KR101765217B1

KR101765217B1 - 핵산의 검출 방법 및 핵산 검출용 키트

Info

Publication number: KR101765217B1
Application number: KR1020150064498A
Authority: KR
Inventors: 민달희; 이지언
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2015-05-08
Publication date: 2017-08-04
Also published as: KR20150128612A

Abstract

본원은 핵산의 검출 방법 및 핵산 검출용 키트에 관한 것이다.

Description

핵산의 검출 방법 및 핵산 검출용 키트{METHOD FOR DETECTING NUCLEIC ACID AND KIT FOR DETECTING NUCLEIC ACID}

DNA 검출은, 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), 에볼라 바이러스(ebola virus, EV) 및 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome, SARS)을 유발하는 코로나 바이러스와 같은 바이러스에 의해 발생되는 치명적인 감염뿐만 아니라, 유전적 변화들에 관련된 질환을 진단하고 관찰하는데 중요한 역할을 한다. 서던 블롯(southern blot), 형광 인 시츄 혼성화(fluorescence in situ hybridization, FISH), 폴리머라아제 사슬 반응(polymerase chain reaction, PCR) 및 DNA 마이크로어레이와 같은 종래의 DNA 검출 방법들은, 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 통한 단일 가닥 핵산의 서열 특이 인식에 근거한 것이다. 최근에는, 나노물질들에 근거한 대안적 접근법들이 간단하고 빠른 DNA 검출을 위해 개발되었다.

일반적으로, 표적 DNA가 일반적으로 상보 가닥과 듀플렉스(duplex) 형태로 존재하기 때문에, 프로브 분자 또는 서열과의 혼성화에 의한 표적 DNA의 감지 전에 두 DNA 가닥을 분리시키기 위해 변성 공정이 필수적이다. 이러한 경우에, 두 개의 원래 DNA 가닥들의 자발적인 재어닐링이 프로브와 표적 DNA와의 혼성화를 방해할 수 있어 표적 검출 효율을 감소시킬 수 있다. 최근에, 변성 및/또는 재혼성화가 필요 없는 여러 접근법들이 제시되었다. 이러한 직접 검출 방법들은 징크 핑거(zinc finger) DNA 결합 단백질들[D. J. Segal, C. F. Barbas III, Curr . Opin . Biotechnol. 2001, 12, 632-637], 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합한 피롤-이미다졸 폴리아미드류(pyrrole-imidazole polyamides, PAs)[D M. Mrksich, W. S. Wade, T. J. Dwyer, B. H. Geierstanger, D. E. Wemmer, P. B. Dervan, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 1992, 89, 7586-90; P. B. Dervan, Bioorg. Med . Chem . 2001, 9, 2215-2235], 및 이중 가닥 DNA의 메이저 그루브(major groove)에 결합한 후그스틴(Hoogsteen) 산소에 대한 삼중-형성 올리고누클레티드류(triplex-forming oligonucleotides, TFOs)[P. P. Chan, P. M. Glazer, J. Mol . Med . 1997, 75, 267-282]와 같은 이중-가닥 DNA(double-stranded DNA, dsDNA)를 사용하였다. 그러나, 이러한 접근법들은 프로브로서 단백질의 낮은 화학적 안정성 및 인식 길이 또는 서열에서의 제한과 같은 문제점들을 갖는다. 예를 들어, PA 프로브들은 상대적으로 짧은 서열(일반적으로, 4 개 내지 6 개 염기쌍)의 표적만을 인식할 수 있으며 TFO 가닥들은 호모푸린-호모피리미딘(homopurine/homopyrimidine) 서열결정 듀플렉스를 감지하는데에만 사용된다. 징크 핑거 단백질과 같은 DNA 결합 단백질의 경우에, 단백질 프로브의 안정성은 표적 검출 동안 일반적으로 문제가 된다. 그러므로, 이중 가닥 DNA 검출을 위한 직접적이고 간단하며 효과적인 감지 플랫폼을 만드는 것이 중요하다.

