KR102384471B1 - Lna 프로브와 산화그래핀의 복합체 및 이를 이용한 핵산 검출 방법 - Google Patents

Lna 프로브와 산화그래핀의 복합체 및 이를 이용한 핵산 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 LNA 프로브와 산화그래핀의 복합체 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물, 키트 및 검출 방법은 LNA를 포함하는 분자비콘이 산화그래핀과 공유결합을 통해 접합하고, 분자비콘의 단일가닥이 표적 핵산과 결합하여 복합체를 형성하며, 그 복합체가 산화그래핀으로부터 분리되어 나와 형광 신호를 유도할 수 있는바, 분자비콘과 산화그래핀을 공유결합으로 접합시켜 비특이적 신호를 최소화시킬 수 있고, LNA를 첨가한 분자비콘을 이중가닥으로 디자인하여 매우 낮은 농도의 표적 핵산을 고민감도로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 형광 신호의 다양화를 통해 다수의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있어, 본 발명을 통해 독성 질환 및 질환 진행에 따라 특이적으로 발현량이 변화하는 핵산 바이오마커를 쉽고 정확하게 검출할 수 있다.

Description

LNA 프로브와 산화그래핀의 복합체 및 이를 이용한 핵산 검출 방법 {Complex of LNA probe and graphene oxide and nucleic acid detection method using same}
본 발명은 LNA 프로브와 산화그래핀의 복합체 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
MicroRNAs(miRNAs)는 RNA silencing과 유전자 발현의 전사 후 조절(post-transcriptional regulation)에 관여하는 17-25 뉴클레오티드의 non-coding RNA로서 수많은 연구들을 통해 세포 증식, 분화, 혈관 신생, 세포 사멸 등의 다양한 생물학적 반응에서 결정적인 역할을 하는 것이 확인되었다. 이들의 비정상적인 발현은 암, 바이러스감염, 면역질환 및 신경변성장애와 같은 다양한 심각한 질병과 관련되어 있다. 예를 들어 종양유발기능이 있음이 알려진 miRNA-21은 유방암, 췌장암 및 간세포 암종과 같은 다양한 종류의 악성종양에서 지속적으로 과발현된다. 2008년에 암 이종이식 마우스의 혈청과 혈장에서 높은 안정성을 가진 종양유래의 일부 miRNA가 발견되었다. 종양특이 miRNA는 환자의 임상샘플에서도 검출되어 miRNA는 유망한 비침습적인 바이오마커로 주목받고 있다.
일반적으로, 종래에는 실시간 PCR 및 miRNA 마이크로어레이 방법이 miRNA의 정량적 검출을 위해 이용되어 왔다. 그러나 복잡한 절차, 비싼 시약과 도구로 인해 실제 임상적용에 한계가 있었고 이러한 방법들로는 miRNA의 유용한 검출 결과를 얻을 수 없었다. 이 문제를 해결하기 위해서 간단하고 빠른 검출 플랫폼을 구축하기 위한 기술적 및 과학적 시도가 많이 있었다. 형광, 비색계, 표면플라스몬공명 및 전기화학적 방법과 정교한 신호 증폭 방법을 조합한 다양한 기술에 기초한 많은 miRNA 검출 시스템이 최근 수십 년 동안 제안되어 왔다. 그 중에서도 나노 물질을 기반으로 하는 miRNA 검출 및 분석 방법이 상당한 주목을 받아 발전되었다.
이에 본 발명자들은, 산화그래핀(GO)-DNA 복합체를 사용하여 miRNA 검출을 위한 다용도의, 실용적인 플랫폼을 발전시켰다. 산화그래핀은 저렴하고 대용량으로 합성 가능한 나노 물질로 친수성인 부분과 소수성인 부분을 모두 가지고 있으며, 높은 열 전도도 및 전기 전도도의 특성을 유지하고 있기 때문에 다양한 바이오센서 응용에 사용되고 있다. 특히, 산화그래핀은 효율적인 형광 퀀칭(quenching) 능력 및 높은 프로브-로딩(loading) 능력을 갖기 때문에 형광 핵산 감지 시스템에 많이 이용되었다. 바이오센서에서 산화그래핀은 일반적으로 pi-pi 스태킹(stacking)이나 수소결합 상호작용을 통해 단일 가닥 핵산 (ssNAs)에 대한 강한 친화성을 나타내며, 따라서 ssNAs의 고효율 분리를 위한 물질로서의 역할을 했으나, 상기 복합체는 단백질, 핵산 및 지방 등 다양한 경쟁 생체 분자와 반응하여 비특이적 신호를 유발하는 등의 문제점을 드러냈다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 새로운 표적 핵산 검출 시스템을 개발하던 중, TMSD(toehold-mediated strand displacement) 원리를 기반으로 하여 LNA(locked nucleic acid)를 포함하는 분자비콘과 산화그래핀을 이용한 표적 핵산 검출 시스템을 개발하였다.
TMSD는 효소의 도움 없이 DNA 또는 RNA 한 가닥을 다른 가닥과 교환하는 분자 도구이고, Watson-Crick 염기쌍(A-T/U 및 C-G)을 통한 DNA 또는 RNA의 2개의 상보적 가닥의 혼성화를 기반으로 하며 가지 이동(branch migration)이라는 프로세스를 사용한다. TMSD는 원본 가닥과 보호 가닥으로 구성된 이중 가닥 DNA 복합체로 시작한다. 원본 가닥은 소위 "toehold"의 돌출 영역을 가지며, 이 영역은 침입 가닥으로 지칭되는 제 3의 DNA 또는 RNA 가닥에 상보적이다. 원본 가닥의 toehold 영역은 상보적인 침입 가닥과 혼성화하여 3개의 핵산 가닥으로 구성된 복합체를 만들어 TMSD 과정을 진행한다. 그 결과 원본 가닥과 침입 가닥은 결합하여 이중 가닥을 형성하게 되고, 본래 원본 가닥과 결합하고 있던 보호 가닥은 떨어져 나가게 된다.
