JP2021171047A - Ｌｎａプローブと酸化グラフェンとの複合体、及びそれを使用した核酸検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＬＮＡプローブと酸化グラフェンとの複合体、及びそれを使用した核酸検出方法の提供。【解決手段】ＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを含む核酸検出用の組成物であって、該分子ビーコンは、標的核酸結合配列を含む第１の一本鎖と、少なくとも部分的に酸化グラフェンと結合された第２の一本鎖とを相補的にコンジュゲートさせることによって形成されており、該第１の一本鎖は、該標的核酸の存在下で該第２の一本鎖から分離され、該標的核酸に結合される、核酸検出用の組成物である。【選択図】図１

Description

本発明は、ＬＮＡプローブと酸化グラフェンとの複合体、及びそれを使用した核酸検出方法に関する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節に関与する１７ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの非コーディングＲＮＡである。多数の研究により、ｍｉＲＮＡが細胞増殖、分化、血管新生及びアポトーシス等の多様な生物学的過程で重要な役割を担うことが確認されている。それらの異常な発現は、癌、ウイルス感染症、免疫疾患及び神経変性障害等の様々な深刻な疾患に関連している。例えば、発癌機能を有することが知られるｍｉＲＮＡ−２１は、乳癌、膵臓癌及び肝細胞癌等の様々な種類の悪性腫瘍でしばしば過剰発現されている。２００８年に、高い安定性を有する幾つかの腫瘍由来のｍｉＲＮＡが癌異種移植マウスの血清及び血漿で見つかった。腫瘍特異的ｍｉＲＮＡは患者の臨床試料においても検出されるため、ｍｉＲＮＡは有望な非侵襲性バイオマーカーとして注目を集めている。

一般的に、リアルタイムＰＣＲ及びｍｉＲＮＡマイクロアレイは、ｍｉＲＮＡの定量的検出のために従来から使用されている。しかしながら、手順が複雑であるだけでなく、試薬及び装置が高価であるために、実際の臨床利用には限界があった。上記の問題を解決するために、単純で高速な検出プラットフォームを構築するために多くの技術的及び科学的な試みがあった。蛍光、比色、表面プラズモン共鳴及び電気化学的方法と高性能のシグナル増幅方法とを組み合わせた様々な技術に基づく多くのｍｉＲＮＡ検出システムが、ここ数十年で提案されている。その中でも、ナノ材料ベースのｍｉＲＮＡ検出及び分析方法は、かなりの注目を浴びて開発された。

こうして、本発明者らは、酸化グラフェン（ＧＯ）−ＤＮＡコンジュゲート体を使用したｍｉＲＮＡ検出のための汎用性のある実用的なプラットフォームを開発した。酸化グラフェンは、多量に合成することができる廉価なナノ材料である。酸化グラフェンは、親水性部と疎水性部との両方を有し、様々なバイオセンサー用途に使用される。それというのも、酸化グラフェンは、高い熱伝導性及び電気伝導性の特性を維持するからである。特に、酸化グラフェンは、ＧＯの効率的な蛍光消光能力及び高いプローブ負荷能力に依存する蛍光核酸検知システムの開発に広く使用されている。バイオセンサーでは、酸化グラフェンは一般に、π−πスタッキング又は水素結合相互作用を通じて一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）に強い親和性を示し、こうしてｓｓＮＡの高効率分離のための材料として機能する。しかしながら、この複合体は、タンパク質、核酸及び脂肪等の様々な競合する生体分子と反応することにより非特異的なシグナルを誘発する等の問題を呈する。

これらの問題を解決するために、本発明者らは、新たな標的核酸検出システムの開発を試みるうちに、ＴＭＳＤ（足がかり配列を介した鎖置換（toehold-mediated strand displacement））原理に基づくＬＮＡ（ロックド核酸）含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを使用した標的核酸検出システムを開発した。

ＴＭＳＤは、酵素を用いずにＤＮＡ又はＲＮＡの一方の鎖をもう一方の鎖に交換する分子ツールであり、これはワトソン−クリック塩基対（ＡＴ／Ｕ及びＣ−Ｇ）を介したＤＮＡ又はＲＮＡの２つの相補鎖のハイブリダイゼーションに基づき、分岐点移動と呼ばれる過程を使用する。ＴＭＳＤは、原鎖（original strand）と保護鎖（protective strand）とからなる二本鎖ＤＮＡ複合体から始まる。原鎖は、侵入鎖（invading strand）と呼ばれる３つ目のＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖に相補的な、いわゆる「足がかり（toehold：トーホールド）」突出領域を有する。原鎖の足がかり領域は、相補的な侵入鎖とハイブリダイズし、３つの核酸鎖から構成される複合体を形成して、ＴＭＳＤ過程が進行する。結果として、原鎖と侵入鎖とが結びついて二本鎖を形成し、原鎖に当初結合していた保護鎖は分離される。

ＬＮＡはＲＮＡ類似体であり、リボース環が「ロック」されているため、ワトソン−クリック対合に理想的な構造をとる。ＬＮＡヌクレオチドは、従来のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドよりも相補鎖への結合力が高い結果として、相補鎖に結合すると高温であっても安定性を有する。したがって、ＬＮＡヌクレオチドは高い感度及び特異性を示し、単一塩基の違いを容易に検出する。

これに基づき、本発明者らによって、ＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを使用して、ＬＮＡ含有分子ビーコンの一本鎖を標的核酸と結合させることにより複合体を形成させ、この複合体が酸化グラフェンから分離されて、蛍光シグナルが誘発され、非常に低い濃度の標的核酸を高感度で検出することができ、蛍光シグナルの多様化によって複数の標的核酸を同時に検出することができるということが確認され、本発明の完成に至った。

本発明の目的は、ＬＮＡ（ロックド核酸）を使用して低濃度の標的核酸を認識することにより高感度で標的核酸を検出することができ、蛍光シグナルの波長多様化によって複数の標的核酸を同時に検出することができる核酸検出用の組成物を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、上記組成物を使用した核酸検出方法を提供することである。