그래핀은 우수한 전기적, 열적, 및 기계적 특성을 갖는 2D 탄소 시트이다. 그래핀의 수용성 유도체인 산화그래핀(graphene oxide, GO)은 최근에 약물 수송, 촉매, 효소 활성 검정 및 바이오센서와 같은 다양한 생물학적 적용에 사용되었다. 이러한 적용들에서의 일반적인 전략은 π-π 스택킹을 통한 산화그래핀과 소수성 분자들 및 단일 가닥 핵산의 강한 결합 및/또는 산화그래핀의 수소 결합 상호작용 및 형광-??칭(quenching) 능력에 의존한다.

본원은, 핵산의 검출 방법 및 핵산 검출용 키트를 제공하고자 한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 기술한 과제로 제한되지 않으며, 기술되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 표적 핵산을 포함하는 시료를 준비하는 단계; 형광 물질을 함유하며, 상기 표적 핵산에 상보적인 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 상기 시료에 첨가하여 혼합하는 단계; 및, 상기 혼합물에 산화그래핀을 첨가하는 단계를 포함하는, 핵산의 검출 방법을 제공한다.

본원의 제 2 측면은, 형광 물질을 함유하며, 표적 핵산에 상보적인 PNA 프로브; 및, 산화그래핀을 함유하는 용액을 포함하는, 핵산 검출용 키트를 제공한다.

본원의 핵산의 검출 방법은 산화그래핀에 근거하여 핵산을 서열-특이적 및 정량적으로 검출할 수 있는 최초의 방법이다. 본원의 핵산 검출은 PNA 및 산화그래핀의 독특한 특성들을 사용함으로써, LOD의 광범위한 변화 없이 혈청 함유 시료들 내에서도 정량적 형광분석 핵산 감지를 가능하게 하였다. 이는 종래의 DNA 프로브의 사용에 의해서는 불가능했던 것이라는 점에서, 본원 고유의 효과라고 할 것이다. PNA 및 산화그래핀의 조합을 이용하여 핵산을 검출하는 본원의 방법에 따를 경우, 종래의 DNA 또는 RNA 프로브의 문제점들을 해소함으로써 산화그래핀 기저 센서의 적용 분야를 더 넓힐 수 있다. 본원의 핵산 검출은 기술적으로 간단하고 다중화된 감지 포맷들과 호환가능하다는 점에서 이점이 있다. 본원의 핵산 검출 방법에서는 다양한 시료들이 적용될 수 있으며, 번거로운 다단계를 거칠 필요 없이 혼합 및 인큐베이션 후에 시료의 형광 이미지를 수득함으로써 표적 핵산의 정량적 다중 검출을 수행할 수 있다. 본원에 따른 이중 가닥 DNA 검출 플랫폼은 표적 DNA 서열에 따라 PNA 프로브의 서열을 변경함으로써 설정될 수 있으며, 이에 따라 어떠한 서열 한도도 없이 다양한 핵산 검출에 적용될 수 있다는 이점이 있다.

또한, 열처리를 통해, 미스매치된 이중 가닥, 심지어는 단일 불일치된 핵산과의 미스매치된 이중 가닥도 배제하여, 정확한 표적 핵산의 검출이 가능하게 하였다.

아울러, 본원의 핵산 검출 방법은, 변성 단계를 거칠 필요없이 표적 핵산의 정량 및 직접 분석을 가능하게 한다는 이점이 있다.

본원의 PNA 프로브를 사용하는 이러한 신규한 직접 산화그래핀-기저 핵산 검출 방법은, 바이러스 질환 및 유전 장애의 진단 및 개인 맞춤형 의료 분야에서 유용하게 적용될 수 있을 것이다.