LNA는 RNA 유사체로, 리보스 고리가 "locked" 되어 있어 Watson-Crick 결합에 이상적인 구조이다. LNA 뉴클레오티드는 기존의 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드에 비해 상보적 가닥과의 높은 결합력을 보유하여 결과적으로 상보적 가닥과 결합할 때 높은 온도에서도 안정성을 가진다. 그 결과 LNA 뉴클레오티드는 높은 민감도와 특이도를 나타내며, 단일 염기 차이를 검출하는데도 용이하다.
이를 바탕으로, 본 발명자들은 LNA를 포함하는 분자비콘과 산화그래핀을 이용하면 LNA를 포함하는 분자비콘의 단일가닥이 표적 핵산과 결합하여 복합체를 형성하고, 그 복합체가 산화그래핀으로부터 분리되어 나와 형광 신호를 유도할 수 있는바, 매우 낮은 농도의 표적 핵산을 고민감도로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 형광 신호의 다양화를 통해 다수의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 LNA(locked nucleic acid)를 활용하여 낮은 농도의 표적 핵산을 인식함으로써 고민감도의 표적 핵산 검출이 가능하고, 형광 신호의 파장 다양화를 통해 다수의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있는 표적 핵산 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 표적 핵산의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
LNA를 포함하는 분자비콘(LNA-containing molecular beacon) 및 산화그래핀을 포함하고,
상기 분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 산화그래핀과 접합하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것이되,
표적 핵산 존재하에 상기 제1 단일가닥은 제2 단일가닥으로부터 분리되고 표적 핵산과 결합하는 것인, 핵산 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LNA를 포함하는 분자비콘(LNA-containing molecular beacon)과 산화그래핀을 공유결합으로 접합하는 단계;
상기 단계로 얻은 핵산 검출용 조성물과 표적 핵산을 포함하는 시료를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계; 및
상기 혼합물에서 표적 핵산을 검출하는 단계;
를 포함하는, 핵산의 검출 방법이되,
상기 분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 산화그래핀과 접합하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것인, 핵산의 검출 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 LNA를 포함하는 분자비콘(LNA-containing molecular beacon) 및 산화그래핀을 포함하는 조성물을 포함하는 키트이되,
상기 분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 산화그래핀과 접합하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것이고,
표적 핵산 존재하에 상기 제1 단일가닥은 제2 단일가닥으로부터 분리되고 표적 핵산과 결합하는 것인, 핵산 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물, 키트 및 검출 방법은 LNA를 포함하는 분자비콘이 산화그래핀과 공유결합을 통해 접합하고, 분자비콘의 단일가닥이 표적 핵산과 결합하여 복합체를 형성하며, 그 복합체가 산화그래핀으로부터 분리되어 나와 형광 신호를 유도할 수 있는바, 분자비콘과 산화그래핀을 공유결합으로 접합시켜 비특이적 신호를 최소화시킬 수 있고, LNA를 첨가한 분자비콘을 이중가닥으로 디자인하여 매우 낮은 농도의 표적 핵산을 고민감도로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 형광 신호의 다양화를 통해 다수의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있어, 본 발명을 통해 독성 질환 및 질환 진행에 따라 특이적으로 발현량이 변화하는 핵산 바이오마커를 쉽고 정확하게 검출할 수 있다.
도 1은 GO-LMB 복합체를 이용하여 miRNA를 검출하는 방법의 개요를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 사용된 표적(miR-21)의 DNA 서열과 분자비콘(LMB-21)의 DNA 서열을 나타낸 도이다.
도 3은 LMB와 GO를 혼합한 혼합물을 1X PBS 및 0.02 %의 HSD 용액으로 세척하였을 때, 세척 횟수에 따른 형광 신호의 세기를 나타낸 그래프이다.
도 4는 GO-LMB-21이 표적(miR-21)과 화학적으로 반응하고 표적(miR-21)의 농도에 비례하여 겔 전기영동의 신호 세기가 강해지는 것을 나타낸 도이다.
도 4a는 GO-LMB가 포함되지 않은 대조군과 비교하여 GO-LMB가 포함된 경우 표적(miR-21)의 농도에 따른 겔 전기영동의 신호 세기를 나타낸 도이다.
도 4b는 표적(miR-21)의 농도에 비례하여 겔 전기영동의 신호 세기가 강해지는 것을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 사용된 표적(miR-21)의 농도에 따른 형광 신호의 세기를 나타낸 도이다.
도 5a는 표적(miR-21)의 농도를 다양화하여 시간에 따른 형광 신호의 세기를 나타낸 그래프이다.
도 5b는 표적(miR-21)의 농도에 따른 형광 신호의 세기를 파장으로 나타낸 그래프이다.
도 5c는 각각의 miRNA 별로 형광 신호의 세기가 향상된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5d는 각각의 miRNA 별로 형광 신호의 세기가 향상된 정도를 파장으로 나타낸 그래프이다.
도 6은 GO-MB와 비교하여 GO-LMB의 검출한계를 분석한 도이다.
도 6a는 표적(miR-21)의 농도에 따른 GO-LMB의 형광 신호의 세기가 향상된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 표적(miR-21)의 농도에 따른 GO-MB의 형광 신호의 세기가 향상된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 miR-21의 존재 하에 LNA를 포함하는 GO-LMB-21과 단일가닥을 이용한 GO-cDNA-21의 형광 신호 세기를 분석한 도이다.
도 7a는 miR-21이 0 또는 100 nM 존재할 경우 GO-LMB-21 및 GO-cDNA-21의 형광 신호 세기를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 miR-21의 농도 및 시간에 따른 GO-LMB-21 및 GO-cDNA-21의 형광 신호 세기를 나타낸 그래프이다.
도 7c는 miR-21이 0 또는 100 nM 존재할 경우 GO-LMB-21의 형광 신호 세기를 파장으로 나타낸 그래프이다.
도 7d는 miR-21이 0 또는 100 nM 존재할 경우 GO-cDNA-21의 형광 신호 세기를 파장으로 나타낸 그래프이다.