上記目的を達成するために、本発明は、ＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを含む核酸検出用の組成物であって、前記分子ビーコンは、標的核酸結合配列を含む第１の一本鎖と、少なくとも部分的に酸化グラフェンと結合された第２の一本鎖とを相補的にコンジュゲートさせることによって形成されており、前記第１の一本鎖は、前記標的核酸の存在下で前記第２の一本鎖から分離され、前記標的核酸に結合される、核酸検出用の組成物を提供する。

本発明はまた、核酸検出方法であって、以下の工程：
ＬＮＡ含有分子ビーコンと酸化グラフェンとを共有結合でコンジュゲートさせる工程と、
前記工程で得られた核酸検出用の組成物と前記標的核酸を含む試料とを混合することによって混合物を得る工程と、
前記混合物中で前記標的核酸を検出する工程と、
を含む、核酸検出方法を提供する。

さらに、本発明は、ＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを有する核酸検出用のキットであって、前記分子ビーコンは、標的核酸結合配列を含む第１の一本鎖と、少なくとも部分的に酸化グラフェンと結合された第２の一本鎖とを相補的にコンジュゲートさせることによって形成されており、前記第１の一本鎖は、前記標的核酸の存在下で前記第２の一本鎖から分離され、前記標的核酸に結合される、核酸検出用のキットを提供する。

本発明の核酸検出用の組成物、キット及び方法によれば、ＬＮＡ含有分子ビーコンは、共有結合を介して酸化グラフェンとコンジュゲートされており、分子ビーコンの一本鎖が標的核酸に結合することで複合体が形成され、この複合体が酸化グラフェンから分離されて、蛍光シグナルが誘発される。分子ビーコンと酸化グラフェンとを共有結合させて非特異的シグナルを最小限にすることができ、また、ＬＮＡが付加された分子ビーコンを二本鎖で設計することで、非常に低濃度の標的核酸も蛍光シグナルと同様に高感度で検出され、そして蛍光シグナルの多様化によって複数の標的核酸を同時に検出することができる。本発明により、中毒疾患及び疾患進行に応じて特定の発現レベルが特異的に変化する核酸バイオマーカーを容易かつ正確に検出することが可能である。

ＧＯ−ＬＭＢ複合体を使用したｍｉＲＮＡを検出する方法の概要を示す図である。 本発明の実施形態で使用される標的（ｍｉＲ−２１）及び分子ビーコン（ＬＭＢ−２１）のＤＮＡ配列を示す図である。 ＬＭＢ及びＧＯの混合物を１×ＰＢＳ及び０．０２％ＨＳＤ溶液で洗浄した場合の洗浄回数に応じた蛍光シグナルの強度を示すグラフである。 ＧＯ−ＬＭＢ−２１が標的（ｍｉＲ−２１）と化学反応し、ゲル電気泳動のシグナル強度が標的（ｍｉＲ−２１）の濃度に比例して増加することを示す一連の図である。図４Ａは、ＧＯ−ＬＭＢを含まないコントロール群と比較した、ＧＯ−ＬＭＢが含まれている場合の標的（ｍｉＲ−２１）の濃度に応じたゲル電気泳動のシグナル強度を示す図である。図４Ｂは、ゲル電気泳動のシグナル強度が標的（ｍｉＲ−２１）の濃度に比例して増加することを示すグラフである。 本発明の実施形態で使用される標的（ｍｉＲ−２１）の濃度に応じた蛍光シグナルの強度を示す一連のグラフである。図５Ａは、標的（ｍｉＲ−２１）の濃度の変動による、経時的な蛍光シグナルの強度を示すグラフである。図５Ｂは、波長による、標的（ｍｉＲ−２１）の濃度に応じた蛍光シグナルの強度を示すグラフである。図５Ｃは、各ｍｉＲＮＡについての蛍光シグナルの強度の向上の程度を示すグラフである。図５Ｄは、波長による、各ｍｉＲＮＡについての蛍光シグナルの強度の向上の程度を示すグラフである。 ＧＯ−ＭＢと比較したＧＯ−ＬＭＢの検出限界を示す一連のグラフである。図６Ａは、標的（ｍｉＲ−２１）の濃度に応じたＧＯ−ＬＭＢの蛍光シグナルの強度の向上の程度を示すグラフである。図６Ｂは、標的（ｍｉＲ−２１）の濃度に応じたＧＯ−ＭＢの蛍光シグナルの強度の向上の程度を示すグラフである。 ｍｉＲ−２１の存在下でのＬＮＡ含有ＧＯ−ＬＭＢ−２１及び一本鎖を使用したＧＯ−ｃＤＮＡ−２１の蛍光シグナルの強度を示す一連のグラフである。図７Ａは、０ｎＭ又は１００ｎＭの濃度のｍｉＲ−２１の存在下でのＧＯ−ＬＭＢ−２１及びＧＯ−ｃＤＮＡ−２１の蛍光シグナルの強度を示すグラフである。図７Ｂは、ｍｉＲ−２１の濃度及び時間に応じたＧＯ−ＬＭＢ−２１及びＧＯ−ｃＤＮＡ−２１の蛍光シグナルの強度を示すグラフである。図７Ｃは、波長による、０ｎＭ又は１００ｎＭの濃度のｍｉＲ−２１の存在下でのＧＯ−ＬＭＢ−２１の蛍光シグナルの強度を示すグラフである。図７Ｄは、波長による、０ｎＭ又は１００ｎＭの濃度のｍｉＲ−２１の存在下でのＧＯ−ｃＤＮＡ−２１の蛍光シグナルの強度を示すグラフである。 ＧＯ−ＬＭＢ−２１が細胞溶解液中で高感度を示すかどうかを確認する一連のグラフである。図８Ａは、ＢＳＡの濃度に応じたＧＯ−ＬＭＢ−２１及び慣用のＧＯセンサーのＦ／Ｆ０値を示すグラフである。図８Ｂは、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下でのｍｉＲ−２１の濃度に応じた蛍光シグナルの強度を示すグラフである。図８Ｃは、波長による、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下でのｍｉＲ−２１の濃度に応じた蛍光シグナルの強度を示すグラフである。 ＨｅｐＧ２細胞溶解液（１００００個の細胞／ウェル）中の濃度に応じたスパイクされたｍｉＲ−２１の蛍光シグナルの強度を示す線形標準曲線である。 蛍光シグナルの波長の多様化により複数の標的核酸を同時に検出する実験結果を示す一連の図である。図１０Ａは、ＧＯ−ＬＭＢ−２１／１２５ｂ／７ａを１００ｎＭの濃度で、少なくとも１つのターゲットｍｉＲＮＡを含む様々な混合物で処理することにより、各ターゲットｍｉＲＮＡが同時に検出される波長を示すグラフです。図１０Ｂは、少なくとも１つの標的ｍｉＲＮＡを１００ｎＭの濃度で含む様々な混合物にＧＯ−ＬＭＢ−２１／１２５ｂ／７ａを処理することにより各標的ｍｉＲＮＡが同時に検出されることを説明する蛍光画像を示す図である。図１０Ｃは、少なくとも１つの標的ｍｉＲＮＡを１００ｎＭの濃度で含む様々な混合物にＧＯ−ＬＭＢ−２１／１２５ｂ／７ａを処理することにより各標的ｍｉＲＮＡが同時に検出されることを説明する蛍光シグナルの強度を示すグラフである。