도 1은, 본원의 일 구현예에 따른 표적 핵산의 검출 방법의 메커니즘의 개략도이다.
도 2는, 본원의 일 실시예에 따른 산화그래핀의 특성을 나타낸 것이다: (a) 약 100 nm 너비 및 약 1.0 nm 높이로서 제조된 산화그래핀의 면적을 보이는 AFM(atomic force microscopy) 이미지 및 높이 프로필 (삽도); sp² 탄소 도메인의 구조적 장애를 제시하는 산화그래핀의 (b) 라만 및 (c) UV-Vis 흡수 스펙트럼; (d) 산화그래핀 내에 존재하는 산소 함유 기능기들의 특징적인 피크들을 확인하는 산화그래핀의 FT-IR 스펙트럼.
도 3은, 본원의 일 실시예에 따른 PNA와 표적 핵산의 혼성화를 입증하기 위한 실험의 결과를 나타낸 것이다: (a) 겔 전기영동이 15% 네이티브-PAGE 상에서 실행되었음; 1-4 라인들은 ssPNA, dsDNA, ssDNA (하부 가닥) 및 ssDNA (상부 가닥)을 보임; 5-7 라인들은 5, 10, 20 pmol의 PNA와 함께 인큐베이션한 10 pmol의 이중 가닥 DNA를 보임; 8-10 라인들은 5, 10, 20 pmol의 PNA와 함께 인큐베이션한 10 pmol의 ssDNA(상부 가닥)를 보임; (b) 산화그래핀 (각각 0 μg 및 0.5 μg)의 존재 시 FAM 표지된 PNA의 형광 스펙트럼; (c) 표적 이중 가닥 DNA 및 FAM 표지된 PNA 프로브의 서열.
도 4는, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 것이다: (a) 산화그래핀이 첨가된 완충 용액 내에서 다양한 농도의 이중 가닥 DNA 표적 및 400 nM의 스크램블드 dsDNA의 존재 시의 FAM-PNA 프로브의 형광 스펙트럼; (b) 0 내지 100 nM의 광범위한 농도 범위의 표적 dsDNA를 수반한 형광 강도 증가(F/F₀) (F: 표적과 혼성화된 PNA 프로브의 형광 강도, F₀: 표적이 없는 PNA 프로브의 형광 강도).
도 5는, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 것이다: 스크램블드 ssDNA, 표적 dsDNA, 표적 ssDNA (각각 0, 5, 10 pmol)의 존재 시의 (a) PNA 프로브 및 (b) DNA 프로브의 형광 강도 증가(F/F₀).
도 6은, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 것이다: (a) 1 X PBS 용액 내에서 광범위한 농도 범위(~ 500 nM)의 표적을 수반한 형광 강도 증가(F/F₀); (b) 고농도의 표적 및 스크램블드 서열결정 dsDNA 를 수반한 형광 강도 증가(F/F₀)(F: 표적을 수반한 PNA 프로브의 형광 강도, F₀: 표적이 없는 PNA 프로브의 형광 강도).
도 7은, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 것이다: (a) 산화그래핀이 첨가된, 표적 dsDNA, 단일 염기쌍 불일치, 세 염기쌍 불일치 dsDNA 및 스크램블드 서열 dsDNA 존재 시의 PNA 프로브의 형광 스펙트럼; (b) 일치, 불일치 dsDNA 표적을 갖는 형광 강도 증가(F/F₀)를 보이는 막대 그래프 (각각 0, 50, 100 nM).
도 8은, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 것이다: (a) 산화그래핀이 첨가된 10% FBS를 함유하는 완충 용액 내에서 다양한 농도의 dsDNA 표적 및 400 nM의 스크램블드 dsDNA의 존재 시의 PNA 프로브의 형광 스펙트럼; (b) 10% FBS를 함유하는 완충 용액 내에서 0 내지 100 nM의 광범위한 농도 범위를 갖는 표적의 형광 강도 증가(F/F₀).
도 9는, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 것이다: (a) 10% FBS를 함유한 완충 용액 내에서 산화그래핀(각각 0 μg, 0.5 μg 및 2.5 μg)과 함께 인큐베이션한 PNA에 접합된 FAM의 형광 스펙트럼; (b) 10% FBS를 함유한 완충 용액 내에서 광범위한 농도(~ 500 nM)의 표적을 수반한 형광 강도 증가(F/F₀) (F: 표적을 수반한 PNA 프로브의 형광 강도, F₀: 표적이 없는 PNA 프로브의 형광 강도).
도 10은, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 것이다: 산화그래핀의 존재 시 각 3 개의 염료 표지된 PNA의 상대적 형광 강도; FAM, ROX 및 Cy5가 각각 HVA, HIV 및 HVB에 대한 각 PNA 프로브에 접합되었음.
도 11은, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 것이다: 단일 용액 내의 세 개의 바이러스 유전자의 다중 표적 검출; (a) 완충 용액 내 200 nM 표적 dsDNA의 존재 시 세 개의 염료 표지된 PNA의 형광 스펙트럼; (b) 다중 검출을 위한 반응 혼합물들의 형광 이미지; 컬럼 1: FAM-HVA의 형광 시그널; 컬럼 2: FAM-HVB의 형광 시그널; 컬럼 3: 200 nM의 각 표적의 존재 시 FAM-HIV의 형광 시그널; (c) 각 표적 dsDNA(200 nM)의 존재 시 세 개의 염료 표지된 PNA의 상대적 형광 강도를 보이는 막대 그래프 (F: 표적을 갖는 PNA의 형광 강도, F_max: 완벽히 일치하는 듀플렉스 표적의 존재 시 관찰되는 각 PNA 프로브의 형광 강도).
도 12는, 본원의 일 구현예에 따른 표적 핵산의 검출 방법의 메커니즘을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 13은, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 방법의 온도에 따른 검출 효율을 나타낸 그래프이다.
도 14는, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는, 본원의 일 실시예에 따른 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은, 본원의 일 실시예에 따른 다중 표적 핵산의 검출 결과를 나타낸 것이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.