도 8은 세포 용해물에서도 GO-LMB-21가 높은 민감도를 나타내는지 확인하는 도이다.
도 8a는 BSA의 농도에 따라 기존의 GO 센서와 GO-LMB-21의 F/FO 값을 나타낸 그래프이다.
도 8b는 100 ㎍/ml의 BSA 존재하에 miR-21의 농도에 따른 형광 신호의 세기를 나타낸 그래프이다.
도 8c는 100 ㎍/ml의 BSA 존재하에 miR-21의 농도에 따른 형광 신호의 세기를 파장으로 나타낸 그래프이다.
도 9는 HepG2 세포 용해물(10,000 세포/웰)에서 스파이크된 miR-21의 농도 대비 형광 신호 세기를 나타낸 선형 표준 곡선이다.
도 10은 형광 신호의 파장을 다양화하여 다수의 표적 핵산을 동시에 검출한 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 10a는 적어도 하나 이상의 표적 miRNA를 각각 100nM 씩 넣어 섞은 다양한 혼합물에 GO-LMB-21/125b/7a를 처리하여 동시에 각각의 표적 miRNA가 검출되는 것을 파장으로 나타낸 그래프이다.
도 10b는 적어도 하나 이상의 표적 miRNA를 각각 100nM 씩 넣어 섞은 다양한 혼합물에 GO-LMB-21/125b/7a를 처리하여 동시에 각각의 표적 miRNA가 검출되는 것을 형광 이미지로 나타낸 도이다.
도 10c는 적어도 하나 이상의 표적 miRNA를 각각 100nM 씩 넣어 섞은 다양한 혼합물에 GO-LMB-21/125b/7a를 처리하여 동시에 각각의 표적 miRNA가 검출되는 것에 대해 형광 신호의 세기 정도를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 LNA를 포함하는 분자비콘(LNA-containing molecular beacon) 및 산화그래핀을 포함하고,
상기 분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 산화그래핀과 접합하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것이되,
표적 핵산 존재하에 상기 제1 단일가닥은 제2 단일가닥으로부터 분리되고 표적 핵산과 결합하는 것인, 핵산 검출용 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 표적 핵산 결합서열이란 표적 핵산이 갖는 서열과 적어도 일부분이 상보적인 결합이 가능한 서열인 것으로 이해될 수 있고, 상기 표적 핵산 결합서열과 표적 핵산의 상보적 결합을 통하여 상기 제1 단일가닥은 표적 핵산과 결합하고, 상기 제2 단일가닥은 분리되는 것으로 이해될 수 있다.
또한, 상기 표적 핵산 결합서열에 상보적인 서열이란 상기 제1 단일가닥의 표적 핵산 결합서열과 적어도 일부분의 상보적 결합이 형성될 수 있는 서열을 말한다.
본 발명의 일 측면에서, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 상기 제1 단일가닥과 제2 단일가닥은 각각 독립적으로 10 내지 30 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다.
또한, 상기 제1 단일가닥의 적어도 일부분은 상기 제2 단일가닥의 적어도 일부분에 상보적이고, 예를 들어 15 내지 25 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스(duplex)를 가질 수 있다.
나아가, 상기 제1 단일가닥의 표적 핵산 결합서열은 상보적 염기 결합을 통해 표적 핵산에 결합할 수 있는 서열로서, 예를 들어 20 내지 25 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 표적 핵산 결합서열은 표적 핵산의 서열에 상보적인 서열로 디자인되는 것일 수 있으며, 표적 핵산과의 결합력에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 일부 염기가 치환, 결실 또는 추가된 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 LNA를 포함하는 분자비콘(LMB)의 각 가닥은 예를 들어 15 내지 30 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 바람직하게 제1 단일가닥은 15 내지 25 뉴클레오티드일 수 있고, 제2 단일가닥은 10 내지 20 뉴클레오티드일 수 있다.
또한, LNA를 포함하는 분자비콘(LMB)의 제1 단일가닥의 적어도 일부분은 제2 단일가닥의 적어도 일부분에 상보적일 수 있고, 분자는 10 내지 30 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 가질 수 있고, 바람직하게는 15 내지 20 뉴클레오티드일 수 있다.
나아가, 상기 LNA를 포함하는 분자비콘(LMB)은 제1 단일가닥의 3' 오버행(overhang)을 포함하는 하나 이상의 3' 오버행(overhang)을 가질 수 있으며, 상기 오버행(overhang)은 5 내지 20 뉴클레오티드의 길이일 수 있고, 바람직하게 상기 오버행(overhang)은 7 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 표적 핵산은 LNA를 포함하는 분자비콘의 제1 단일가닥과 적어도 일부가 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 RNA를 포함하는 것으로 이해될 수 있고, 예를 들어, 시료 내에 표적 핵산인 DNA 또는 RNA가 존재할 경우 이에 상보적인 서열을 가진 상기 분자비콘의 제1 단일가닥이 상기 DNA 또는 RNA와 혼성화됨으로써 이중 가닥 핵산이 되고, 이 혼성체가 산화그래핀으로부터 유리됨에 따라, 제1 단일가닥에 부착된 형광 물질이 형광 신호를 나타내어 시료 내에 존재하는 상기 표적 핵산 DNA 또는 RNA를 검출할 수 있다.
