JP2002112775A - ヒトabcトランスポーターの測定方法、そのためのプローブ及びキット - Google Patents
ヒトabcトランスポーターの測定方法、そのためのプローブ及びキットInfo
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
定量する新しい測定技術及びそのためのプライマー対及
びプローブを提供。 【解決手段】ヒトABCトランスポーター分子種の遺伝子
の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを
含むプローブ、該プローブと特定プライマー対との組合
せを含む上記分子種の測定キット、及び該キットを用い
てポリメラーゼ連鎖反応を行い、用いたプローブの加水
分解の有無を測定する上記分子種の測定方法。
Description
ポーターの測定方法及びそのためのプローブ及びキット
に関する。
0年以上前に細菌で発見されて以来、細菌からヒトに至
る各種において、その分子種が年々発見され、増加して
きている。このABC蛋白質の多くは、ATPに依存する内因
的物質、異物などの化学物質及びそれらの代謝物を細胞
外に輸送する作用を有することが明らかにされ、別名
「ABCトランスポーター」とも呼ばれている。
伝子の発見数の増加に伴って、その統一的命名法とクラ
ス分けの必要性が高まり、ウエイン(Hester Mary Wai
n)らの提案に従って、ヒトABC蛋白質遺伝子命名委員会
が組織された。該委員会は、完全シークエンスが解明さ
れたABCトランスポーターを、シークエンスの類似性、
膜貫通領域(TM)とATP結合領域(ABC)の構成パターンに基
づいて、AからGの7つのサブファミリーに区分している
(下記表1及び表2参照)。
ABCトランスポーターについては、現在、これらが細胞
外に輸送し得る基質、それらの発現部位(局在性)、そ
れらの遺伝子変異と各種疾患との関連性などの生理的機
能がある程度解明されてきている(例えば、「生物の科
学」、50(4): 258-273, (1999)及び「薬物動態」, Xeno
bio. Metab. and Dispos., 15(1): 8-19 (2000)参
照)。
のABCトランスポーターの動き(発現量の増減)を把握
することは重要である。何故なら、ABCトランスポータ
ーの変動が判らないと、新薬と併用される併用薬剤の効
力や副作用の増減或いは併用薬剤、他の摂取物による新
薬の効力、副作用の増減などが予測できず、該新薬の安
全性を確認することができないからである。
かかるヒトABCトランスポーターに関する情報、殊にこ
れら各ABCトランスポーターを区別して測定できる測定
技術の開発が、要望されている。かかる技術が開発でき
れば、例えば、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時に
おける影響などが容易に把握でき、該新薬の副作用に関
する有用な情報を得ることができ、かくして新薬の安全
性を確保することができる。
(PCR)は、核酸の増幅法として広く知られており、例え
ばRT-PCR(Reverse Transcription-PCR)、コンペティ
ティブRT-PCRなどが微量のmRNAの検出、定量に威力を発
揮している。
出法が確立された(Taq Man PCR, Genome Res., 6(10),
986 (1996); ABI PRISMTM Sequence Detection Syste
m, Applied Biosystems社など)。これらは、特定の蛍
光標識プローブ(Taq Man prove)を用いて核酸を測定
する方法であり、その原理は次の通りである。即ち、例
えば5'末端にリポーター色素及び3'末端にクエンチャー
色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットDNA
にアニールさせた状態で、通常のPCR反応を行なわせる
と、伸長反応の進行に伴って、DNAポリメラーゼの有す
る5'-3'エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブ
が5'末端から加水分解される。その結果、5'末端のリポ
ーター色素が3'末端のクエンチャー色素から離れ、これ
により、当初一定の空間的距離を保っていたことによる
FRET(Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍
光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の
低下に基づく蛍光強度の低下現象)効果がなくなり、ク
エンチャー色素により制御されていたリポーター色素の
蛍光強度が増加する。該蛍光強度の増加を測定すれば、
ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出でき
るのである。
例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解
析するなどの複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同
時に多種のサンプルを定量できる利点がある。
を行う場合は、非常に多数の検体について限られた時間
内に検査をする必要があり、検査を効率良く行い得る手
法の開発が要望されており、上記リアルタイム検出法
は、この要望に合致するものとして期待できる。
検出法に着目し、そのヒトABCトランスポーターの検出
への応用を着想した。かかる応用によれば、同じ装置を
用いて同一のPCR条件で多数の検体を同時に検査でき、
しかもこれによって上記ABCトランスポーターサブクラ
スに属する分子種までも区別して測定、検出できると考
えた。
ンスポーターは、前述したとおり30種あまりにも及び、
それぞれのmRNAの配列は知られているものの、これらを
ターゲット遺伝子として、互いに重複する配列部分を有
さず、しかも同一PCR条件で充分に増幅し得、更に、該
ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし得る各
プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索自体、
困難であると考えられた。
領域に、同一PCR条件下にこれらのプライマーよりも早
くハイブリダイズし得、しかもヒトABCトランスポータ
ーに対して特異的なプローブの構築もまた、同様に困難
であると考えられた。
酸のハイブリダイズのし易さは、融点(Tm)の計算によ
りある程度推定することはできるものの、この推定によ
って選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ず
しもDNA測定において好結果をもたらすわけではないこ
とが知られており、現在知られている全てのヒトABCト
ランスポーターについて、これらを同時に区別して測定
可能な、上記PCRによるリアルタイム検出用の各プライ
マー対とプローブとの組合せの選択には、熟練者の試行
錯誤による多大な実験などが必要となると予想された。
ABCトランスポーターのPCRによる測定法、特にリアルタ
イム検出法の確立と、そのためのプローブ及びプライマ
ー対を提供することにある。
りヒトABCトランスポーターについて、更に、多大な実
験、研究を繰返し行った結果、33種類の各ABCトランス
ポーターに対する目的のプライマー対及びプローブの組
合せを提供するに成功し、ここに本発明を完成するに至
った。
定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(33)の各
領域のいずれかにハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドからなる群から選ばれるプローブ;特にリポーター色
素とクエンチャー色素とが結合している該プローブ;塩
基配列の長さが20-40の範囲にある該プローブ;配列番
号1〜配列番号47に示される配列のいずれかを含む該プ
ローブ;並びに配列番号1〜配列番号47に示される配列
のいずれかである該プローブを提供する。 (1)ABCA1遺伝子の1202-1224の領域又は2832-2855の領域 (2)ABCA2遺伝子の116-141の領域(GenBank)の登録番号
U18236での位置、開始コドンからの位置は未確認) (3)ABCA3遺伝子の3203-3230の領域 (4)ABCA4遺伝子の4133-4159の領域又は1689-1717の領域 (5)ABCA7遺伝子の153-178の領域又は1393-1418の領域 (6)ABCA8遺伝子の1163-1186の領域又は976-1001の領域 (7)ABCA1遺伝子の3453-3481の領域又は411-437の領域 (8)ABCA2遺伝子の330-355の領域又は653-680の領域 (9)ABCA3遺伝子の543-567の領域 (10)ABCA4遺伝子の3359-3386の領域又は2387-2416の領