그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합(들)"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서에서 사용된 "PNA(peptide nucleic acid)"는 포스페이트 골격 대신 폴리아미드를 갖는 DNA 유사체를 의미한다.

본원의 제 1 측면은, 표적 핵산을 포함하는 시료를 준비하는 단계; 형광 물질을 함유하며, 상기 표적 핵산에 상보적인 PNA 프로브를 상기 시료에 첨가하여 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물에 산화그래핀을 첨가하는 단계를 포함하는, 핵산의 검출 방법을 제공한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 산화그래핀을 첨가하는 단계 후에 열처리하는 단계를 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 열처리는 약 50℃ 내지 약 80℃, 예를 들어, 약 65℃ 내지 약 70℃의 온도 범위에서 실시될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 약 70℃의 온도에서 열처리하였을 때, 미스매치가 없는 표적 핵산과 이에 상보적인 PNA는 고온에서도 이중 가닥이 유지되어 산화그래핀에 흡착되지 않고 형광신호가 유지되는 반면(도 12의 (a)), PNA와 불일치된 핵산, 특히, 단일 불일치만을 갖는 핵산과 미스매치된 이중 가닥은 고온에서 불안정해져 단일 가닥으로 풀리게 되고, 이는 산화그래핀에 흡착 후 형광 소광이 일어난다(도 12의 (b)). 이에 따라, 단일 미스매치까지 구분할 수 있는 핵산의 검출 방법을 제공할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 표적 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, DNA 또는 RNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산은 이중 가닥 DNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 PNA 프로브는 상기 표적 핵산과 혼성화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 PNA 프로브는 핵산, 특히 이중 가닥 DNA에 대한 우수한 결합 친화력을 가지고 있어, 상보적인 DNA 가닥의 말단에 결합하기 시작하여 DNA/PNA 듀플렉스를 형성할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 표적 핵산과 혼성화되지 못한 잔여 PNA 프로브 및 잔여 핵산 가닥들이 상기 산화그래핀에 흡착되는 것일 수 있으며, 상기 산화그래핀에 흡착된 PNA 프로브에 포함된 형광 물질이 ??칭(quenching)되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 핵산과 혼성화되지 못한 유리 PNA 프로브가 π-π 스택킹 상호작용 및 수소 결합 형성을 통해 산화그래핀에 우선적으로 결합한 후 PNA 프로브에 접합된 염료의 형광이 산화그래핀으로의 에너지 이송에 의해 ??칭된다. 이에 따라, 표적 DNA와 듀플렉스를 형성하는 PNA만이 형광 신호를 발산하므로, 표적 이중 가닥 DNA의 초기 농도가 정량적으로 분석될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 물질의 발광은 실시간으로 측정되어 상기 표적 핵산이 실시간으로 검출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 PNA 프로브는 서로 상이한 형광 물질을 함유하는 한 종류 이상의 PNA 프로브를 포함하고 상기 표적 핵산은 상기 한 종류 이상의 PNA 프로브 각각과 결합하는 한 종류 이상의 핵산을 포함함으로써, 서로 상이한 핵산을 다중 검출할 수 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 한 종류 이상의 핵산은 각각 서로 상이한 형광 물질을 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 PNA 프로브는 상기 표적 핵산에 상보적인 단일 가닥 PNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 PNA는 포스페이트 골격 대신 폴리아미드를 갖는 DNA 유사체를 의미하는 것으로서, 높은 서열 특이성을 갖지고 있어 단시간에 상보적인 DNA 또는 RNA와 혼성화할 수 있다. 천연 핵산과 PNA의 듀플렉스는 다양한 완충 조건들 및 고온에서 높은 안정성을 가지며, 이는 주로 PNA의 비전하 중성 골격에 기인한 것이다. 일반적으로, DNA/PNA 듀플렉스는 DNA 듀플렉스보다 염기쌍 당 적어도 1℃ 더 높은 녹는점을 보인다. 상기 PNA는 또한 음성 전하를 띄는 핵산보다 더 강하게 음성 전하를 띄는 산화그래핀과 상호작용할 수 있고 안정한 PNA/GO 복합체를 구성할 수 있으며, 이는 산화그래핀으로부터 프로브 핵산의 더 적은 비-특이 탈착에 기인한 더 낮은 백그라운드 시그널을 보인다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 표적 핵산을 포함하는 시료는 인간 또는 포유동물로부터 입수가능한 생체 시료라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 혈액, 혈청, 소변, 타액, 혈장, 또는 체액을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 PNA 프로브는 상기 표적 핵산에 상보적인 단일 가닥 PNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 서로 상이한 표적 핵산의 다중 검출을 위해, 서로 상이한 형광 물질을 함유하는 한 종류 이상의 상보적인 PNA 프로브를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하, 도 1을 참조하여 본원의 핵산의 검출 방법을 상세히 설명하고자 한다.