以下で、本発明を詳細に説明する。

本発明は、ＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを含む核酸検出用の組成物であって、前記分子ビーコンは、標的核酸結合配列を含む第１の一本鎖と、少なくとも部分的に酸化グラフェンと結合された第２の一本鎖とを相補的にコンジュゲートさせることによって形成されており、前記第１の一本鎖は、前記標的核酸の存在下で前記第２の一本鎖から分離され、前記標的核酸に結合される、核酸検出用の組成物を提供する。

本明細書では、標的拡散結合配列は、標的核酸配列の少なくとも一部に相補的に結合することができる配列として理解され得て、第１の一本鎖は、標的核酸結合配列と標的核酸との相補的結合によって標的核酸に結合して、第２の一本鎖から分離される。

さらに、標的核酸結合配列に相補的な配列は、第１の一本鎖の標的核酸結合配列の少なくとも一部が相補的結合を形成し得る配列を指す。

本発明の一態様では、第１の一本鎖及び第２の一本鎖は、独立して１０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さを有するが、必ずしもこれらに限定されるものではない。

さらに、第１の一本鎖の少なくとも一部は、第２の一本鎖の少なくとも一部に相補的であり、例えば１５ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長の二重鎖を有し得る。

さらに、第１の一本鎖の標的核酸結合配列は、相補的塩基対合により標的核酸に結合することができる配列であり、例えば２０ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長であり得る。

本発明の好ましい実施形態では、標的核酸結合配列は、標的核酸配列に相補的な配列として設計することができ、標的核酸との結合力に影響を及ぼさない範囲内で、幾つかの塩基が置換、欠失又は付加されていてもよい。

本発明の一態様では、ＬＮＡ含有分子ビーコン（ＬＭＢ）の各鎖は、１５ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長であり得て、好ましくは、第１の一本鎖は、１５ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長であり得て、第２の一本鎖は、１０ヌクレオチド長〜２０ヌクレオチド長であり得る。

さらに、ＬＮＡ含有分子ビーコン（ＬＭＢ）の第１の一本鎖の少なくとも一部は、第２の一本鎖の少なくとも一部に相補的であってもよく、この分子は、１０ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１５ヌクレオチド長〜２０ヌクレオチド長の二重鎖を有し得る。

さらに、ＬＮＡ含有分子ビーコン（ＬＭＢ）は、第１の一本鎖の３’オーバーハングを含む１つ以上の３’オーバーハングを有していてもよく、このオーバーハングは５ヌクレオチド長〜２０ヌクレオチド長、好ましくは７ヌクレオチド長であり得る。

本発明の一態様では、標的核酸は、ＬＮＡ含有分子ビーコン（ＬＭＢ）の第１の一本鎖に少なくとも部分的に相補的な配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡを含むことが理解され得る。標的核酸ＤＮＡ又はＲＮＡが試料中に存在すると、相補的配列を有する分子ビーコンの第１の一本鎖は、該ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズして二本鎖核酸になる。このハイブリッドが酸化グラフェンから解離すると、第１の一本鎖に結合された蛍光物質が蛍光シグナルを呈し、試料中に存在する標的核酸ＤＮＡ又はＲＮＡが検出される。

本明細書では、標的核酸ＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡ又はタンパク質をコードしないＤＮＡを含み得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。例えば、上記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓＲＮＡ（低分子ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｃＲＮＡ（細胞質低分子ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、又はｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を含み得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。上記ＲＮＡはまた、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、又は調節ＲＮＡを含み得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。

本発明の一態様では、上記ＲＮＡはｍｉＲＮＡを含み得るが、必ずしもこれに限定されるものではない。ｍｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで生物学的機能に関与している場合があり、乳癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、骨癌、皮膚癌、血液癌、糖尿病、又はアルツハイマー病等の様々な疾患の診断、治療又は予後診断における重要なバイオマーカーとして使用されるｍｉＲＮＡを含み得る。例えば、ｍｉＲＮＡは、幹細胞における系譜特異的分化に関与している場合があるが、必ずしもこれに限定されるものではない。

本発明の一態様では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−２１、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ又はｌｅｔ−７ａを含み得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。上記ｍｉＲＮＡ−２１、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ又はｌｅｔ−７ａはヒト細胞において発現され得るが、必ずしもこれに限定されるものではない。ｍｉＲＮＡ−２１、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ又はｌｅｔ−７ａは乳癌細胞において発現され得るが、必ずしもこれに限定されるものではない。例えば、ｍｉＲＮＡ−２１、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ又はｌｅｔ−７ａは、乳癌細胞系統ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５若しくはＭＣＦ−７又は他の癌細胞において発現され得るが、必ずしもこれに限定されるものではない。

