸を検出する方法に関するものであって、前記方法は、5’から3’方向に、第1の任意の配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、前記第1の任意の配列と相補的な配列、標的核酸の3’末端と相補的な配列および3’末端の修飾を含むヘアピンオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、ならびにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼと前記試料を接触させることを含む。本態様の実施形態において、本方法は、シグナルDNAの存在が試料中の標的核酸の存在を示す、シグナルDNAの有無を決定することも含む。
標的DNAの存在および非存在におけるシグナルDNAの存在を検出するための反応は、配列番号1(CSC DNA #1)で表されるカバーされた配列変換DNA #1を用いて実行された。第2の反応は、配列番号7(USC DNA #1)で表されるカバーされていない配列変換DNA #1を用いて実行された。
標的DNAの存在および非存在におけるシグナルDNAの存在を検出するための反応は、配列番号9(CSC DNA #2)で表されるカバーされた配列変換DNA #3を用いて実行された。標的核酸は、ヒトマイクロRNA hsa−miR−24(配列番号6)であった。
5’ TGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG 3’ (配列番号6)
を有するヒトマイクロRNA hsa−miR−24(配列番号6)に相当する。
標的DNAの存在および非存在におけるシグナルDNAの存在を検出するための反応は、配列番号11(CSC DNA #3)で表されるカバーされた配列変換DNA #3を用いて実行された。標的核酸は、ヒトマイクロRNA hsa−miR−24(配列番号6)であった。
標的DNAの存在および非存在におけるシグナルDNAの存在を検出するための反応は、配列番号13(CSC DNA #4)で表されるカバーされた配列変換DNA #4を用いて実行された。標的核酸は、ヒトマイクロRNA hsa−miR−24(配列番号6)であった。
標的DNAの存在および非存在におけるシグナルDNAの存在を検出するための反応は、配列番号17(CSC DNA #5)で表されるカバーされた配列変換DNA #5を用いて実行された。標的核酸は、ヒトマイクロRNA hsa−miR−24(配列番号6)であった。
標的DNAの存在および非存在におけるシグナルDNAの存在を検出するための反応は、配列番号19(CSC DNA #6)で表されるカバーされた配列変換DNA #6を用いて実行された。標的核酸は、ヒトマイクロRNA hsa−miR−24(配列番号6)であった。
クラミジア属は、非運動性、グラム陰性、真核細胞の偏性細胞内寄生体である。本発明による方法を使って、生体試料のクラミジア属に由来する標的核酸の有無を検査することができる。例えば、標的核酸と相補的な配列(D)が、クラミジア属に由来する核酸と相補的である配列(D)を含む、本明細書に記載のCSC DNAが使用可能である。
ナイセリア・ゴノロエエは、性感染症淋病の原因であるグラム陰性のコーヒー豆型の双球菌バクテリアの種である。本発明による方法を使って、生体試料のN.ゴノロエエに由来する標的核酸の有無を検査することができる。例えば、標的核酸と相補的な配列(D)が、N.ゴノロエエに由来する核酸と相補的である配列(D)を含む、本明細書に記載のCSC DNAが使用可能である。
C型肝炎(HCV)ウイルスは、9,500ヌクレオチドのゲノムを有する一本鎖RNAウイルスである。本発明による方法を使って、生体試料のHCVに由来する標的核酸の有無を検査することができる。例えば、標的核酸と相補的な配列(D)が、HCVに由来する核酸と相補的である配列(D)を含む、本明細書に記載のCSC DNAが使用可能である。
HBVは、約3,200塩基対の小型、環状、部分的に二本鎖のDNAウイルスであり、本発明による方法を使って、試料中の標的HBV核酸の有無を検出することができる。例えば、標的核酸と相補的な配列(D)が、HBVに由来する核酸と相補的である配列(D)を含む、本明細書に記載のCSC DNAが使用可能である。
ヒト免疫不全症ウイルス1型(HIV−1)は、後天性免疫不全症候群(AIDS)を引き起こすレトロウイルスである。本発明による方法を使って、試料中のHIV−1核酸の存在を検出することができる。例えば、標的核酸と相補的な配列(D)が、HIV−1に由来する核酸と相補的である配列(D)を含む、本明細書に記載のCSC DNAが使用可能である。
Claims (46)
- 試料中の標的核酸を検出する方法であって、
5’から3’方向に、第1の任意の配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、第1の任意の配列と相補的な配列、標的核酸の3’末端と相補的な配列および3’末端の修飾を含むヘアピンオリゴヌクレオチド、
ポリメラーゼ、ならびに
ニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼ
と試料を接触させることを含む方法。 - シグナルDNAの存在が試料中の標的核酸の存在を示す、シグナルDNAの有無を決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 実質的に定温で実行される、請求項1に記載の方法。
- 約20℃から約42℃の温度で実行される、請求項1、2または3に記載の方法。
- 約37℃の温度で実行される、請求項1、2または3に記載の方法。
- ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項1、2または3に記載の方法。
- ポリメラーゼが3’→5’エキソヌクレアーゼ欠損、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損または両方である、請求項1、2または3に記載の方法。
- ポリメラーゼが、E.コリ(E.coli)由来のDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼおよびバチルス・カルドテナックス(Bacillus caldotenax)由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼからなる群から選択されるDNAポリメラーゼを含む、請求項1、2または3に記載の方法。