도 1은 본원의 핵산의 검출 방법의 메카니즘의 개략도이다.

본원에 따른 핵산의 검출 방법은, 우선 형광 염료 접합된 PNA 프로브(Dye-PNA), 및 PNA 프로브 인식을 위한 실제 표적 DNA로서 상부 가닥 및 표적 DNA에 상보적인 하부 가닥으로 구성된 표적 이중 가닥 DNA를 준비한다. PNA 프로브와 이중 가닥 DNA를 함께 인큐베이션하면, DNA 듀플렉스의 말단 염기쌍에서의 수소 결합이 내부 염기쌍보다 약하므로 PNA는 상부 가닥의 말단에 결합할 수 있다. 상보적인 DNA에 대한 PNA의 우수한 결합 친화력에 기인하여, 가닥 치환에 대한 분지 이동(branch migration)이 단계적으로 일어난다. 최종적으로, 하부 가닥이 원래 DNA 듀플렉스로부터 분리되어 PNA/DNA 듀플렉스가 형성될 수 있다. 이러한 혼합물에 산화그래핀(GO)을 첨가함에 따라, PNA/DNA 듀플렉스가 아닌, 유리 PNA 프로브가 π-π 스택킹 상호작용 및 수소 결합 형성을 통해 산화그래핀에 우선적으로 결합한 후 PNA 프로브에 접합된 염료의 형광이 산화그래핀으로의 에너지 이송에 의해 ??칭된다. 이에 따라, 표적 DNA와 듀플렉스를 형성하는 PNA만이 형광 신호를 발산하므로, 표적 이중 가닥 DNA의 초기 농도가 정량적으로 분석될 수 있다 (도 1 참조).

이하, 본원의 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하며, 본 실시예에 의하여 본원의 범위가 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

재료 및 방법

DNA 가닥은 Genotech (Daejon, Korea)으로부터 입수하였으며, 이의 서열은 하기 표 1과 같다:

다중 이중 가닥 DNA 검출을 위해 사용된 DNA 가닥은 하기 표 2와 같다:

실시예에서 사용된 PNA 프로브는 Panagene(Daejon, Korea)에서 입수하였으며, 그 서열은 하기 표 3과 같다:

그래파이트 나노파이버는 Catalytic Materials LLC (USA)로부터 입수하였다. 황산(H₂SO₄)은 Samchun chemical (Seoul, Korea)로부터 입수하였다. 과산화수소(물 중 30%)(H₂O₂)는 Junsei (Japan) 로부터 입수하였다. 과망간산칼륨(KMnO₄), 과황산칼륨(K₂S₂O₈) 및 오산화인(P₂O₅)은 Sigma-Aldrich (MO, USA)로부터 입수하였다. 우태아 혈청(FBS)은 Welgene (Daegu, Korea)으로부터 입수하였다. 형광 강도 및 형광 이미지는 형광계 SynergyMx (Biotek, UK)로부터 수득하였다.