여기서, 상기 표적 핵산 DNA는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 단백질을 코딩하지 않는 DNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 RNA는 mRNA(messenger RNA), tRNA(transfer RNA), rRNA(ribosomal RNA), sRNA(small RNA), snRNA(small nuclear RNA), scRNA(small cytoplasmic RNA), siRNA(small interfering RNA), 또는 miRNA(microRNA)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 RNA는 단백질로 번역되는 RNA, 단백질로 번역되지 않는 RNA, 5'-비번역 부위, 3'-비번역 부위, 또는 조절 RNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 RNA는 miRNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 miRNA는 생체 내 생물학적 기능에 관여하는 것일 수 있으며, 유방암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암, 대장암, 골암, 피부암, 혈액암, 당뇨, 또는 알츠하이머 등의 각종 질병의 진단, 치료, 또는 예후 판단에서 중요한 바이오마커로 사용되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 miRNA는 줄기 세포에서 계통 특이적 분화(lineage specific differentiation)에 관여하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 miRNA는 miRNA-21, miRNA-125b 또는 let 7a를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 miRNA-21, 상기 miRNA-125b 또는 상기 let 7a는 인간 세포에서 발현되는 miRNA인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 miRNA-21, 상기 miRNA-125b 및 상기 let 7a는 유방암 세포에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 miRNA-21, 상기 miRNA-125b, 또는 상기 let 7a는 모델질병 세포주인 유방암 세포주 MDA-MB-231, MDA-MB435, 또는 MCF-7; 또는 기타 암세포 등에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 표적 핵산은 miR-21이고, U AGC UUA UCA GAC UGA UGU UGA의 서열(서열번호 1)을 갖는 것일 수 있고, 상기 제1 단일가닥은 5'- TCA GAC TGA TGT TGA -NH2 (3')(서열번호 2)일 수 있고, 상기 제2 단일가닥은 5'- TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A -3'(서열번호 3)일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 핵산 검출용 조성물은 상기 분자비콘의 제2 단일가닥이 산화그래핀과 공유결합으로 접합할 수 있고, 구체적으로는 상기 분자비콘의 제2 단일가닥의 아민기가 산화그래핀의 카복실기와 공유결합으로 접합할 수 있으나, 상기 작용기에 제한되지 않을 수 있다. 상기 아민기는 산화그래핀과 공유 결합(covalent conjugation)을 통해 접합되어 있으며, 제1 단일가닥에 부착된 하기 형광 시약과 동일 방향을 향할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 핵산 검출용 조성물은 상기 분자비콘의 제1 단일가닥에 형광 시약을 부착할 수 있다.
예를 들어, 상기 형광 시약은 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 여기서 상기 형광 시약은, 제1 단일가닥이 산화그래핀으로부터 유리됨으로써 형광을 나타낼 수 있는 것이라면 제한 없이 본 발명에 포함되나, 예를 들어, FAM, Cy5 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 핵산 검출용 조성물은 2 이상의 상기 분자비콘을 한번에 산화그래핀에 접합하되, 상기 분자비콘의 제1 단일가닥에 각기 다른 형광 시약을 부착하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 핵산 검출용 조성물은 3 종의 상기 분자비콘을 한번에 산화그래핀에 접합하되, 상기 분자비콘의 제1 단일가닥에 각기 다른 형광 시약을 부착하는 것일 수 있다. 여기서 상기 형광 시약은 제1 단일가닥이 산화그래핀으로부터 유리됨으로써 형광을 나타낼 수 있는 것이라면 제한 없이 본 발명에 포함되나, 예를 들어 FAM, Cy5 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 3종의 형광 시약을 동시에 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 산화그래핀은 약 10 nm 내지 약 1 μm의 크기를 가지는 입자 형태를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 산화그래핀은 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 700 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 400 nm, 약 10 nm 내지 약 300 nm, 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 500 nm 내지 약 1 μm, 약 700 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 400 nm 이하인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 산화그래핀은 작은 크기 때문에 표면에 흡착된 상기 제2 단일가닥과 함께 세포막을 용이하게 통과하여 세포 내로 들어갈 수 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 단일층의 시트 형태인 상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태가 아닌 산화그래핀에 비하여 동일한 질량에서 표면적이 넓어 적은 양으로도 많은 핵산 프로브를 흡착할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 산화그래핀은 제2 단일가닥와의 공유결합을 통해 접합되어 있으며, 구체적으로는 산화그래핀의 카복실기는 제2 단일가닥의 아민기와의 공유결합을 통해 접합될 수 있으나, 상기 작용기에 제한되지 않을 수 있다. 표적 핵산이 존재하지 않을 경우 제1 단일가닥의 형광 시약이 산화그래핀에 근접하게 위치하여 형광 신호가 소광될 수 있고, 구체적으로는 산화그래핀과 형광시약의 거리는 형광 신호가 소광되는 충분한 거리 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 산화그래핀과 형광시약은 5nm 이하의 거리 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 산화그래핀과 형광시약은 3nm 이하의 거리 내에 존재할 수 있다. 반면, 상기 제1 단일가닥은 산화그래핀과의 공유결합을 이루지 않으므로 표적 핵산과 상보적으로 결합함으로써 상기 제2 단일가닥 및 산화그래핀과 완전히 분리되어 형광 신호를 회복할 수 있다. 상기 제1 단일가닥과 제2 단일가닥이 서열 특이적으로 분리되는 경우를 제외하고는, 제1 단일가닥이 산화그래핀으로부터 떨어지지 않으므로 비특이적 신호가 나타나지 않을 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 표적 물질인 핵산은 세포 내에 존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 기질에 고정되어 배양되고 있는 세포, 배지 내에 부유하며 배양되고 있는 세포, 생체 내의 세포, 생체에서 분리된 세포, 또는 분석을 위해 처리된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 포함할 수 있으며, 고정액에 의해 고정된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
또한, 본 발명은 LNA를 포함하는 분자비콘(LNA-containing molecular beacon)과 산화그래핀을 공유결합으로 접합하는 단계;
상기 단계로 얻은 핵산 검출용 조성물과 표적 핵산을 포함하는 시료를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계; 및
상기 혼합물에서 표적 핵산을 검출하는 단계;
를 포함하는, 핵산의 검출 방법이되,
상기 분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 산화그래핀과 접합하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것인, 핵산의 검출 방법을 제공한다.
이하, 핵산의 검출 방법을 단계별로 상세히 설명한다.
상기 LNA를 포함하는 분자비콘(LNA-containing molecular beacon)과 산화그래핀을 공유결합으로 접합하는 단계는, 상기 분자비콘의 아민기와 산화그래핀의 카복실기가 공유 접합(covalent conjugation)을 통해 접합되는 단계로 이해될 수 있으나, 상기 작용기에 제한되지 않을 수 있다.