域又は1476-1500の領域又は2197-2226の領域又は523-54
8の領域 (11)ABCB6遺伝子の1269-1296の領域 (12)ABCB7遺伝子の1610-1636の領域又は559-586の領域 (13)ABCB8遺伝子の511-540の領域 (14)ABCB9遺伝子の1152-1181の領域 (15)ABCB11遺伝子の1611-1639の領域又は999-1029の領
域 (16)ABCC1遺伝子の576-601の領域 (17)ABCC2遺伝子の1216-1243の領域 (18)ABCC3遺伝子の1788-1815の領域 (19)ABCC4遺伝子の525-554の領域 (20)ABCC5遺伝子の3180-3205の領域 (21)ABCC6遺伝子の303-334の領域 (22)ABCC7遺伝子の575-602の領域 (23)ABCC8遺伝子の1780-1805の領域 (24)ABCC9遺伝子の1835-1862の領域 (25)ABCD1遺伝子の1091-1115の領域 (26)ABCD2遺伝子の1884-1913の領域 (27)ABCD3遺伝子の1411-1436の領域 (28)ABCD4遺伝子の169-196の領域 (29)ABCE1遺伝子の1564-1590の領域又は290-315の領域 (30)ABCF1遺伝子の757-780の領域又は944-969の領域 (31)ABCF2遺伝子の43-72の領域 (32)ABCG1遺伝子の1505-1532の領域 (33)ABCG2遺伝子の425-448の領域。
示(記号による)は、ヒトABC蛋白質遺伝子命名委員会
の命名法に従うものとする。
かに示される各領域にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドからなるフォワードプライマー、プローブ及びリ
バースプライマーの組合せを含む、ヒトABCトランスポ
ーターの測定キット;特にプローブが更にリポーター色
素とクエンチャー色素とを結合させたものである上記測
定キットを提供する。 (1)フォワードプライマー;ABCA1遺伝子の1169-1190領
域、プローブ;同遺伝子の1202-1224領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1263-1241領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCA1遺伝子の2799-2819領域、プロー
ブ;同遺伝子の2832-2855領域及びリバースプライマ
ー;同遺伝子の2979-2959領域 (2)フォワードプライマー;ABCA2遺伝子の77-95領域、
プローブ;同遺伝子の116-141領域及びリバースプライ
マー;同遺伝子の238-218領域(ジーンバンク(GenBan
k)の登録番号U18236での位置) (3)フォワードプライマー;ABCA3遺伝子の3120-3140領
域、プローブ;同遺伝子の3203-3230領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の3279-3259領域 (4)フォワードプライマー;ABCA4遺伝子の4077-4099領
域及びリバースプライマー;同遺伝子の4201-4181領
域、プローブ;同遺伝子の4133-4159領域或いはプライ
マー対;ABCA4遺伝子の1652-1674領域、プローブ;同遺
伝子の1689-1717領域及びリバースプライマー;同遺伝
子の1850-1829領域 (5)フォワードプライマー;ABCA7遺伝子の38-59領域、
プローブ;同遺伝子の153-178領域及びリバースプライ
マー;同遺伝子の231-209領域或いはプライマー;ABCA7
遺伝子の1285-1303領域、プローブ;同遺伝子の1393-14
18領域及びリバースプライマー;同遺伝子の1442-1420
領域 (6)フォワードプライマー;ABCA8遺伝子の1085-1106領
域、プローブ;同遺伝子の1163-1186領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1252-1231領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCA8遺伝子の838-857領域、プローブ;
同遺伝子の976-1001領域及びリバースプライマー;同遺
伝子の1032-1012領域 (7)フォワードプライマー;ABCB1遺伝子の3389-3409領
域、プローブ;同遺伝子の3453-3481領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の3561-3542領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCB1遺伝子の323-344領域、プローブ;
同遺伝子の411-437領域及びリバースプライマー;同遺
伝子の506-486領域 (8)フォワードプライマー;ABCB2遺伝子の286-304領
域、プローブ;同遺伝子の330-355領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の431-412領域或いはフォワードプ
ライマー;ABCB2遺伝子の628-649領域、プローブ;同遺
伝子の653-680領域及びリバースプライマー;同遺伝子
の752-731領域 (9)フォワードプライマー;ABCB3遺伝子の518-539領
域、プローブ;同遺伝子の543-567領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の670-649領域 (10)フォワードプライマー;ABCB4遺伝子の3324-3340領
域、プローブ;同遺伝子の3359-3386領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の3520-3498領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCB4遺伝子の2357-2377領域、プロー
ブ;同遺伝子の2387-2416領域及びリバースプライマ
ー;同遺伝子の2453-2431領域或いはフォワードプライ
マー;ABCB4遺伝子の1412-1432領域、プローブ;同遺伝
子の1476-1500領域及びリバースプライマー;同遺伝子
の1546-1525領域或いはフォワードプライマー;ABCB4遺
伝子の2174-2192領域、プローブ;同遺伝子の2197-2226
領域及びリバースプライマー;同遺伝子の2325-2305領
域或いはフォワードプライマー;ABCB4遺伝子の375-395
領域、プローブ;同遺伝子の523-548領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の575-554領域 (11)フォワードプライマー;ABCB6遺伝子の1245-1266領
域、プローブ;同遺伝子の1269-1296領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1408-1386領域 (12)フォワードプライマー;ABCB7遺伝子の1558-1579領
域、プローブ;同遺伝子の1610-1636領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1757-1736領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCB7遺伝子の531-552領域、プローブ;
同遺伝子の559-586領域及びリバースプライマー;同遺
伝子の716-696領域 (13)フォワードプライマー;ABCB8遺伝子の429-449領
域、プローブ;同遺伝子の511-540領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の565-543領域 (14)フォワードプライマー;ABCB9遺伝子の1128-1149領
域、プローブ;同遺伝子の1152-1181領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1211-1190領域 (15)フォワードプライマー;ABCB11遺伝子の1581-1602
領域、プローブ;同遺伝子の1611-1639領域及びリバー
スプライマー;同遺伝子の1712-1691領域或いはフォワ