제조예 1: 산화그래핀(GO)의 제조

변형된 Hummers 방법을 사용하여 산화그래핀의 수성 현탁액을 제조하였다.

산화그래핀(GO)은 출발 물질로서 그래파이트 나노파이버를 사용하여, 예비-산화 처리를 수반한 Hummers 방법을 사용하여 합성하였다. 우선, 농축된 H₂SO₄(5 mL)를 둥근 바닥 플라스크 내에서 80℃로 가열한 후, K₂S₂O₈(0.15 g) 및 P₂O₅(0.15 g)를 4.5 시간 동안 80℃를 유지하면서, 상기 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 냉각시킨 후, 상기 반응 혼합물을 탈이온수로 희석하였다. 이 용액을 여과하고 탈이온수(100 mL)로 세척하여 남아있는 반응물들을 제거하였다. 수득된 예비-산화된 그래파이트 나노파이버를 공기 중에 건조하였다. 그런 다음, 건조된 고형물을 50 mL 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 농축된 H₂SO₄를 첨가하였다(25 mL). 그런 다음, 상기 혼합물을 얼음 바스를 사용하여 0℃까지 냉각시켰다. KMnO₄(1 g)을 온도를 10℃ 이하로 유지하면서, 교반 하에서 상기 혼합물에 천천히 첨가하였다. 혼합 후, 상기 플라스크를 35℃의 수조에 12 시간 동안 두었다. 상기 혼합물을 얼음 바스 내의 에를렌마이어 플라스크(500 mL)로 옮겼다. 탈이온수(100 mL)를 상기 플라스크에 교반하면서 천천히 첨가하였다. 이 단계 동안, 온도를 55℃ 미만으로 유지하였다. 그런 다음, 5 mL의 30 % H₂O₂ 용액을 상기 혼합물에 첨가하여 색깔이 밝은 황색으로 변하게 하였다. 이 혼합물을 수집하고 원심분리한 후 3.4% HCl 용액 및 아세톤으로 세척하여 잔류 염 및 산을 제거하였다. 수득된 고형 산화그래핀을 사용 전에 진공 하에서 건조시켰다. 산화그래핀 용액을 얻기 위해, 산화그래핀을 물에 용해한 후 상기 용액을 3000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 큰 덩어리들을 제거하였다.

단일막의 산화그래핀은 원자 힘 현미경(atomic force microscopy, AFM)에 의해 분석되었다(도 2a). 또한, 라만 분광법, UV-Vis 흡수 분광법 및 퓨리에 변환 적외선 분광법(Fourier transform infrared, FT-IR)을 사용하여 산화그래핀을 한층 더 상세히 분석하였다. 라만 스펙트럼은 1352 및 1601 cm^-1에서 피크들을 보였으며, 이는 각각 구조적 장애에 관련된 D 밴드 및 정렬된(ordered) sp² 탄소 도메인에 관련된 G 밴드에 상응하는 것이었다(도 2b). UV-Vis 흡수 스펙트럼은 방향족 C=C 결합들의 π-π^* 전이에 관련된 234 nm에서 흡수 최대치를 보였다(도 2c). FT-IR 스펙트럼에서의 피크들은 산화그래핀의 여러 산소 함유 기능기들에 해당되는 것이다(도 2d). 상기 실험 데이터들을 통해, 산화그래핀의 수성 현탁액이 성공적으로 제조된 것을 알 수 있다.

제조예 2: 표적 DNA의 제조

듀플렉스 DNA 표적을 제조하기 위해, 2.5 μL의 100 μM 상위 가닥 DNA를 50 mM Tris-HCl 및 50 mM NaCl를 함유하는 pH 8.0 버퍼 내에서 1.1 배 과량의 하부 가닥 DNA와 혼합하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 90℃에서 5 분 동안 가열하여 어닐링한 후 1 시간 동안 실온에서 천천히 냉각시켰다.