상기 조성물과 표적 핵산을 포함하는 시료를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계는, LNA를 포함하는 분자비콘의 제1 단일가닥과 상기 표적 핵산이 결합되어 복합체가 산화그래핀으로부터 유리되는 단계로 이해될 수 있다.
여기서, 상기 제1 단일가닥은 TMSD(toehold-mediated strand displacement) 반응을 통해, 표적 핵산과 적어도 일부분의 상보적 서열을 갖는 것으로부터 혼성화되어 혼성체가 산화그래핀으로부터 유리되는 것으로 이해될 수 있다.
상기 혼합물에서 표적 핵산을 검출하는 단계는 제1 단일결합과 표적 핵산이 결합하여 산화그래핀으로부터 유리된 후 제1 단일결합에 부착된 형광 물질의 형광 신호가 되돌아옴으로써, 해당 형광 신호를 형광 검출기를 통해 검출하는 단계로 이해될 수 있다.
여기서, 2 이상의 형광 물질을 사용하여 2 이상의 형광 신호를 형광 검출기를 통해 탐지하여 2 이상의 표적 핵산을 동시에 검출하는 단계로 이해될 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 핵산의 검출 방법은 상기 조성물에 형광 시약을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
여기서 상기 형광 시약은 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 여기서 상기 형광 시약은, 제1 단일가닥이 산화그래핀으로부터 유리됨으로써 형광을 나타낼 수 있는 것이라면 제한 없이 본 발명에 포함되나, 예를 들어, FAM, Cy5 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 각 단계의 세부적인 조건 단계의 순서 등과 같이 이 분야 기술자에게 자명한 변경과 수정 역시 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
나아가, 본 발명은 LNA를 포함하는 분자비콘(LNA-containing molecular beacon) 및 산화그래핀을 포함하는 조성물을 포함하는 키트이되,
상기 분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 산화그래핀과 접합하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것이고,
표적 핵산 존재하에 상기 제1 단일가닥은 제2 단일가닥으로부터 분리되고 표적 핵산과 결합하는 것인, 핵산 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 키트는 상기 부자비콘의 제1 단일가닥에 형광 시약을 부착하는 것일 수 있다. 여기서 상기 형광 시약은, FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 여기서 상기 형광 시약은, 제1 단일가닥이 산화그래핀으로부터 유리됨으로써 형광을 나타낼 수 있는 것이라면 제한 없이 본 발명에 포함되나, 예를 들어, FAM, Cy5 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물, 키트 및 검출 방법은 LNA를 포함하는 분자비콘의 제1 단일가닥이 제2 단일가닥과 상보적 결합을 하고 그 과정에서 제1 단일가닥에 부착된 형광 시약은 소광되어 있으나, LNA를 포함하는 제1 단일가닥의 toehold 영역과 표적 핵산의 TMSD(toehold-mediated strand displacement) 반응을 통해 표적 핵산과 결합하여 복합체를 형성하고(도 1 및 2 참조), 그 복합체가 산화그래핀 및 분자비콘의 제2 단일가닥으로부터 분리되어 나와 산화그래핀으로 인해 소광되었던 형광 신호를 회복할 수 있는바, 해당 형광 신호는 표적 핵산의 농도에 비례하여 표적 핵산의 농도가 높을수록 더 강한 형광 신호를 나타내고(도 4a 및 b 참조), 시간에 따라 형광 신호의 세기는 증가하나 일정 시간 이후에는 형광 신호가 안정화되며(도 5a 및 b 참조), toehold 영역의 LNA의 강한 결합력으로 인해 표적 핵산만을 특이적으로 검출할 수 있고(도 5c 및 d 참조), pM 단위 정도의 매우 낮은 농도의 표적 핵산을 고민감도로 정확하게 검출할 수 있을 뿐 아니라(도 6a 및 b 참조), 기존의 GO를 기반으로 한 센서와 비교했을 때, 훨씬 높은 검출 능력을 가질 뿐더러(도 7a, b 및 c 참조), 세포 용해물에서도 상기 기술한 높은 특이도 및 민감도가 낮아지지 않는 것을 확인할 수 있다(도 8a, b 및 c 참조).
또한, 하나의 산화그래핀에 각기 다른 종류의 핵산을 검출하는 여러 종류의 이중분자비콘을 접합하고, 각각의 분자비콘에 각기 다른 형광 시약을 부착하여 형광 신호를 다양화시킴으로써, 다수의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있어(도 10a, b 및 c 참조), 본 발명을 통해 독성 질환 및 질환 진행에 따라 특이적으로 발현량이 변화하는 핵산 바이오마커를 쉽고 정확하게 검출할 수 있고, 비임상연구에 본 발명과 같은 나노센서를 적용하여 miRNA를 통한 독성평가에 응용함으로써 기존연구와의 시너지 효과를 낼 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 표적 핵산 검출 시스템 제조
표적 핵산 검출 시스템으로서 LNA를 포함하는 분자비콘(LMB)을 준비하기 위해 100 μM의 아민 작용기화된 상부 가닥 DNA(10 ㎕)를 1X PBS(phosphate-buffered saline)에서 같은 양의 FAM 표지된 하부 가닥 DNA와 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 90 ℃에서 5분간 가열하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 서서히 냉각시킴으로써 어닐링(annealing)시켰다. 그 다음, LMB와 산화그래핀을 접합하기 위해 500 pmol의 어닐링된 LMB를 10 mM의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC, Sigma-Aldrich, USA)를 포함한 1X PBS(pH 7.2, NaCl 137 mM 및 KCl 2.7 mM)에서 100 ㎍의 카르복실화된 산화그래핀(GO, Sigma-Aldrich, USA)과 혼합하였다. 그 혼합물은 실온에서 3시간 동안 진탕한 후, 1X PBS 및 0.02 %의 herring sperm DNA(HSD, Sigma-Aldrich, USA) 용액으로 세척하였다. 세척 과정은 5회 반복하였고, 각 상청액은 ex480/em520 nm에서 형광 강도를 측정하여 확인하였다(도 3). 그 정제된 GO-LMB-21 복합체는 4 ℃에 저장되었다. 표적 miRNA로는 암과의 강한 관련성 때문에 miR-21를 선택하였고(표 1), 온도 조절에는 thermocycler(BioRad, USA)를 사용하였다.
miR-21 및 LMB-21의 이중가닥의 염기서열
핵산 가닥 서열(5'→3')
표적 RNA miR-21 U AGC UUA UCA GAC UGA UGU UGA
LMB-21 상단 가닥 TCA GAC TGA TGT TGA -NH2
하단 가닥 FAM- TCA ACA TCA GTC TGA TAA GC T A
RNA 서열은 Bioneer(Daejon, Korea)에서, 아민 작용기화된 DNA 서열은 Genotech(Daejon, Korea)에서, 그리고 LNA-embedded DNA 서열은 Integrated DNA Technologies(IA, USA)에서 구입하였다.