本発明の好ましい実施形態では、標的核酸は、ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ（配列番号１）の配列を有し得るｍｉＲ−２１である。第１の一本鎖は、５’−ＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡ−ＮＨ_２（３’）（配列番号２）であり得て、第２の一本鎖は、５’−ＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡ−３’（配列番号３）であり得る。

本発明の一態様では、分子ビーコンの第２の一本鎖は、酸化グラフェンに共有結合でコンジュゲートされていてもよく、具体的には、分子ビーコンの第２の一本鎖のアミン基は、酸化グラフェンのカルボキシル基に共有結合でコンジュゲートされていてもよいが、必ずしもこれらに限定されるものではない。アミン基は酸化グラフェンに共有結合でのコンジュゲートによって結合されており、第１の一本鎖に結合された蛍光試薬と同じ方向に向けられていてもよい。

本発明の一態様では、核酸検出用の組成物は、分子ビーコンの第１の一本鎖に蛍光試薬を結合させることができる。

例えば、前記蛍光試薬は、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、テキサスレッド、フルオレセイン、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン）、フルオレセインクロロトリアジニル、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＲＯＸ（６−カルボキシル−Ｘ−ローダミン）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、ＮＥＤ（Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン）、シアニンベースの色素、及びチアジカルボシアニンからなる群から選択される１つ以上の試薬であり得る。本明細書では、蛍光試薬は、第１の一本鎖が酸化グラフェンから解離されたときに蛍光を呈することができる限り、限定されることなく本発明に含まれ得る。例えば、蛍光試薬は、ＦＡＭ、Ｃｙ５及びＲＯＸからなる群から選択される１つ以上の試薬を含み得る。

本発明の一態様では、核酸検出用の組成物は、酸化グラフェンに一度に２つ以上の分子ビーコンを結合させることができる。このときに、上記組成物は、分子ビーコンの第１の一本鎖に種々の蛍光試薬を結合させることができる。好ましくは、核酸検出用の組成物は、酸化グラフェンに一度に３つの分子ビーコンを結合させることができ、分子ビーコンの第１の一本鎖に種々の蛍光試薬を結合させることができる。本明細書では、蛍光試薬は、第１の一本鎖が酸化グラフェンから解離されたときに蛍光を呈することができる限り、限定されることなく本発明に含まれ得る。例えば、蛍光試薬は、ＦＡＭ、Ｃｙ５及びＲＯＸからなる群から選択される３つの試薬を同時に含み得る。

本発明の一態様では、酸化グラフェンは、約１０ｎｍ〜約１μｍのサイズを有する粒子の形で存在し得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。例えば、酸化グラフェンは、約１０ｎｍ〜約１μｍ、約１０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約１μｍ、約７００ｎｍ〜約１μｍ、約２００ｎｍ〜約３００ｎｍ、又は約４００ｎｍ以下であり得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。

酸化グラフェンのサイズは小さいため、酸化グラフェンは細胞膜を容易に通過して、表面に吸着された第２の一本鎖と共に細胞中に入り込むことができる。

本発明の一態様では、酸化グラフェンは、単層シートの形で存在し得るが、必ずしもこれに限定されるものではない。例えば、単層シートの形の酸化グラフェンは、同じ質量でのその大きな表面積のため、単層シートの形ではない酸化グラフェンと比べて、少量で多数の核酸プローブを吸着することができる。

本発明の一態様では、第２の一本鎖は、酸化グラフェンに共有結合でコンジュゲートされていてもよく、具体的には、第２の一本鎖のアミン基は、酸化グラフェンのカルボキシル基に共有結合でコンジュゲートされていてもよいが、必ずしもこれらに限定されるものではない。標的核酸が存在しないと、第１の一本鎖の蛍光試薬は酸化グラフェンの近くに位置し、蛍光シグナルは消光される。特に、酸化グラフェンと蛍光試薬との間の距離は、蛍光シグナルが消光されるのに十分な距離内にあり得る。例えば、酸化グラフェンと蛍光試薬とは、３ｎｍ〜５ｎｍの距離内に存在し得る。他方で、第１の一本鎖は酸化グラフェンと共有結合を形成していないため、第１の一本鎖は、標的核酸への相補的結合によって第２の一本鎖及び酸化グラフェンから完全に分離され得て、それにより蛍光シグナルが回復し得る。第１の一本鎖と第２の一本鎖とが配列特異的に分離されない限り、第１の一本鎖は酸化グラフェンから分離されないため、非特異的シグナルは生じ得ない。

本発明の一態様では、標的核酸は細胞内に存在し得るが、必ずしもこれに限定されるものではない。例えば、細胞は、培養して基材に固定された細胞、培地中で懸濁されて培養された細胞、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞、生体から単離された細胞、又は分析のために処理された細胞を含み得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。例えば、細胞は、生細胞又は死細胞を含み得て、固定液により固定された細胞を含み得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。

本発明はまた、標的核酸結合配列を含む第１の一本鎖と、少なくとも部分的に酸化グラフェンと結合された第２の一本鎖とを相補的にコンジュゲートさせることによって分子ビーコンが形成される核酸検出方法であって、以下の工程：
ＬＮＡ含有分子ビーコンと酸化グラフェンとを共有結合でコンジュゲートさせる工程と、
前記工程で得られた核酸検出用の組成物と前記標的核酸を含む試料とを混合することによって混合物を得る工程と、
前記混合物中で前記標的核酸を検出する工程と、
を含む、核酸検出方法を提供する。

以下で、核酸を検出する方法を工程ごとに詳細に説明する。

ＬＮＡ含有分子ビーコンと酸化グラフェンとを共有結合でコンジュゲートさせる工程は、分子ビーコンのアミン基と酸化グラフェンのカルボキシル基とを共有結合でのコンジュゲートによってコンジュゲートさせる工程として理解され得るが、必ずしもこれに限定されるものではない。

上記組成物と標的核酸を含む試料とを混合することによって混合物を得る工程は、ＬＮＡ含有分子ビーコンの第１の一本鎖と標的核酸とを結びつけることにより複合体を酸化グラフェンから解離させる工程として理解され得る。