ードプライマー;ABCB11遺伝子の974-996領域、プロー
ブ;同遺伝子の999-1029領域及びリバースプライマー;
同遺伝子の1053-1033領域 (16)フォワードプライマー;ABCC1遺伝子の546-567領
域、プローブ;同遺伝子の576-601領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の682-662領域 (17)フォワードプライマー;ABCC2遺伝子の1176-1197領
域、プローブ;同遺伝子の1216-1243領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1306-1286領域 (18)フォワードプライマー;ABCC3遺伝子の1731-1753領
域、プローブ;同遺伝子の1788-1815領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1837-1817領域 (19)フォワードプライマー;ABCC4遺伝子の499-520領
域、プローブ;同遺伝子の525-554領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の587-565領域 (20)フォワードプライマー;ABCC5遺伝子の3134-3155領
域、プローブ;同遺伝子の3180-3205領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の3256-3236領域 (21)フォワードプライマー;ABCC6遺伝子の224-244領
域、プローブ;同遺伝子の303-334領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の419-397領域 (22)フォワードプライマー;ABCC7遺伝子の494-514領
域、プローブ;同遺伝子の575-602領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の647-627領域 (23)フォワードプライマー;ABCC8遺伝子の1750-1771領
域、プローブ;同遺伝子の1780-1805領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1837-1817領域 (24)フォワードプライマー;ABCC9遺伝子の1770-1790領
域、プローブ;同遺伝子の1835-1862領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1893-1872領域 (25)フォワードプライマー;ABCD1遺伝子の1057-1078領
域、プローブ;同遺伝子の1091-1115領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1159-1139領域 (26)フォワードプライマー;ABCD2遺伝子の1811-1833領
域、プローブ;同遺伝子の1884-1913領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1959-1938領域 (27)フォワードプライマー;ABCD3遺伝子の1354-1375領
域、プローブ;同遺伝子の1411-1436領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1460-1439領域 (28)フォワードプライマー;ABCD4遺伝子の146-167領
域、プローブ;同遺伝子の169-196領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の319-299領域 (29)フォワードプライマー;ABCE1遺伝子の1488-1508領
域、プローブ;同遺伝子の1564-1590領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1646-1625領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCE1遺伝子の248-269領域、プローブ;
同遺伝子の290-315領域及びリバースプライマー;同遺
伝子の416-394領域 (30)フォワードプライマー;ABCF1遺伝子の729-749領
域、プローブ;同遺伝子の757-780領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の862-841領域或いはフォワードプ
ライマー;ABCF1遺伝子の916-936領域、プローブ;同遺
伝子の944-969領域及びリバースプライマー;同遺伝子
の1008-986領域 (31)フォワードプライマー;ABCF2遺伝子の18-39領域、
プローブ;同遺伝子の43-72領域及びリバースプライマ
ー;同遺伝子の112-90領域 (32)フォワードプライマー;ABCG1遺伝子の1478-1499領
域、プローブ;同遺伝子の1505-1532領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1555-1534領域 (33)フォワードプライマー;ABCG2遺伝子の395-416領
域、プローブ;同遺伝子の425-448領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の563-542領域。
イマー、プローブ及びリバースプライマーの組合せの好
ましいものとしては、下記(1)〜(33)に記載の各配列番
号で示される配列を含むオリゴヌクレオチドの組合せ、
より好ましくは各配列番号で示される配列のオリゴヌク
レオチドの組合せを挙げることができる。 (1)フォワードプライマー;配列番号48、プローブ;配
列番号1及びリバースプライマー;49或いはフォワード
プライマー;配列番号50、プローブ;配列番号2及びリ
バースプライマー;51 (2)フォワードプライマー;配列番号52、プローブ;配
列番号3及びリバースプライマー;53 (3)フォワードプライマー;配列番号54、プローブ;配
列番号4及びリバースプライマー;55 (4)フォワードプライマー;配列番号56、プローブ;配
列番号5及びリバースプライマー;57或いはフォワード
プライマー;配列番号58、プローブ;配列番号6及びリ
バースプライマー;59 (5)フォワードプライマー;配列番号60、プローブ;配
列番号7及びリバースプライマー;61或いはフォワード
プライマー;配列番号62、プローブ;配列番号8及びリ
バースプライマー;63 (6)フォワードプライマー;配列番号64、プローブ;配
列番号9及びリバースプライマー;65或いはフォワード
プライマー;配列番号66、プローブ;配列番号10及びリ
バースプライマー;67 (7)フォワードプライマー;配列番号68、プローブ;配
列番号11及びリバースプライマー;69或いはフォワード
プライマー;配列番号70、プローブ;配列番号12及びリ
バースプライマー;71 (8)フォワードプライマー;配列番号72、プローブ;配
列番号13及びリバースプライマー;73或いはフォワード
プライマー;配列番号74、プローブ;配列番号14及びリ
バースプライマー;75 (9)フォワードプライマー;配列番号76、プローブ;配
列番号15及びリバースプライマー;77 (10)フォワードプライマー;配列番号78、プローブ;配
列番号16及びリバースプライマー;79或いはフォワード
プライマー;配列番号80、プローブ;配列番号17及びリ
バースプライマー;81或いはフォワードプライマー;配
列番号82、プローブ;配列番号18及びリバースプライマ
ー;83或いはフォワードプライマー;配列番号84、プロ
ーブ;配列番号19及びリバースプライマー;85或いはフ
ォワードプライマー;配列番号86、プローブ;配列番号
20及びリバースプライマー;87 (11)フォワードプライマー;配列番号88、プローブ;配
列番号21及びリバースプライマー;89 (12)フォワードプライマー;配列番号90、プローブ;配
列番号22及びリバースプライマー;91或いはフォワード
プライマー;配列番号92、プローブ;配列番号23及びリ
バースプライマー;93 (13)フォワードプライマー;配列番号94、プローブ;配
列番号24及びリバースプライマー;95 (14)フォワードプライマー;配列番号96、プローブ;配
列番号25及びリバースプライマー;97 (15)フォワードプライマー;配列番号98、プローブ;配
列番号26及びリバースプライマー;99或いはフォワード
プライマー;配列番号100、プローブ;配列番号27及び
リバースプライマー;101 (16)フォワードプライマー;配列番号102、プローブ;
配列番号28及びリバースプライマー;103 (17)フォワードプライマー;配列番号104、プローブ;