구체적으로, LMB-21 프로브는 miR-21과 상보적인 서열을 갖는 FAM 표지된 하부 가닥과, 하부 가닥보다 7-nt 짧은 아민 말단화된 상부 가닥으로 구성된다(도 2). 7-nt toehold 영역에서 단일 티민(thymine) LNA는 표적 miRNA와의 결합 친화력을 향상시킨다. miR-21을 표적으로 하는 GO와 LMB 복합체(GO-LMB-21)는 아민 작용기화된 LMB-21을 EDC-coupling chemistry를 사용하여 카르복실화된 GO와 접합시킴으로써 제조되었다.
<실험예 1> 표적 miRNA에 의한 표적 핵산 검출 시스템 활성화 확인
표적 miRNA에 의해 본 발명의 LNA를 포함하는 분자비콘 및 산화그래핀을 포함하는 표적 핵산 검출 시스템이 활성화되는지를 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동으로 확인하였다.
구체적으로, 18 % 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔에 1번 내지 4번 레인에는 각각 10 pmol의 LMB-21, 10 pmol의 miR-21/LMB-21_B, 20 pmol의 LMB-21 및 20 pmol의 miR-122를 넣고, 5번 내지 9번 레인에는 각각 5 ㎍의 GO-LMB-21과 miR-21(0, 2.5, 5, 10 및 20 pmol)을 넣었으며, 10번 레인에는 5 ㎍의 GO-LMB-21과 20 pmol의 miR-122을 준비하여 전기영동을 통해 분리하였다.
실험 결과, miR-21과 함께 혼합한 GO-LMB-21에서는 단일의 띠가 형성된 반면, miR-21을 함께 혼합하지 않은 GO-LMB-21에서는 위와 같은 띠가 형성되지 않았다(도3a). 이는 LMB-21은 GO 표면에 화학적으로 부착되어 있고, miR-21이 GO-LMB-21과 TMSD 반응을 유도하여 miR-21/bottom 이중 가닥을 형성하였음을 나타낸다.
그리고, 2번 레인의 miR-21/LMB-21_B 10 pmol과 대비하여 6번 내지 9번 레인(5 ㎍의 GO-LMB-21 및 miR-21(0, 2.5, 5, 10 및 20 pmol))의 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 실험 결과를 분석하였을 때, miR-21의 농도에 비례하여, 겔 전기 영동의 띠의 세기가 증가하였다. 이는 miR-21의 농도에 비례하여 miR-21/bottom 이중 가닥의 생성 정도 또한 증가하는 것임을 제시한다(도 4b).
<실험예 2> 표적 miRNA의 농도에 따른 표적 핵산 검출 시스템의 형광 신호 분석
본 발명의 LNA를 포함하는 분자비콘 및 산화그래핀을 포함하는 표적 핵산 검출 시스템이 표적 miRNA의 농도에 비례하여 검출 정도가 증가한다는 실험예1의 실험 결과를 보충하고자 표적 miRNA의 농도에 따른 표적 핵산 검출 시스템의 형광 신호를 분석하였다.
12.5 ㎍/ml의 GO-LMB-21 용액을 1X PBS에서 준비하였고, 해당 용액을 넓은 범위의 농도(0-100nM)의 miR-21과 혼합하였다. LMB-21의 하부 가닥에 표지된 Fluorescein(FAM)의 형광 신호 세기는 FRET에 의해 켄칭(quenching)되었다. 형광 신호는 multi-mode microplate reader(Biotek, USA)에 의해 ex 480/em 520 nm에서 측정되었다.
실험 결과, miR-21을 첨가함에 따라 새로 형성된 FAM 표지된 bottom/miR-21 이중 가닥이 방출되고 형광 신호가 점진적으로 회복되었다. 형광 신호의 세기는 miR-21의 농도가 증가함에 따라 증가하였고, 2시간 이후부터는 안정화되었다(도 5a). 또한, FAM의 유효 형광 파장 제어 영역에서 miR-21의 농도에 따른 형광 신호 세기를 분석한 결과, 520nm 영역에서 miR-21의 농도에 비례하여 형광 신호의 세기가 증가함을 나타내었다(도 5b). 이는 표적 miRNA의 농도가 증가함에 따라 표적 핵산 검출 시스템의 형광 신호의 세기가 증가함을 제시한다.
<실험예 3> 표적 핵산 검출 시스템의 특이도 확인
표적 miRNA에 관한 표적 핵산 검출 시스템의 서열 특이도를 확인하기 위해 표적 miRNA를 포함한 다른 miRNA 패밀리를 이용한 핵산 검출을 용액 내에서 수행했다.
구체적으로, miR-122, let 7a 및 scrambled RNA(scRNA)를 GO-LMB-21과 혼합한 것을 제외하고는 상기 실험예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 표적 핵산 검출 시스템의 형광 신호를 분석하였다.