- エンドヌクレアーゼが、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCIおよびNt.BsmAIからなる群から選択される酵素である、請求項1、2または3に記載の方法。
- 試料が、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織および細胞培養からなる群から選択される、請求項1、2または3に記載の方法。
- 標的がマイクロRNAである、請求項1、2または3に記載の方法。
- 標的が、hsa−miR−24、hsa−miR−107、hsa−miR−221、hsa−miR−21、hsa−miR−500およびhsa−miR−106aからなる群から選択されるマイクロRNAである、請求項1、2または3に記載の方法。
- 標的が感染性因子に由来する、請求項1、2または3に記載の方法。
- 標的DNAが、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、ナイセリア・ゴノロエエ(Neisseria gonorrhoeae)、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルスまたは呼吸器合胞体ウイルスからなる群から選択される感染性因子に由来する、請求項1、2または3に記載の方法。
- 標的核酸が配列番号6、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29または配列番号30の内のいずれかの配列を含む、請求項1、2または3に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが、5’末端における、エンドヌクレアーゼ認識部位における、または5’末端およびエンドヌクレアーゼ認識部位の両方における修飾をさらに含む、請求項1、2または3に記載の方法。
- ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドであって、5’から3’方向に、第1の任意の配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、第1の任意の配列と相補的な配列、標的核酸の3’末端と相補的な配列および3’末端の修飾を含み、第1の任意の配列の少なくとも一部、および第1の任意の配列と相補的な配列の少なくとも一部がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、オリゴヌクレオチド。
- 5’から3’方向に、第1の任意の配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、第1の任意の配列と相補的な配列、標的核酸の3’末端と相補的な配列および3’末端の修飾を含むオリゴヌクレオチドであって、第1の任意の配列、および第1の任意の配列と相補的な配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成し、エンドヌクレアーゼ認識部位がヘアピン構造のループに位置する、オリゴヌクレオチド。
- エンドヌクレアーゼ認識部位が、エンドヌクレアーゼによってニックを入れられる配列と相補的な配列を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 標的核酸の3’末端と相補的な配列がマイクロRNAと相補的である、請求項17、18または19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 標的核酸の3’末端と相補的な配列が、hsa−miR−24、hsa−miR−107、hsa−miR−221、hsa−miR−21、hsa−miR−500およびhsa−miR−106aからなる群から選択されるマイクロRNAと相補的である、請求項17、18または19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 標的核酸が感染性因子に由来する、請求項17、18または19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 標的核酸と相補的な配列が、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、クラミジア・トラコマチス、ナイセリア・ゴノロエエ、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルスまたは呼吸器合胞体ウイルスからなる群から選択される感染性因子に由来する核酸と相補的である、請求項17、18または19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 標的核酸と相補的な配列が、配列番号6、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29または配列番号30の内のいずれかの核酸配列と相補的である、請求項17、18または19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 5’末端における、エンドヌクレアーゼ認識部位における、または5’末端およびエンドヌクレアーゼ認識部位の両方における修飾をさらに含む、請求項17、18または19に記載のオリゴヌクレオチド。
- エンドヌクレアーゼ認識部位が、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCIおよびNt.BsmAI認識部位からなる群から選択される、請求項17、18または19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 試料中の標的核酸を検出する組成物であって、
ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドであって、5’から3’方向に、第1の任意の配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、第1の任意の配列と相補的な配列、標的核酸の3’末端と相補的な配列および3’末端の修飾を含み、第1の任意の配列の少なくとも一部、および第1の任意の配列と相補的な配列の少なくとも一部がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、オリゴヌクレオチド、