配列番号29及びリバースプライマー;105 (18)フォワードプライマー;配列番号106、プローブ;
配列番号30及びリバースプライマー;107 (19)フォワードプライマー;配列番号108、プローブ;
配列番号31及びリバースプライマー;109 (20)フォワードプライマー;配列番号110、プローブ;
配列番号32及びリバースプライマー;111 (21)フォワードプライマー;配列番号112、プローブ;
配列番号33及びリバースプライマー;113 (22)フォワードプライマー;配列番号114、プローブ;
配列番号34及びリバースプライマー;115 (23)フォワードプライマー;配列番号116、プローブ;
配列番号35及びリバースプライマー;117 (24)フォワードプライマー;配列番号118、プローブ;
配列番号36及びリバースプライマー;119 (25)フォワードプライマー;配列番号120、プローブ;
配列番号37及びリバースプライマー;121 (26)フォワードプライマー;配列番号122、プローブ;
配列番号38及びリバースプライマー;123 (27)フォワードプライマー;配列番号124、プローブ;
配列番号39及びリバースプライマー;125 (28)フォワードプライマー;配列番号126、プローブ;
配列番号40及びリバースプライマー;127 (29)フォワードプライマー;配列番号128、プローブ;
配列番号41及びリバースプライマー;129或いはフォワ
ードプライマー;配列番号130、プローブ;配列番号42
及びリバースプライマー;131 (30)フォワードプライマー;配列番号132、プローブ;
配列番号43及びリバースプライマー;133或いはフォワ
ードプライマー;配列番号134、プローブ;配列番号44
及びリバースプライマー;135 (31)フォワードプライマー;配列番号136、プローブ;
配列番号45及びリバースプライマー;137 (32)フォワードプライマー;配列番号138、プローブ;
配列番号46及びリバースプライマー;139 (33)フォワードプライマー;配列番号140、プローブ;
配列番号47及びリバースプライマー;141。
ンスポーターの測定用である。 (1)の組合せ;ABCA1測定用 (2)の組合せ;ABCA2測定用 (3)の組合せ;ABCA3測定用 (4)の組合せ;ABCA4測定用 (5)の組合せ;ABCA7測定用 (6)の組合せ;ABCA8測定用 (7)の組合せ;ABCB1測定用 (8)の組合せ;ABCB2測定用 (9)の組合せ;ABCB3測定用 (10)の組合せ;ABCB4測定用 (11)の組合せ;ABCB6測定用 (12)の組合せ;ABCB7測定用 (13)の組合せ;ABCB8測定用 (14)の組合せ;ABCB9測定用 (15)の組合せ;ABCB11測定用 (16)の組合せ;ABCC1測定用 (17)の組合せ;ABCC2測定用 (18)の組合せ;ABCC3測定用 (19)の組合せ;ABCC4測定用 (20)の組合せ;ABCC5測定用 (21)の組合せ;ABCC6測定用 (22)の組合せ;ABCC7測定用 (23)の組合せ;ABCC8測定用 (24)の組合せ;ABCC9測定用 (25)の組合せ;ABCD1測定用 (26)の組合せ;ABCD2測定用 (27)の組合せ;ABCD3測定用 (28)の組合せ;ABCD4測定用 (29)の組合せ;ABCE1測定用 (30)の組合せ;ABCF1測定用 (31)の組合せ;ABCF2測定用 (32)の組合せ;ABCG1測定用 (33)の組合せ;ABCG2測定用。
遺伝子を含む検体について、前記いずれかに記載の本発
明測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR, RT-
PCRを含む)を行い、用いたプローブの加水分解の有無
を測定するヒトABCトランスポーターの測定方法、特に
上記加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の
有無によりなされる上記測定方法を提供する。
ードプライマー及びリバースプライマーのプライマー
対、並びにレポーター色素とクエンチャー色素とを有し
且つ上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハ
イブリダイズするプローブを用いて、5'-3'エキソヌク
レアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼによりポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR)を行う、リアルタイム検出法によ
って実施される。
一PCR乃至RT-PCR反応条件下にリアルタイムで簡便且つ
迅速に、各種ABCトランスポーターを分別定量できるも
のであり、その確立は、臨床分野、医薬品分野において
非常に有益である。
る動態試験において重要な位置を占める薬物輸送に関与
するABCトランスポーターのヒト試料中でのmRNAの発現
を容易に定量することができ、これによって、医薬品な
どの化学物質に曝露された場合のABCトランスポーター
の変化を知ることができる。
時に処理でき、また僅かな組織片から抽出した全RNAを
試料とすることもできるため、例えば、手術で摘出した
組織やバイオプシーにより摘出した組織中のABCトラン
スポーターのmRNA発現を検出、定量する方法として好適
である。
いては、肝臓、腎臓などでの該トランスポーターの発現
量の変化が、血液中(血液に含まれる核を有する細胞)
に存在する同トランスポーター量の変化と相関する可能
性が考えられる。しかるに、この血液中のトランスポー
ター量はごく僅かであり、その測定には多量の血液が必
要となる。本発明に係わる特定のプライマー対とプロー
ブとを用る測定法によれば、上記血液をサンプルとする
場合も、少ないサンプル量で、既存の測定機器を用い
て、該血液中のABCトランスポーター量を充分に測定す
ることができる。
いては、肝臓、腎臓などでの該トランスポーターの発現
量の変化が、唾液などの分泌液中に含まれる核を有する
細胞における同発現量の変化と相関する可能性が考えら
れる。この場合も、唾液などの分泌液中の発現量は微量
であり、その測定には多量の分泌液を必要とする。しか
るに、本発明では、かかる分泌液をサンプルとしても、
少ないサンプル量で充分な測定が可能である利点があ
る。
プライマー対につき詳述する。
り、ABCトランスポーター遺伝子の特定領域にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
するPCR(RT-PCR)の条件でハイブリダイズすることをい
う。
共通する要件としては、増幅生成物が約50-400塩基対の
長さであること、プライマーとプローブができる限り近
接していること、配列に含まれるG(グアニン)及びC
(シトシン)の割合がなるべく50%前後であること、G
(グアニン)が4つ以上連続していないことなどを挙げ
ることができる。また、その他の要件としては、プロー
ブではTm値が70℃前後であること、プライマーではTm値
が60℃前後であることを挙げることができる。
あり、それぞれジーンバンク(BenBank)に以下の登録
番号で登録されている。 (1)ABCA1遺伝子;NM#005502 (2)ABCA2遺伝子;U18236 (3)ABCA3遺伝子;NM#001089 (4)ABCA4遺伝子;NM#000350 (5)ABCA7遺伝子;AF250238 (6)ABCA8遺伝子;NM#007168 (7)ABCB1遺伝子;NM#000927 (8)ABCB2遺伝子;NM#000593 (9)ABCB3遺伝子;NM#000544 (10)ABCB4遺伝子;NM#000443 (11)ABCB6遺伝子;AJ289233 (12)ABCB7遺伝子;NM#004299 (13)ABCB8遺伝子;NM#007188 (14)ABCB9遺伝子;AF216833 (15)ABCB11遺伝子;NM#003742 (16)ABCC1遺伝子;NM#004996 (17)ABCC2遺伝子;NM#000392 (18)ABCC3遺伝子;NM#003786 (19)ABCC4遺伝子;NM#005845 (20)ABCC5遺伝子;NM#005688 (21)ABCC6遺伝子;NM#001171 (22)ABCC7遺伝子;NM#000492 (23)ABCC8遺伝子;NM#000352 (24)ABCC9遺伝子;NM#005691 (25)ABCD1遺伝子;NM#000033 (26)ABCD2遺伝子;AJ000327 (27)ABCD3遺伝子;NM#002858(28)ABCD4遺伝