실험 결과, miR-21이 GO-LMB-21의 형광 신호 세기의 현저한 증가를 유도한 반면, 다른 패밀리의 miRNA의 경우 음성 대조군과 유사하게 형광 신호 세기의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다(도 5c). 또한, FAM의 유효 형광 파장 제어 영역에서의 형광 신호 세기를 분석한 결과, 520nm 영역에서 miR-21에 의해 GO-LMB-21의 형광 신호 세기가 상승하였지만 다른 패밀리의 miRNA의 경우에는 GO-LMB-21의 형광 신호에 영향을 주지 않았다(도 5d). 이 결과는 GO-LMB-21이 표적 miRNA의 서열을 특이적으로 인식하고 표적 miRNA의 농도에 비례하여 2시간 내에 향상된 감도를 갖는 정량적 형광 신호를 생성시키는 것을 의미한다.
<실험예 4> 표적 핵산 검출 시스템의 민감도 확인
본 발명의 LNA를 포함하는 분자비콘 및 산화그래핀을 포함하는 표적 핵산 검출 시스템이 기존의 GO를 기반으로 하는 miRNA 검출 시스템에 비해 민감도가 어느 정도 더 높은지 확인하기 위해 각 시스템에서의 형광 신호 세기를 분석하였다.
구체적으로, 0 내지 100 nM 범위의 다양한 농도의 miR-21을 12.5 ㎍/ml의 GO-LMB-21 용액과 혼합하였다. 그리고 이에 대비하여, toehold 영역에 LNA가 없는 분자비콘 및 GO의 복합체인 GO-MB-21을 사용하여 동일한 실험을 반복하여 각각의 경우의 검출한계(LOD)를 분석하였다.
그 결과, GO-LMB-21의 경우 0 내지 25 nM 사이에서 형광 신호의 선형 증가를 보였으며, 검출 한계는,
LOD = 3.3 (SD / S)
*SD = 표준 편차(standard deviation), S = 기울기.
에 따라 1.3 pM으로 나타났다(도 6a). GO-MB-21 또한 시간에 따라 형광 신호의 세기가 증가하며 miR-21의 존재 하에서 높은 선택성을 보여주었지만, 형광 신호 세기의 증가 속도는 GO-LMB-21보다 훨씬 느리게 나타났다. 0 내지 100 nM 범위의 다양한 농도의 miR-21에서, GO-MB-21은 형광 신호 세기가 약간 증가하였고, 99.3 pM의 LOD를 나타냈다(도 6b). 따라서, 본 발명의 표적 핵산 검출 시스템의 LOD 값은 기존의 GO 기반 miRNA 검출 시스템의 LOD 값보다 훨씬 낮으며, 이는 toehold 영역에 LNA 첨가할 시 압도적으로 표적과의 결합 친화력을 강화하는데 도움을 주고, 민감도를 향상시킨다는 것을 제시한다.
또한, 상기 실험과 별개로 본 발명의 GO-LMB가 종래의 ssDNA와 접합한 GO 센서와 대비하여 얼마나 높은 검출 민감도를 갖는지를 확인하기 위해 GO-LMB와 종래의 GO 센서와의 형광 신호 세기를 분석하였다.
구체적으로, miR-21을 표적 miRNA로 하는 GO-LMB-21 및 GO-cDNA-21를 이용하였고, miR-21의 농도가 0 또는 100 nM일 때의 형광 신호 세기를 비교하였다.
그 결과, miR-21의 농도가 100 nM일 때 GO-LMB-21의 형광 신호 세기가 GO-cDNA-21의 것보다 훨씬 높게 나타났고(도 7a, c 및 d), 시간에 따른 형광 신호 세기를 측정하였을 때에도 GO-LMB-21의 경우가 더 높은 형광 신호의 세기를 나타냈다(도 7b). 이는, 기존의 단일가닥을 이용한 GO 센서보다 형광 시약을 부착한 제1 단일가닥 및 GO와 공유 결합하는 제2 단일가닥으로 구성된 이중가닥을 이용한 GO 센서가 더 높은 민감도를 가진다는 것을 제시한다.
<실험예 5> 표적 핵산 검출 시스템의 세포 용해물에서의 활성화 확인
본 발명의 LNA를 포함하는 분자비콘 및 산화그래핀을 포함하는 표적 핵산 검출 시스템이 소혈청 알부민(BSA, Sigma-Aldrich, USA)과 혼합하여 생물학적 시료 내에서도 표적 miRNA를 검출할 수 있는지 확인하기 위해 형광 신호의 세기를 분석하였다.
그 결과, cDNA 프로브를 사용한 기존의 GO 센서의 경우, BSA와 GO의 cDNA와의 경쟁적 상호 작용으로 인해 BSA의 농도가 증가함에 따라 형광 신호가 점차 증가하였으나, 공유 접합된 GO-LMB 센서의 경우, 생물학적 샘플 내에서도 형광 신호의 변화가 거의 나타나지 않았다(도 8a).
다음으로 단백질이 풍부한 샘플에서 스파이크된 miR-21의 LOD 테스트를 수행하였다. 그 결과, 100 ㎍/ml의 BSA의 존재 하에, GO-LMB-21은 2.25 pM의 LOD와 비슷한 정도의 값과 함께, miR-21 농도의 증가에 따른 정량적 형광 신호의 세기 증가를 보여주었다(도 8b 및 c). 이러한 낮은 LOD는 GO-LMB가 단백질이 풍부한 시료에서도 감지 성능을 손실 없이 유지할 수 있음을 나타낸다.
추가적으로 실제 샘플에서 이러한 실험의 정확성을 확인하기 위해, HepG2 용해물(10,000 세포/웰)에서 스파이크된 miR-21의 정량화를 수행하였다. 그 결과, 표준 곡선은 일련의 스파이크된 miR-21의 농도(0-1 nM)에서 도출되었고, 500 pM의 스파이크된 miR-21을 별도로 첨가한 경우, 얻어진 형광 신호의 세기는 표준 곡선으로부터의 추정 값과 일치하는 것으로 밝혀졌다(도 9).
<실험예 6> 형광 신호 다양화를 통한 표적 핵산 검출 시스템의 다중 표적 핵산 검출 확인
본 발명의 표적 핵산 검출 시스템을 통해 다중 표적을 동시에 검출할 수 있음을 확인하기 위해 복수의 형광 물질을 이용하여 검출 실험을 수행하였다.