本明細書では、第１の一本鎖は、ＴＭＳＤ（足がかり配列を介した鎖置換）反応によって標的核酸の少なくとも一部に相補的な配列を有する配列でハイブリダイズし、このハイブリッドが酸化グラフェンから解離されると理解され得る。

混合物中の標的核酸を検出する工程は、第１の一本鎖と標的核酸とが結びつき、酸化グラフェンから解離した後に、第１の一本鎖に結合した蛍光物質の蛍光シグナルが回復することによって、蛍光検出器を用いて対応する蛍光シグナルを検出する工程として理解され得る。

本明細書では、この工程は、２つ以上の蛍光物質を使用して蛍光検出器を用いて２つ以上の蛍光シグナルを検知することによって、２つ以上の標的核酸を同時に検出する工程として理解され得る。

本発明の一態様では、核酸検出方法は、上記組成物に蛍光試薬を添加する工程を更に含み得る。

本明細書では、前記蛍光試薬は、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、テキサスレッド、フルオレセイン、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン）、フルオレセインクロロトリアジニル、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＲＯＸ（６−カルボキシル−Ｘ−ローダミン）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、ＮＥＤ（Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン）、シアニンベースの色素、及びチアジカルボシアニンからなる群から選択される１つ以上の試薬であり得る。蛍光試薬は、第１の一本鎖が酸化グラフェンから解離されたときに蛍光を呈することができる限り、限定されることなく本発明に含まれ得る。例えば、蛍光試薬は、ＦＡＭ、Ｃｙ５及びＲＯＸからなる群から選択される１つ以上の試薬を含み得る。

他方で、本発明の増幅された検出シグナルで核酸を検出する方法において、各工程の詳説されたコンディショニング工程（condition steps）の順序等の当業者に明白な変化及び変更も本発明に含まれると理解されるべきである。

さらに、本発明は、ＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを含む組成物を有する核酸検出用のキットであって、前記分子ビーコンは、標的核酸結合配列を含む第１の一本鎖と、少なくとも部分的に酸化グラフェンと結合された第２の一本鎖とを相補的にコンジュゲートさせることによって形成されており、前記第１の一本鎖は、前記標的核酸の存在下で前記第２の一本鎖から分離され、前記標的核酸に結合される、核酸検出用のキットを提供する。

本発明の一態様では、上記キットは、分子ビーコンの第１の一本鎖に蛍光試薬を結合させることができる。本明細書では、前記蛍光試薬は、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、テキサスレッド、フルオレセイン、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン）、フルオレセインクロロトリアジニル、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＲＯＸ（６−カルボキシル−Ｘ−ローダミン）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、ＮＥＤ（Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン）、シアニンベースの色素、及びチアジカルボシアニンからなる群から選択される１つ以上の試薬であり得る。本明細書では、蛍光試薬は、第１の一本鎖が酸化グラフェンから解離されたときに蛍光を呈することができる限り、限定されることなく本発明に含まれ得る。例えば、蛍光試薬は、ＦＡＭ、Ｃｙ５及びＲＯＸからなる群から選択される１つ以上の試薬を含み得る。

核酸検出用の組成物、キット及び方法によれば、ＬＮＡ含有分子ビーコンの第１の一本鎖は、第２の一本鎖に相補的に結合され、その過程で、第１の一本鎖に結合した蛍光試薬が消光された。ＬＮＡを含む第１の一本鎖の足がかり領域と標的核酸とは、ＴＭＳＤ（足がかり配列を介した鎖置換）反応（図１及び図２を参照）によって複合体を形成し、この複合体は分子ビーコンの第２の一本鎖及び酸化グラフェンから分離され、こうして酸化グラフェンによって消光された蛍光シグナルが回復した。より強い蛍光シグナルが標的核酸の濃度に比例して生じ（図４Ａ及び図４Ｂを参照）、蛍光シグナルの強度は、時間に伴って増加したが、蛍光シグナルは、或る特定の時間後に安定した（図５Ａ及び図５Ｂ）。足がかり領域におけるＬＮＡの強力な結合力のため、標的核酸のみを特異的に検出することができ（図５Ｃ及び図５Ｄを参照）、ｐＭレベルの非常に低い濃度でも高感度で標的核酸を正確に検出することができた（図６Ａ及び図６Ｂを参照）。従来のＧＯベースのセンサーと比較して、本発明のセンサーは、はるかに高い検出能を示し（図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃを参照）、細胞溶解液において上記の高い特異性及び感度を落とさない（図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃを参照）ことが確認された。

さらに、異なる種類の核酸を検出する異なる種類の二重鎖分子ビーコンを１つの酸化グラフェンにコンジュゲートさせ、各分子ビーコンに異なる蛍光試薬を結合させて蛍光シグナルを多様化させることによって、複数の標的核酸を同時に検出することができる（図１０Ａ、図１０Ｂ及び図１０Ｃを参照）。本発明により、中毒疾患及び疾患進行に応じて発現レベルが特異的に変化する核酸バイオマーカーを容易かつ正確に検出することが可能である。本発明のナノセンサーを非臨床研究に適用すると共に、それをｍｉＲＮＡによる毒性評価に適用することによって、既存の研究との相乗効果を達成することができる。

これより、本発明を以下の実施例によって詳細に説明する。

しかしながら、以下の実施例は、本発明の例示のためであるにすぎず、本発明の内容は実施例に限定されるものではない。

実施例１：標的核酸検出システムの作製
標的核酸検出システムとしてのＬＮＡ含有分子ビーコン（ＬＭＢ）を作製するために、１００μＭのアミン官能化された上側鎖（upper strand）ＤＮＡ（１０μＬ）を、１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の等量のＦＡＭ標識された下側鎖（bottom strand）ＤＮＡと混合した。次いで、この混合物を、９０℃で５分間加熱した後に１時間かけて室温にゆっくりと冷却することによってアニールした。ＬＭＢと酸化グラフェンとをコンジュゲートさせるために、５００ｐｍｏｌのアニールされたＬＭＢを、１０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、Sigma-Aldrich社、米国）を含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ）中の１００μｇのカルボキシル化された酸化グラフェン（ＧＯ、Sigma-Aldrich社、米国）と混合した。この混合物を室温で３時間振盪した後に、１×ＰＢＳ及び０．０２％のニシン精子ＤＮＡ（ＨＳＤ、Sigma-Aldrich社、米国）溶液で洗浄した。洗浄手順を５回繰り返し、励起４８０ｎｍ／発光５２０ｎｍでの蛍光強度の測定によって各上清を確認した（図３）。得られた精製ＧＯ−ＬＭＢ−２１複合体を４℃で貯蔵した。癌との強い関連性のため、標的ｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ−２１を選択し（表１）、温度制御のためにサーモサイクラー（BioRad社、米国）を使用した。