子;NM#005050 (29)ABCE1遺伝子;NM#002940 (30)ABCF1遺伝子;AF027302 (31)ABCF2遺伝子;NM#005692 (32)ABCG1遺伝子;NM#004915 (33)ABCG2遺伝子;NM#004827。
ーの特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録
された遺伝子の配列に従うものとする。
用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくと
も15個、通常15-50個、好ましくは約20-40個の範囲にあ
るのがよい。これらプライマー及びプローブのヌクレオ
チド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、1本鎖DNA
にハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎ
ると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
チド配列の好ましい具体的例は、前述したとおりであ
り、各遺伝子の分子種に応じて、それぞれ配列番号1-47
(プローブの場合)並びに配列番号48-141(プライマー
の場合)に示される。
マー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッチ
が存在してもハイブリダイズし得、PCRのプライマーと
して又は検出用プローブとして、機能し得ることが知ら
れている。従って、本発明におけるプライマー及びプロ
ーブも、上記特定の具体的ヌクレオチド配列を有するも
のに限定されず、該配列をその一部として含むものであ
ることができる。その例としては、上記具体的配列中の
例えば2個以下、特に1個のヌクレオチドの置換、欠失及
び/又は付加による修飾のなされた配列を挙げることが
できる。
オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例え
ばDNAシンセサイザー(パーキンエルマー社)などを用
いて容易に合成することができる。得られるオリゴヌク
レオチドは、更に必要に応じて、市販の精製用カートリ
ッジなどを用いて精製することができる。
その一端、例えば5'-末端にレポーター色素を結合して
おり、他端、例えば3'-末端にクエンチャー色素を結合
している。レポーター色素は、例えば励起光の照射によ
って蛍光を発する物質であり、クエンチャーは、該レポ
ーター色素に距離的に接近して存在する場合にレポータ
ー色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有す
るものである。該レポーター色素の例としては、例えば
6-カルボキシ-フルオレッセイン(FAM)、テトラクロロ
-6-カルボキシフルオレッセイン(TET)、2,7-ジメトキ
シ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(IO
E)、ヘキソクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(HE
X)などが挙げられる。クエンチャー色素の例として
は、例えば6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン(TA
MRA)などが挙げられる。
ブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチ
ャー色素を結合させることにより調製できる。例えば、
プローブの5'側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーと
し、末端のリン酸基にFAM分子をリン酸エステルの形で
結合させることができる。また、3'側には、下に示す構
造単位を介してアミド結合によりTAMRA分子を結合させ
得る。
利用したPCR検出法及びリアルタイム検出法につき詳述
する。
対及びプローブを利用することを必須とする。他の操
作、条件などは公知のPCR法(例えば、Science, 230, 1
350 (1985)参照)、RT-PCR(Genome Res., 6(10), 986
(1996)参照)など、特にリアルタイム検出法(例えばTa
qMan PCR, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYST
EM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996参照)に従
うことができる。
Cトランスポーターの発現量の測定方法として、該トラ
ンスポーターのmRNAを測定する場合に有用である。この
場合、特定のABCトランスポーターを発現している生体
組織を採取し、常法に従って全RNAを抽出し、次にそれ
に対して相補性のcDNAを常法に従って合成した後、本発
明プライマー対とプローブとを用いて、PCRを行えばよ
い。また、常法に従って全RNAを抽出後、本発明プライ
マー対とプローブとを用いて、直接RT-PCRを行うことも
できる。
の方法に従うことができる。それらの反応条件も公知の
方法に準じて適宜決定することができ、特に異なるもの
ではない。具体的には、後記実施例に示す条件を好まし
く採用できる。
ば、アルゴンレーザ光をPCR反応液に照射し、放射され
る蛍光をCCDカメラを用いて検出することにより行うこ
とができる。
環境ホルモン、生体内物質などの輸送に関与するABCト
ランスポーターを容易且つ迅速に、しかもその分子種毎
に区別して、測定、検出することができる。
ットをも提供する。このキットは上記プライマー対及び
プローブを含んでなる。本発明キットには、対照として
使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定する
ためのプライマー対及びプローブを更に含んでいてもよ
い。
ー遺伝子を、その分子種毎に分別して、迅速且つ精度よ
く、測定(定量)、検出できる。かくして、新薬の他剤
との相互作用や配合禁忌などに関連する基礎データーを
効率よく得ることができる。
例及び実施例を挙げる。
は、96ウエルを用いて、最大96の異なった反応を同時に
実施して、一度に最大96の検体を測定できるものであ
る。また、1チューブ内でRT反応とPCR反応とを行うこと
ができる。
素を用いて、一方の色素(リポーター色素)の蛍光波長
と他方の色素(クエンチャー色素)の励起光波長との間
で、波長領域が重なる場合に生じるFRETの現象を利用し
ている。より詳しくは、この原理は次の通り説明でき
る。即ち、FRETを生じる2種の蛍光色素を両末端に結合
させたプローブ(TaqMan probe)は、PCRで増幅した特
定のABCトランスポーターに由来するcDNAにハイブリダ
イゼーションし、この状態でPCRの伸長反応が始まる。
この反応系に、Taq DNAポリメラーゼを存在させると、
該ポリメラーゼの有する5'-3'エンドヌクレアーゼ活性
によって、Taq Manプローブが加水分解されて、これに
結合していたリポーター色素が脱離する。該色素の脱離
によれば、クエンチャー色素との間の物理的距離が生
じ、FRETによって抑制されていたリポーター色素の蛍光
強度が増加する。この蛍光強度の増加は、PCRの増幅産
物の増加量に比例する。従って、該蛍光強度の増加をPC
R反応毎に測定すれば、所望の定量が可能となる。
ター色素としてFAMを、3'末端側にクエンチャー色素と
してTAMRAを結合させたTaq Manプローブを使用した。こ
れら各色素の結合及びこれによるTaq Manプローブの作
成は、文献記載の方法(Genome Res., 6(10), 986 (199
6))に従った。
オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてABI
社製のDNA/RNA合成機を利用して、基質(dNTP)及び規
定の試薬を用いて合成した。
臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓及び成人の肝臓
プールよりそれぞれ精製された全RNAを用いた。尚、こ
れらの全RNAはいずれもクローンテック社(Clontech La
boratories, Inc.)より購入した。
小腸、胎児の肝臓及び成人の肝臓プールより精製された
全RNAは、RNaseフリーの水で希釈し、20μg/mLに調整し
た。その後、これら6種類を等量ずつ混合し、検量線作
成用とした。以後は、50μg/mLのイーストtRNA(Yeast
tRNA, GIBCO社製)を用いて、5倍公比で希釈した。測定
には5μLを使用した。
マー、900nMリバースプライマー及び200nM Taq Manプロ
ーブを含むキット(Taq Man One-Step RT-PCR Master M