구체적으로, 유방암의 대표적인 miRNA 바이오마커인 miR-21, miR-125b 및 let-7a를 선택하였다(표 2). miR-21을 표적으로 하는 LMB 프로브는 FAM, miR-125b를 표적으로 하는 LMB 프로브는 cyanine 5(Cy5), 그리고 let-7a를 표적으로 하는 LMB 프로브는 6-카르복실-크로다민(ROX)로 표지되었다. 이들은 각각 520 nm(녹색), 665 nm(적색) 및 605 nm(주황색)에서 방출 최대 값을 나타내고, 480, 619 및 564 nm에서 각각 여기 값을 나타낸다. GO-LMB-21 / 125b / 7a 라고 명명한 멀리플렉스 센서는 HSD 용액으로 복합체를 정제하고, GO를 FAM-LMB-21, Cy5-LMB-125b 및 ROX-LMB-7a인 3가지 종류의 LMB와 결합하여 준비하였다. 그 후, 다중 검출을 위해 GO-LMB-21 / 125b / 7a를 각 표적 miRNA(100 nM) 또는 다양한 표적 miRNA 조합과 간단히 혼합하였다.
LMB-125b 및 LMB-let 7a의 이중가닥 및 표적 RNA의 염기서열
핵산 가닥 서열(5'→3')
표적 RNA miR-125b UCC CUG AGA CCC UAA CUU GUG A
let-7a UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U
miR-122 UGG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G
scRNA GCA UCG AGC UGA AGG GCA UCG ACU UCA
LMB-125b 상단 가닥 GA CCC TAA CTT GTG A -NH2
하단 가닥 Cy5- TCA CAA GTT AGG GTC TCA GG G A
LMB-let 7a 상단 가닥 GT AGG TTG TAT AGT T -NH2
하단 가닥 ROX- ACC TAT ACA ACC TAC TAC CT C A
그 결과, 각각의 표적 miRNA와의 TSMD 반응으로 방출되는 녹색, 적색 및 주황색의 형광 방출 스펙트럼 및 이미지는 각각의 상응하는 miRNA 표적을 함유하는 샘플에서만 얻어졌다(도 10a, b 및 c).
상기한 실험 결과로부터 본 발명의 표적 핵산 검출 시스템이 다수의 형광 신호를 사용하고 각 신호 간 간섭이 일어나지 않아 다중 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있으므로, 더욱 효과적으로 miRNA 기반의 질병을 진단할 수 있음을 제시한다.
<110> Korea Institute of Toxicology <120> Conjugated composite for detecting nucleotide comprising locked nucleic acid and graphene oxide, and fluorescent method of detecting nucleotide using the same <130> 2020P-03-027 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 <400> 1 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMB-21 upper strand <400> 2 tcagactgat gttga 15 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMB-21 bottom strand <400> 3 tcaacatcag tctgataagc ta 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-125b <400> 4 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let-7a <400> 5 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122 <400> 6 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 7 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scRNA <400> 7 gcaucgagcu gaagggcauc gacuuca 27 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMB-125b upper strand <400> 8 gaccctaact tgtga 15 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMB-125b bottom strand <400> 9 tcacaagtta gggtctcagg ga 22 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMB-let 7a upper strand <400> 10 gtaggttgta tagtt 15 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMB-let 7a bottom strand <400> 11 acctatacaa cctactacct ca 22

Claims (15)

  1. LNA를 포함하는 분자비콘(LNA-containing molecular beacon)은 표적 핵산 결합 서열(toehold)과 형광시약을 포함하는 제1 단일가닥과 산화그래핀과 접합하는 제2 단일가닥으로 구성되고,
    상기 제1 단일가닥과 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합된 상태에서,
    (a) 상기 제1 단일가닥의 표적 핵산 결합서열(toehold)이 표적 핵산과 상보적으로 결합하는 단계;
    (b) 상기 표적 핵산 결합서열(toehold)로 인하여 제1 단일가닥이 TMSD(toehold-mediated strand displacement)반응을 통해 표적 핵산과 적어도 일부분의 상보적 서열을 갖는 것으로부터 혼성화되어 혼성체가 제2 단일가닥으로부터 유리되는 단계;
    (c) 상기 제1 단일가닥이 표적 핵산과 상보적으로 결합하고 상기 제2 단일가닥과는 완전히 유리되어, 형광시약이 빛을 발광하는 단계;
    (d) 발광하는 형광시약의 빛의 신호를 검출하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 산화그래핀은 10nm 내지 1μm의 크기를 가지는 입자형태인 것을 특징으로 하는 LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 형광 시약은,
    FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표적 핵산 검출 방법은 2 이상의 상기 분자비콘을 한번에 산화그래핀에 접합하되,
    상기 분자비콘의 제1 단일가닥에 각기 다른 형광 시약을 부착하는 것을 특징으로 하는, LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 분자비콘의 제2 단일가닥이 산화그래핀과 공유결합으로 접합하는 것을 특징으로 하는, LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 분자비콘의 제2 단일가닥의 아민기가 산화그래핀의 카복실기와 공유결합으로 접합하는 것을 특징으로 하는, LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 형광 시약은 제1 단일가닥에 부착되어 제2 단일가닥의 아민기와 동일 방향을 향하는 것을 특징으로 하는, LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 형광 시약은 산화그래핀과 5nm 이하의 거리에 존재하는 것을 특징으로 하는, LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태인 것을 특징으로 하는 LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 산화그래핀은 10nm 내지 200nm의 크기를 가지는 입자 형태를 포함하는 것인, LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 표적 핵산 검출 방법은 세포 용해물에서 활성화하는 것을 특징으로 하는, LNA를 포함하는 분자비콘을 이용한 표적 핵산 검출 방법.
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adegoke 등. Nano Convergence. Vol. 3, No. 32, 페이지 1-13 (2016.12.01.)*
Zhen 등. Analytical Chemistry. Vol. 88, No. 17, 페이지 8766-8771 (2017.07.24.)*

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