ＲＮＡ鎖は、Bioneer社（韓国、テジョン広域市）から購入した。アミン官能化されたＤＮＡ鎖は、Genotech社（韓国、テジョン広域市）から購入し、ＬＮＡが組み込まれたＤＮＡ鎖は、Integrated DNA Technologies社（米国、アイオワ州）から購入した。

特に、ＬＭＢ−２１プローブは、ｍｉＲ−２１に相補的な配列を有するＦＡＭ標識された下側鎖と、該下側鎖より７ヌクレオチド短いアミン末端を有する上側鎖とから構成されていた（図２）。７ヌクレオチドの足がかり領域に単一のチミンＬＮＡを導入して、標的ｍｉＲＮＡに対する結合親和性を高めた。ＥＤＣカップリング化学を用いてアミン官能化されたＬＭＢ−２１をカルボキシル化されたＧＯとコンジュゲートさせることによって、ｍｉＲ−２１のためのＧＯ及びＬＭＢのコンジュゲート体（ＧＯ−ＬＭＢ−２１）を作製した。

実験例１：標的ｍｉＲＮＡによる標的核酸検出システムの活性化の確認
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、本発明のＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを含む標的核酸検出システムが標的ｍｉＲＮＡによって活性化されることを確認した。

特に、１０ｐｍｏｌのＬＭＢ−２１、１０ｐｍｏｌのｍｉＲ−２１／ＬＭＢ−２１＿Ｂ、２０ｐｍｏｌのＬＭＢ−２１及び２０ｐｍｏｌのｍｉＲ−１２２を、それぞれ１８％のネイティブポリアクリルアミドゲルのレーン１〜レーン４に加え、５μｇのＧＯ−ＬＭＢ−２１及びｍｉＲ−２１（０ｐｍｏｌ、２．５ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ及び２０ｐｍｏｌ）を、それぞれレーン５〜レーン９に加え、そして５μｇのＧＯ−ＬＭＢ−２１及び２０ｐｍｏｌのｍｉＲ−１２２をレーン１０に加えた後に、電気泳動を行った。

結果として、ｍｉＲ−２１と混合すると、ＧＯ−ＬＭＢ−２１は単一のバンドを示したが、ｍｉＲ−２１を有しないＧＯ−ＬＭＢ−２１は、そのバンドを示さなかった（図４Ａ）。これらの結果により、ＬＭＢ−２１はＧＯ表面上に化学的に結合されており、ｍｉＲ−２１はＧＯ−ＬＭＢ−２１においてＴＭＳＤを効果的に引き起こし、ｍｉＲ−２１／下側鎖の二重鎖を形成することが示された。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動のレーン６〜レーン９（５μｇのＧＯ−ＬＭＢ−２１及びｍｉＲ−２１（０ｐｍｏｌ、２．５ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ及び２０ｐｍｏｌ））の結果を、レーン２（ｍｉＲ−２１／ＬＭＢ−２１＿Ｂ １０ｐｍｏｌ）の結果と比較して分析した。結果として、ゲル電気泳動のバンド強度は、ｍｉＲ−２１の濃度に比例して増加した。これらの結果により、ｍｉＲ−２１／下側鎖の二重鎖の形成は、ｍｉＲ−２１の濃度に比例して増加することが示された（図４Ｂ）。

実験例２：標的ｍｉＲＮＡ濃度に応じた標的核酸検出システムの蛍光シグナルの分析
本発明のＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを含む核酸検出システムの検出性能が標的ｍｉＲＮＡの濃度に比例して増加したという実験例１の結果を補足するために、標的ｍｉＲＮＡの濃度に応じた標的核酸検出システムの蛍光シグナルを分析した。

ＧＯ−ＬＭＢ−２１の１２．５μｇ／ｍｌの溶液を１×ＰＢＳ中で調製し、広い範囲の濃度（０ｎＭ〜１００ｎＭ）のｍｉＲ−２１と混合した。ＬＭＢ−２１の下側鎖に標識されたフルオレセイン（ＦＡＭ）の蛍光強度をＦＲＥＴによって消光させた。マルチモードマイクロプレートリーダー（Biotek社、米国）を使用して、励起４８０ｎｍ／発光５２０ｎｍで、蛍光シグナルを測定した。

結果として、ｍｉＲ−２１を添加すると、新たに形成されたＦＡＭ標識された下側鎖／ｍｉＲ−２１の二重鎖が放出され、蛍光強度が徐々に回復した。蛍光強度はｍｉＲ−２１の濃度の増加に応じて増加し、２時間後に安定した（図５Ａ）。さらに、ＦＡＭの効果的な蛍光波長制御領域におけるｍｉＲ−２１の濃度に応じた蛍光シグナル強度を分析した。結果として、蛍光シグナル強度は、５２０ｎｍでｍｉＲ−２１の濃度に比例して増加した（図５Ｂ）。これらの結果により、標的核酸検出システムの蛍光シグナル強度は、標的ｍｉＲＮＡの濃度の増加に応じて増加することが示された。

実験例３：標的核酸検出システムの特異性の確認
標的核酸検出システムの標的ｍｉＲＮＡに対する配列特異性を確認するために、標的ｍｉＲＮＡを含む他のｍｉＲＮＡファミリーを使用した核酸検出を溶液中で実施した。