ポリメラーゼ、および
ニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼ
を含む組成物。 - ポリメラーゼが、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼである、請求項27に記載の組成物。
- ポリメラーゼが3’→5’エキソヌクレアーゼ欠損、5→3’エキソヌクレアーゼ欠損または両方である、請求項27に記載の組成物。
- ポリメラーゼが、E.コリ由来のDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、バチルス・ステアロサーモフィルス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼおよびバチルス・カルドテナックス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼからなる群から選択される、請求項27に記載の組成物。
- エンドヌクレアーゼが、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCIおよびNt.BsmAIからなる群から選択される酵素である、請求項27に記載の組成物。
- 標的核酸と相補的な配列がマイクロRNAと結合する、請求項27、28、29、30または31に記載の組成物。
- 標的核酸と相補的な配列が、hsa−miR−24、hsa−miR−107、hsa−miR−221、hsa−miR−21、hsa−miR−500およびhsa−miR−106aからなる群から選択されるマイクロRNAと結合する、請求項27、28、29、30または31に記載の組成物。
- 標的核酸と相補的な配列が、配列番号6、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29または配列番号30の内のいずれかの配列を含む標的核酸に結合する、請求項27、28、29、30または31に記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドが、5’末端における、エンドヌクレアーゼ認識部位における、または5’末端およびエンドヌクレアーゼ認識部位の両方における修飾をさらに含む、請求項27、28、29、30または31に記載の組成物。
- 試料中の標的核酸を検出するキットであって、
ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドであって、5’から3’方向に、第1の任意の配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、第1の任意の配列と相補的な配列、標的核酸の3’末端と相補的な配列および3’末端の修飾を含み、第1の任意の配列の少なくとも一部、および第1の任意の配列と相補的な配列の少なくとも一部がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、オリゴヌクレオチド、
ポリメラーゼ、および
ニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼ
を含むキット。 - ポリメラーゼが、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼである、請求項36に記載のキット。
- ポリメラーゼが3’→5’エキソヌクレアーゼ欠損、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損または両方である、請求項36に記載のキット。
- ポリメラーゼが、E.コリ由来のDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、バチルス・ステアロサーモフィルス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼおよびバチルス・カルドテナックス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼからなる群から選択される、請求項36に記載のキット。
- エンドヌクレアーゼが、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCIおよびNt.BsmAIからなる群から選択される酵素である、請求項36に記載のキット。
- 標的核酸と相補的な配列がマイクロRNAと結合する、請求項36、37、38、39または40に記載のキット。
- 標的核酸と相補的な配列が、hsa−miR−24、hsa−miR−107、hsa−miR−221、hsa−miR−21、hsa−miR−500およびhsa−miR−106aからなる群から選択されるマイクロRNAと結合する、請求項36、37、38、39または40に記載のキット。
- 標的核酸と相補的な配列が、配列番号6、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29または配列番号30の内のいずれかの配列を含む標的核酸に結合する、請求項36、37、38、39または40に記載のキット。
- オリゴヌクレオチドが、5’末端における、エンドヌクレアーゼ認識部位におけるまたは5’末端およびエンドヌクレアーゼ認識部位の両方における修飾をさらに含む、請求項36、37、38、39または40に記載のキット。
- 標的核酸が、標的核酸の3’末端と相補的な配列においてヘアピンオリゴヌクレオチドと結合し、鎖置換複製を開始することにより、二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位および二本鎖で第1の任意の配列を生成する、請求項1に記載の方法。
- エンドヌクレアーゼが二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位にニックを入れ、鎖置換複製が開始される、請求項45に記載の方法。
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