ix Reagents Kit, PE Applied Biosystems)を用いて、5
0μL/チューブの系で、配列検出システム(ABI PRISMTM
7700 Sequence Detection System, PE Applied Biosyst
ems)を用いて行った。
で保温した後、95℃で15秒間、60℃で1分間のサイクル
を50回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
ターに対して各配列番号に示される配列のプライマー対
及びプローブを用いて行った上記試験の結果(検量線)
を表5及び表6に示す。
全RNA/50μL反応液量から5倍公比で希釈された検量線を
作成したところ、ABCA1については、1.28pg全RNA/50μL
反応液量まで定量性を有しており、他のABCトランスポ
ーターについても6.4pgから20000pg全RNAを定量下限と
した検量線の相関係数(r)は0.99以上であった。
Claims (12)
- 【請求項1】 ヒトABCトランスポーターの測定に用い
られるプローブであって、下記(1)〜(33)に示される各
領域のいずれかにハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドからなる群から選ばれるプローブ。 (1)ABCA1遺伝子の1202-1224の領域又は2832-2855の領域 (2)ABCA2遺伝子の116-141の領域 (3)ABCA3遺伝子の3203-3230の領域 (4)ABCA4遺伝子の4133-4159の領域又は1689-1717の領域 (5)ABCA7遺伝子の153-178の領域又は1393-1418の領域 (6)ABCA8遺伝子の1163-1186の領域又は976-1001の領域 (7)ABCB1遺伝子の3453-3481の領域又は411-437の領域 (8)ABCB2遺伝子の330-355の領域又は653-680の領域 (9)ABCB3遺伝子の543-567の領域 (10)ABCB4遺伝子の3359-3386の領域又は2387-2416の領
域又は1476-1500の領域又は2197-2226の領域又は523-54
8の領域 (11)ABCB6遺伝子の1269-1296の領域 (12)ABCB7遺伝子の1610-1636の領域又は559-586の領域 (13)ABCB8遺伝子の511-540の領域 (14)ABCB9遺伝子の1152-1181の領域 (15)ABCB11遺伝子の1611-1639の領域又は999-1029の領
域 (16)ABCC1遺伝子の576-601の領域 (17)ABCC2遺伝子の1216-1243の領域 (18)ABCC3遺伝子の1788-1815の領域 (19)ABCC4遺伝子の525-554の領域 (20)ABCC5遺伝子の3180-3205の領域 (21)ABCC6遺伝子の303-334の領域 (22)ABCC7遺伝子の575-602の領域 (23)ABCC8遺伝子の1780-1805の領域 (24)ABCC9遺伝子の1835-1862の領域 (25)ABCD1遺伝子の1091-1115の領域 (26)ABCD2遺伝子の1884-1913の領域 (27)ABCD3遺伝子の1411-1436の領域 (28)ABCD4遺伝子の169-196の領域 (29)ABCE1遺伝子の1564-1590の領域又は290-315の領域 (30)ABCF1遺伝子の757-780の領域又は944-969の領域 (31)ABCF2遺伝子の43-72の領域 (32)ABCG1遺伝子の1505-1532の領域 (33)ABCG2遺伝子の425-448の領域 - 【請求項2】 更にリポーター色素とクエンチャー色素
とを結合させたものである請求項1に記載のプローブ。 - 【請求項3】 塩基配列の長さが20-40の範囲にある請
求項1に記載のプローブ。 - 【請求項4】 配列番号1〜配列番号47に示される配列の
いずれかを含むものである請求項1-3のいずれかに記載
のプローブ。 - 【請求項5】 配列番号1〜配列番号47に示される配列の
いずれかである請求項1-3のいずれかに記載のプロー
ブ。 - 【請求項6】 下記(1)〜(33)のいずれかに示される各領
域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフ
ォワードプライマー、プローブ及びリバースプライマー
の組合せを含む、ヒトABCトランスポーターの測定キッ
ト。 (1)フォワードプライマー;ABCA1遺伝子の1169-1190領
域、プローブ;同遺伝子の1202-1224領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1263-1241領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCA1遺伝子の2799-2819領域、プロー
ブ;同遺伝子の2832-2855領域及びリバースプライマ
ー;同遺伝子の2979-2959領域 (2)フォワードプライマー;ABCA2遺伝子の77-95領域、
プローブ;同遺伝子の116-141領域及びリバースプライ
マー;同遺伝子の238-218領域(ジーンバンク(GenBan
k)の登録番号U18236での位置) (3)フォワードプライマー;ABCA3遺伝子の3120-3140領
域、プローブ;同遺伝子の3203-3230領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の3279-3259領域 (4)フォワードプライマー;ABCA4遺伝子の4077-4099領
域及びリバースプライマー;同遺伝子の4201-4181領
域、プローブ;同遺伝子の4133-4159領域或いはプライ
マー対;ABCA4遺伝子の1652-1674領域、プローブ;同遺
伝子の1689-1717領域及びリバースプライマー;同遺伝
子の1850-1829領域 (5)フォワードプライマー;ABCA7遺伝子の38-59領域、
プローブ;同遺伝子の153-178領域及びリバースプライ
マー;同遺伝子の231-209領域或いはプライマー;ABCA7
遺伝子の1285-1303領域、プローブ;同遺伝子の1393-14
18領域及びリバースプライマー;同遺伝子の1442-1420
領域 (6)フォワードプライマー;ABCA8遺伝子の1085-1106領
域、プローブ;同遺伝子の1163-1186領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1252-1231領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCA8遺伝子の838-857領域、プローブ;
同遺伝子の976-1001領域及びリバースプライマー;同遺
伝子の1032-1012領域 (7)フォワードプライマー;ABCB1遺伝子の3389-3409領
域、プローブ;同遺伝子の3453-3481領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の3561-3542領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCB1遺伝子の323-344領域、プローブ;
同遺伝子の411-437領域及びリバースプライマー;同遺
伝子の506-486領域 (8)フォワードプライマー;ABCB2遺伝子の286-304領
域、プローブ;同遺伝子の330-355領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の431-412領域或いはフォワードプ
ライマー;ABCB2遺伝子の628-649領域、プローブ;同遺
伝子の653-680領域及びリバースプライマー;同遺伝子
の752-731領域 (9)フォワードプライマー;ABCB3遺伝子の518-539領
域、プローブ;同遺伝子の543-567領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の670-649領域 (10)フォワードプライマー;ABCB4遺伝子の3324-3340領
域、プローブ;同遺伝子の3359-3386領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の3520-3498領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCB4遺伝子の2357-2377領域、プロー
ブ;同遺伝子の2387-2416領域及びリバースプライマ
ー;同遺伝子の2453-2431領域或いはフォワードプライ
マー;ABCB4遺伝子の1412-1432領域、プローブ;同遺伝