特に、標的核酸検出システムの蛍光シグナルは、ｍｉＲ−１２２、ｌｅｔ−７ａ及びスクランブルＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）をＧＯ−ＬＭＢ−２１と混合したことを除き、実験例２に記載されるのと同様に分析した。

結果として、ｍｉＲ−２１は、ＧＯ−ＬＭＢ−２１の蛍光の顕著な増加を引き起こしたのに対して、他のファミリーのｍｉＲＮＡは蛍光強度にほとんど変化を示さず、これはネガティブコントロールの変化と同様であった（図５Ｃ）。さらに、ＦＡＭの効果的な蛍光波長制御領域における蛍光シグナル強度を分析した。結果として、ＧＯ−ＬＭＢ−２１の蛍光シグナル強度は５２０ｎｍでｍｉＲ−２１により増加したが、他のファミリーのｍｉＲＮＡはＧＯ−ＬＭＢ−２１の蛍光シグナルに影響を及ぼさなかった（図５Ｄ）。これらの結果により、ＧＯ−ＬＭＢ−２１は標的ｍｉＲＮＡ配列を特異的に認識し、標的ｍｉＲＮＡ濃度に対応する定量的な蛍光シグナルを２時間で、高感度で生ずることが示された。

実験例４：標的核酸検出システムの感度の確認
本発明のＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを含む標的核酸検出システム並びに既存のＧＯベースのｍｉＲＮＡ検出システムの感度を確認するために、各システムの蛍光シグナル強度を分析した。

特に、０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の様々な濃度のｍｉＲ−２１を、１２．５μｇ／ｍｌのＧＯ−ＬＭＢ−２１の溶液と混合した。さらに、足がかり領域にＬＮＡを有しないＧＯ−ＭＢ−２１を使用して同じ実験を繰り返すことで、それぞれの場合の検出限界（ＬＯＤ）を分析した。

結果として、ＧＯ−ＬＭＢ−２１は、０ｎＭから２５ｎＭの間で蛍光の線形の増加を示し、検出限界は、方程式ＬＯＤ＝３．３（ＳＤ／Ｓ）
（ＳＤ＝標準偏差、Ｓ＝勾配）に従って１．３ｐＭであると求められた（図６Ａ）。

ＧＯ−ＭＢ−２１も、蛍光シグナル強度の時間依存的な増加を示し、ｍｉＲ−２１の存在下で高い選択性を示したが、蛍光シグナル強度の増加速度はＧＯ−ＬＭＢ−２１の増加速度よりもはるかに遅かった。０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の様々な濃度のｍｉＲ−２１では、ＧＯ−ＭＢ−２１は、より小さな蛍光強度の増加を示し、９９．３ｐＭのＬＯＤを示した（図６Ｂ）。したがって、本発明の標的核酸検出システムのＬＯＤは、従来のＧＯベースのｍｉＲＮＡ検出システムのＬＯＤよりもはるかに低かったことから、足がかり領域でのＬＮＡの導入は、標的との結合親和性の強化を圧倒的に助長すると共に、感度の増大に寄与することが示された。

上記実験とは別に、ＧＯ−ＬＭＢ及び従来のＧＯセンサーの蛍光シグナル強度を分析することで、ｓｓＤＮＡにコンジュゲートされた従来のＧＯセンサーの検出感度と比較した本発明のＧＯ−ＬＭＢの検出感度を確認した。

特に、ｍｉＲ−２１の濃度が０ｎＭ又は１００ｎＭである場合の蛍光シグナル強度を、標的ｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ−２１を用いてＧＯ−ＬＭＢ−２１及びＧＯ−ｃＤＮＡ−２１を使用して比較した。

結果として、ｍｉＲ−２１の濃度が１００ｎＭである場合に、ＧＯ−ＬＭＢ−２１の蛍光シグナル強度は、ＧＯ−ｃＤＮＡ−２１の蛍光シグナル強度よりもはるかに高かった（図７Ａ、図７Ｃ及び図７Ｄ）。ＧＯ−ＬＭＢ−２１はまた、時間に伴ってより高い蛍光シグナル強度を示した（図７Ｂ）。これらの結果により、蛍光試薬と結合された第１の一本鎖とＧＯに共有結合でコンジュゲートされた第２の一本鎖とを含む二重鎖を使用したＧＯセンサーは、従来の一本鎖のＧＯセンサーより高い感度を有することが示された。

実験例５：細胞溶解液における標的核酸検出システムの活性化の確認
蛍光シグナル強度を分析して、本発明のＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを含む標的核酸検出システムが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma-Aldrich社、米国）と混合することによって生物学的試料中でさえも標的ｍｉＲＮＡを検出することができることを確認した。

結果として、ｃＤＮＡプローブを使用した従来のＧＯセンサーの場合に、蛍光シグナルは、ＢＳＡ及びｃＤＮＡとＧＯとの競合的相互作用のためＢＳＡ濃度の増加と共に徐々に増加した。しかしながら、共有結合でコンジュゲートされたＧＯ−ＬＭＢセンサーは、生物学的試料中で蛍光応答にほとんど変化を示さなかった（図８Ａ）。

次に、本発明者らは、タンパク質に富んだ試料にスパイクされたｍｉＲ−２１を用いてＬＯＤ試験を実施した。結果として、ＧＯ−ＬＭＢ−２１は、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下で２．２５ｐＭの同等のＬＯＤで、ｍｉＲ−２１濃度の増加に応じた定量的な蛍光強度の増加を示した（図８Ｂ及び図８Ｃ）。この低いＬＯＤにより、ＧＯ−ＬＭＢは、タンパク質に富んだ試料中でさえも明らかな検知性能の損失を伴わずに検知能力を維持することができることが実証された。

実際の試料でのそのような実験の精度を確認するために、本発明者らは、ＨｅｐＧ２溶解液（１００００個の細胞／ウェル）中のスパイクされたｍｉＲ−２１の定量を更に実施した。結果として、一連のスパイクされたｍｉＲ−２１濃度（０ｎＭ〜１ｎＭ）から標準曲線が導き出された。さらに、５００ｐＭのスパイクされたｍｉＲ−２１を上記システムに別々に加えると、得られた蛍光強度は、標準曲線から推定された値と優れた一致を見せることが判明した（図９）。