子の1476-1500領域及びリバースプライマー;同遺伝子
の1546-1525領域或いはフォワードプライマー;ABCB4遺
伝子の2174-2192領域、プローブ;同遺伝子の2197-2226
領域及びリバースプライマー;同遺伝子の2325-2305領
域或いはフォワードプライマー;ABCB4遺伝子の375-395
領域、プローブ;同遺伝子の523-548領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の575-554領域 (11)フォワードプライマー;ABCB6遺伝子の1245-1266領
域、プローブ;同遺伝子の1269-1296領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1408-1386領域 (12)フォワードプライマー;ABCB7遺伝子の1558-1579領
域、プローブ;同遺伝子の1610-1636領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1757-1736領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCB7遺伝子の531-552領域、プローブ;
同遺伝子の559-586領域及びリバースプライマー;同遺
伝子の716-696領域 (13)フォワードプライマー;ABCB8遺伝子の429-449領
域、プローブ;同遺伝子の511-540領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の565-543領域 (14)フォワードプライマー;ABCB9遺伝子の1128-1149領
域、プローブ;同遺伝子の1152-1181領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1211-1190領域 (15)フォワードプライマー;ABCB11遺伝子の1581-1602
領域、プローブ;同遺伝子の1611-1639領域及びリバー
スプライマー;同遺伝子の1712-1691領域或いはフォワ
ードプライマー;ABCB11遺伝子の974-996領域、プロー
ブ;同遺伝子の999-1029領域及びリバースプライマー;
同遺伝子の1053-1033領域 (16)フォワードプライマー;ABCC1遺伝子の546-567領
域、プローブ;同遺伝子の576-601領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の682-662領域 (17)フォワードプライマー;ABCC2遺伝子の1176-1197領
域、プローブ;同遺伝子の1216-1243領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1306-1286領域 (18)フォワードプライマー;ABCC3遺伝子の1731-1753領
域、プローブ;同遺伝子の1788-1815領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1837-1817領域 (19)フォワードプライマー;ABCC4遺伝子の499-520領
域、プローブ;同遺伝子の525-554領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の587-565領域 (20)フォワードプライマー;ABCC5遺伝子の3134-3155領
域、プローブ;同遺伝子の3180-3205領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の3256-3236領域 (21)フォワードプライマー;ABCC6遺伝子の224-244領
域、プローブ;同遺伝子の303-334領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の419-397領域 (22)フォワードプライマー;ABCC7遺伝子の494-514領
域、プローブ;同遺伝子の575-602領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の647-627領域 (23)フォワードプライマー;ABCC8遺伝子の1750-1771領
域、プローブ;同遺伝子の1780-1805領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1837-1817領域 (24)フォワードプライマー;ABCC9遺伝子の1770-1790領
域、プローブ;同遺伝子の1835-1862領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1893-1872領域 (25)フォワードプライマー;ABCD1遺伝子の1057-1078領
域、プローブ;同遺伝子の1091-1115領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1159-1139領域 (26)フォワードプライマー;ABCD2遺伝子の1811-1833領
域、プローブ;同遺伝子の1884-1913領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1959-1938領域 (27)フォワードプライマー;ABCD3遺伝子の1354-1375領
域、プローブ;同遺伝子の1411-1436領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1460-1439領域 (28)フォワードプライマー;ABCD4遺伝子の146-167領
域、プローブ;同遺伝子の169-196領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の319-299領域 (29)フォワードプライマー;ABCE1遺伝子の1488-1508領
域、プローブ;同遺伝子の1564-1590領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1646-1625領域或いはフォワー
ドプライマー;ABCE1遺伝子の248-269領域、プローブ;
同遺伝子の290-315領域及びリバースプライマー;同遺
伝子の416-394領域 (30)フォワードプライマー;ABCF1遺伝子の729-749領
域、プローブ;同遺伝子の757-780領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の862-841領域或いはフォワードプ
ライマー;ABCF1遺伝子の916-936領域、プローブ;同遺
伝子の944-969領域及びリバースプライマー;同遺伝子
の1008-986領域 (31)フォワードプライマー;ABCF2遺伝子の18-39領域、
プローブ;同遺伝子の43-72領域及びリバースプライマ
ー;同遺伝子の112-90領域 (32)フォワードプライマー;ABCG1遺伝子の1478-1499領
域、プローブ;同遺伝子の1505-1532領域及びリバース
プライマー;同遺伝子の1555-1534領域 (33)フォワードプライマー;ABCG2遺伝子の395-416領
域、プローブ;同遺伝子の425-448領域及びリバースプ
ライマー;同遺伝子の563-542領域 - 【請求項7】 プローブが、更にリポーター色素とクエ
ンチャー色素とを結合させたものである請求項6に記載
の測定キット。 - 【請求項8】 下記(1)〜(33)のいずれかに記載の各配列
番号で示される配列を含むオリゴヌクレオチドからな
る、フォワードプライマー、プローブ及びリバースプラ
イマーの組合せから選ばれる、請求項7に記載の測定キ
ット。 (1)フォワードプライマー;配列番号48、プローブ;配
列番号1及びリバースプライマー;49或いはフォワード
プライマー;配列番号50、プローブ;配列番号2及びリ
バースプライマー;51 (2)フォワードプライマー;配列番号52、プローブ;配
列番号3及びリバースプライマー;53 (3)フォワードプライマー;配列番号54、プローブ;配
列番号4及びリバースプライマー;55 (4)フォワードプライマー;配列番号56、プローブ;配
列番号5及びリバースプライマー;57或いはフォワード
プライマー;配列番号58、プローブ;配列番号6及びリ
バースプライマー;59 (5)フォワードプライマー;配列番号60、プローブ;配
列番号7及びリバースプライマー;61或いはフォワード
プライマー;配列番号62、プローブ;配列番号8及びリ
バースプライマー;63 (6)フォワードプライマー;配列番号64、プローブ;配
列番号9及びリバースプライマー;65或いはフォワード
プライマー;配列番号66、プローブ;配列番号10及びリ
バースプライマー;67 (7)フォワードプライマー;配列番号68、プローブ;配
列番号11及びリバースプライマー;69或いはフォワード
プライマー;配列番号70、プローブ;配列番号12及びリ
バースプライマー;71 (8)フォワードプライマー;配列番号72、プローブ;配
列番号13及びリバースプライマー;73或いはフォワード
プライマー;配列番号74、プローブ;配列番号14及びリ
バースプライマー;75 (9)フォワードプライマー;配列番号76、プローブ;配
列番号15及びリバースプライマー;77 (10)フォワードプライマー;配列番号78、プローブ;配
列番号16及びリバースプライマー;79或いはフォワード
プライマー;配列番号80、プローブ;配列番号17及びリ
バースプライマー;81或いはフォワードプライマー;配
列番号82、プローブ;配列番号18及びリバースプライマ
ー;83或いはフォワードプライマー;配列番号84、プロ
ーブ;配列番号19及びリバースプライマー;85或いはフ
ォワードプライマー;配列番号86、プローブ;配列番号
20及びリバースプライマー;87 (11)フォワードプライマー;配列番号88、プローブ;配
列番号21及びリバースプライマー;89 (12)フォワードプライマー;配列番号90、プローブ;配
列番号22及びリバースプライマー;91或いはフォワード
プライマー;配列番号92、プローブ;配列番号23及びリ
バースプライマー;93 (13)フォワードプライマー;配列番号94、プローブ;配
列番号24及びリバースプライマー;95 (14)フォワードプライマー;配列番号96、プローブ;配
列番号25及びリバースプライマー;97 (15)フォワードプライマー;配列番号98、プローブ;配
列番号26及びリバースプライマー;99或いはフォワード
プライマー;配列番号100、プローブ;配列番号27及び
リバースプライマー;101 (16)フォワードプライマー;配列番号102、プローブ;
配列番号28及びリバースプライマー;103 (17)フォワードプライマー;配列番号104、プローブ;
配列番号29及びリバースプライマー;105 (18)フォワードプライマー;配列番号106、プローブ;
配列番号30及びリバースプライマー;107 (19)フォワードプライマー;配列番号108、プローブ;
配列番号31及びリバースプライマー;109 (20)フォワードプライマー;配列番号110、プローブ;
配列番号32及びリバースプライマー;111 (21)フォワードプライマー;配列番号112、プローブ;
配列番号33及びリバースプライマー;113 (22)フォワードプライマー;配列番号114、プローブ;
配列番号34及びリバースプライマー;115 (23)フォワードプライマー;配列番号116、プローブ;
配列番号35及びリバースプライマー;117 (24)フォワードプライマー;配列番号118、プローブ;
配列番号36及びリバースプライマー;119 (25)フォワードプライマー;配列番号120、プローブ;
配列番号37及びリバースプライマー;121 (26)フォワードプライマー;配列番号122、プローブ;
配列番号38及びリバースプライマー;123 (27)フォワードプライマー;配列番号124、プローブ;
配列番号39及びリバースプライマー;125 (28)フォワードプライマー;配列番号126、プローブ;
配列番号40及びリバースプライマー;127 (29)フォワードプライマー;配列番号128、プローブ;
配列番号41及びリバースプライマー;129或いはフォワ
ードプライマー;配列番号130、プローブ;配列番号42
及びリバースプライマー;131 (30)フォワードプライマー;配列番号132、プローブ;
配列番号43及びリバースプライマー;133或いはフォワ
ードプライマー;配列番号134、プローブ;配列番号44
及びリバースプライマー;135 (31)フォワードプライマー;配列番号136、プローブ;
配列番号45及びリバースプライマー;137 (32)フォワードプライマー;配列番号138、プローブ;
配列番号46及びリバースプライマー;139 (33)フォワードプライマー;配列番号140、プローブ;
配列番号47及びリバースプライマー;141。 - 【請求項9】 請求項8に記載の測定キットであって、
(1)の組合せがABCA1の測定用で、(2)の組合せがABCA2の
測定用で、(3)の組合せがABCA3の測定用で、(4)の組合
せがABCA4の測定用で、(5)の組合せがABCA7の測定用
で、(6)の組合せがABCA8の測定用で、(7)の組合せがABC
B1の測定用で、(8)の組合せがABCB2の測定用で、(9)の
組合せがABCB3の測定用で、(10)の組合せがABCB4の測定
用で、(11)の組合せがABCB6の測定用で、(12)の組合せ
がABCB7の測定用で、(13)の組合せがABCB8の測定用で、
(14)の組合せがABCB9の測定用で、(15)の組合せがABCB1
1の測定用で、(16)の組合せがABCC1の測定用で、(17)の
組合せがABCC2の測定用で、(18)の組合せがABCC3の測定
用で、(19)の組合せがABCC4の測定用で、(20)の組合せ
がABCC5の測定用で、(21)の組合せがABCC6の測定用で、
(22)の組合せがABCC7の測定用で、(23)の組合せがABCC8
の測定用で、(24)の組合せがABCC9の測定用で、(25)の
組合せがABCD1の測定用で、(26)の組合せがABCD2の測定
用で、(27)の組合せがABCD3の測定用で、(28)の組合せ
がABCD4の測定用で、(29)の組合せがABCE1の測定用で、
(30)の組合せがABCF1の測定用で、(31)の組合せがABCF2
の測定用で、(32)の組合せがABCG1の測定用で、(33)の
組合せがABCG2の測定用である測定キット。 - 【請求項10】 フォワードプライマー、プローブ及び
リバースプライマーが、請求項8に記載の(1)〜(33)のい
ずれかに記載の各配列番号で示される配列であるオリゴ
ヌクレオチドから選ばれる、請求項9に記載の測定キッ
ト。 - 【請求項11】 ヒトABCトランスポーターのmRNAを含む
検体について、請求項6-10のいずれかに記載の測定キッ
トを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、用いたプロー
ブの加水分解の有無を測定することを特徴とするヒトAB
Cトランスポーターの測定方法。 - 【請求項12】加水分解の有無が、励起光照射による蛍
光の発色の有無によりなされる請求項11に記載の測定方
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000303404A JP4288444B2 (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | ヒトabcトランスポーターの測定方法、そのためのプローブ及びキット |
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002112775A true JP2002112775A (ja) | 2002-04-16 |
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JP2000303404A Expired - Lifetime JP4288444B2 (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | ヒトabcトランスポーターの測定方法、そのためのプローブ及びキット |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006197832A (ja) * | 2005-01-19 | 2006-08-03 | Tohoku Univ | 環境感受性蛍光プローブを用いたシステイン残基が変異導入されたabcトランスポーターの汎用的な基質親和性検出方法 |
-
2000
- 2000-10-03 JP JP2000303404A patent/JP4288444B2/ja not_active Expired - Lifetime
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JP2006197832A (ja) * | 2005-01-19 | 2006-08-03 | Tohoku Univ | 環境感受性蛍光プローブを用いたシステイン残基が変異導入されたabcトランスポーターの汎用的な基質親和性検出方法 |
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