実験例６：蛍光シグナルの多様化による標的核酸検出システムの多重標的核酸検出の確認
本発明の標的核酸検出システムによって複数の標的を同時に検出し得ることを確認するために、様々な蛍光材料を使用して検出実験を行った。

特に、この実験のために、乳癌についての代表的なｍｉＲＮＡバイオマーカーであるｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２５ｂ及びｌｅｔ−７ａを選択した（表２）。ｍｉＲ−２１を標的とするＬＭＢプローブをＦＡＭで標識し、ｍｉＲ−１２５ｂを標的とするＬＭＢプローブをシアニン５（Ｃｙ５）で標識し、ｌｅｔ−７ａを標的とするＬＭＢプローブを６−カルボキシル−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）で標識した。これらは、それぞれ４８０ｎｍ、６１９ｎｍ及び５６４ｎｍでの励起により、それぞれ５２０ｎｍ（緑色）、６６５ｎｍ（赤色）及び６０５ｎｍ（橙色）で発光極大を示した。ＦＡＭ−ＬＭＢ−２１、Ｃｙ５−ＬＭＢ−１２５ｂ及びＲＯＸ−ＬＭＢ−７ａである３種類のＬＭＢとＧＯをコンジュゲートさせた後に、このコンジュゲート体をＨＳＤ溶液で精製することによって、ＧＯ−ＬＭＢ−２１／１２５ｂ／７ａと称される多重センサーを作製した。多重検出のために、ＧＯ−ＬＭＢ−２１／１２５ｂ／７ａを、各標的ｍｉＲＮＡ（１００ｎＭ）又は標的ｍｉＲＮＡの様々な組み合わせと単純に混合した。

その結果、各ターゲットｍｉＲＮＡとのＴＳＭＤ反応によって放出される緑、赤、オレンジの蛍光発光スペクトルが得られ、対応する各ｍｉＲＮＡターゲットを含むサンプルでのみ、その画像が得られた(図１０Ａ、Ｂ、及びＣ)。

上記結果から、本発明の標的核酸検出システムは、複数の標的核酸を同時に検出することができることが確認された。それというのも、本発明の標的核酸検出システムは複数の蛍光シグナルを使用し、シグナル間での干渉がないため、ｍｉＲＮＡに基づく疾患の診断のために効果的に使用することができるからである。

Claims (15)

1. ＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを含む核酸検出用の組成物であって、前記分子ビーコンは、標的核酸結合配列を含む第１の一本鎖と、少なくとも部分的に酸化グラフェンと結合された第２の一本鎖とを相補的にコンジュゲートさせることによって形成されており、前記第１の一本鎖は、前記標的核酸の存在下で前記第２の一本鎖から分離され、前記標的核酸に結合される、核酸検出用の組成物。
2. 前記分子ビーコンの前記第１の一本鎖は、蛍光試薬と結合されている、請求項１に記載の核酸検出用の組成物。
3. 前記蛍光試薬は、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、テキサスレッド、フルオレセイン、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン）、フルオレセインクロロトリアジニル、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＲＯＸ（６−カルボキシル−Ｘ−ローダミン）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、ＮＥＤ（Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン）、シアニンベースの色素、及びチアジカルボシアニンからなる群から選択される１つ以上の試薬である、請求項２に記載の核酸検出用の組成物。
4. 酸化グラフェンに一度に２つ以上の分子ビーコンが結合されており、このときに各分子ビーコンの前記第１の一本鎖には異なる蛍光試薬が結合されている、請求項２に記載の核酸検出用の組成物。
5. 前記分子ビーコンの前記第２の一本鎖は、酸化グラフェンに共有結合でコンジュゲートされている、請求項１に記載の核酸検出用の組成物。
6. 前記分子ビーコンの前記第２の一本鎖のアミン基は、酸化グラフェンのカルボキシル基に共有結合でコンジュゲートされている、請求項５に記載の核酸検出用の組成物。
7. 前記蛍光試薬は、前記第１の一本鎖に結合されており、前記第２の一本鎖のアミン基と同じ方向に向けられている、請求項２に記載の核酸検出用の組成物。
8. 前記蛍光試薬は、酸化グラフェンから３ｎｍ〜５ｎｍの距離に存在する、請求項２に記載の核酸検出用の組成物。
9. 前記標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡを含む、請求項１に記載の核酸検出用の組成物。
10. 前記酸化グラフェンは、１０ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有する粒子の形で存在する、請求項１に記載の核酸検出用の組成物。
11. 細胞溶解液中で活性化される、請求項１に記載の核酸検出用の組成物。
12. 標的核酸結合配列を含む第１の一本鎖と、少なくとも部分的に酸化グラフェンと結合された第２の一本鎖とを相補的にコンジュゲートさせることによって分子ビーコンが形成される核酸検出方法であって、以下の工程：
    ＬＮＡ含有分子ビーコンと酸化グラフェンとを共有結合でコンジュゲートさせる工程と、
    前記工程で得られた核酸検出用の組成物と前記標的核酸を含む試料とを混合することによって混合物を得る工程と、
    前記混合物中で前記標的核酸を検出する工程と、
    を含む、核酸検出方法。
13. 前記組成物に蛍光試薬を添加する工程を更に含む、請求項１２に記載の核酸検出方法。
14. ＬＮＡ含有分子ビーコン及び酸化グラフェンを含む組成物を有する核酸検出用のキットであって、前記分子ビーコンは、標的核酸結合配列を含む第１の一本鎖と、少なくとも部分的に酸化グラフェンと結合された第２の一本鎖とを相補的にコンジュゲートさせることによって形成されており、前記第１の一本鎖は、前記標的核酸の存在下で前記第２の一本鎖から分離され、前記標的核酸に結合される、核酸検出用のキット。
15. 前記分子ビーコンの前記第１の一本鎖は、蛍光試薬と結合されている、請求項１４に記載の核酸検出用のキット。

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