실시예 1

PNA에 의한 이중 가닥 DNA의 치환을 비변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(네이티브-PAGE)을 사용하여 PNA/DNA 듀플렉스 및 온전한 이중 가닥 DNA를 분해함으로써 확인하였다. 표적 이중 가닥 DNA는 PNA 프로브에 상보 서열을 갖는 상부 가닥 DNA(서열번호 1: 5'- ATA AGC GTA ACT TCC CTC AAA - 3') 및 하부 가닥 DNA(서열번호 2: 5' - TTT GAG GGA AGT TAC GCT TAT - 3')를 어닐링함에 의해 제조되었다. DNA/DNA 듀플렉스에 비해 더 적은 PNA/DNA 듀플렉스의 음성 전하에 기인하여, 헤테로 듀플렉스의 밴드는 겔에서의 DNA 듀플렉스보다 더 느린 이동을 나타내는 상부 영역에서 나타났다(도 3의 (a)). 이는 PNA 프로브가 이중 가닥 DNA에 첨가되었을 때, PNA가 이중 가닥 DNA의 말단 부위에 우선 결합한 후, 하부 가닥 DNA의 분리에 따라 PNA 및 DNA 사이의 분지 이동 및 완전한 혼성화가 이루어지기 때문인 것으로 예상된다. 그런 다음, 플루오레세인 아미디트(fluorescein amidite, FAM) 표지된 ssPNA 프로브(서열번호 15: 5' - FAM-TTT GAG GGA AGT TAC GCT TAT - 3')의 형광을 ??칭하기 위한 최적 산화그래핀 농도를 결정하였다. 본 발명자들은 FAM-PNA 프로브의 형광이 산화그래핀(0.5 μg)의 존재 시 98%까지 ??칭된다는 것을 발견하였으며, 이는 실험 조건 하에서 최대 ??칭 효율로서 설정되었다(도 3의 (b)).

실시예 2

반응 혼합물을 1 X PBS(NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM을 함유하는 pH 7.2 버퍼) 내에서 다양한 농도(0 내지 500 nM)의 어닐링된 표적 이중 가닥 DNA와 함께 100 nM FAM 표지된 PNA 프로브를 인큐베이션하여 제조하였다. 또한, 400 nM의 스크램블드 이중 가닥 DNA를 100 nM FAM 표지된 PNA 프로브를 인큐베이션하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 1 μL의 500 μg/mL 산화그래핀 스톡을 상기 혼합물들에 첨가하였다. 형광 강도를 520 nm에서 측정하였다.

이중 가닥 DNA, FAM-PNA 및 산화그래핀의 혼합 용액들의 형광 발산 스펙트럼은, 표적 이중 가닥 DNA 대신 스크램블드(scrambled) 이중 가닥 DNA를 함유하는 혼합물로부터 눈에 띄는 형광 강도를 보이지 않는 높은 서열 친화도를 갖는, 이중 가닥 DNA 농도-의존 형광 상승을 보였다(도 4의 (a)). 이러한 센서는 식 [LOD = 3.3 (SD / S) (LOD: 검출 한도, SD: 표준 편차, S: 교정 곡선의 경사)]에 따라 260 pM의 검출 한도에서, 0 pM 및 2000 pM 사이에서 선형 형광 증가를 보였다(도 4의 (b)). 더 높은 농도의 이중 가닥 DNA(500 nM 까지) 또한 농도-의존 형광 증가를 보였다(도 5a 및 도 5b).

실시예 3

대조로서, FAM-PNA 프로브 대신 FAM-DNA 프로브를 사용한 동일한 실험을 실시하였다. FAM-DNA 프로브는 스크램블드 DNA의 첨가 후 산화그래핀의 첨가에 따라 상당한 시그널 증가를 보였으며, 이는 표적 DNA 및 산화그래핀에 완벽히 일치되는, FAM-DNA 프로브의 혼합물로부터 측정된 형광 강도의 약 50%로서 평가되었다. 즉, FAM-PNA 프로브 대신 FAM-DNA 프로브를 사용한 대조 데이터로부터, PNA 프로브에 비해 DNA 프로브가 이중 가닥 DNA의 직접 서열 특이 정량 검출에 대한 적합성이 훨씬 더 낮음을 확인할 수 있었다(도 6a 및 도 6b).

실시예 4

앞서 기재한 표 1에 기재된 바와 같은 완벽히 일치된 표적 서열 및 불일치된 표적 서열 사이의 식별 검사를 실시하였다. 인간 유전자 내의 불일치 서열의 인식은, 유전자 돌연변이, DNA 손상, 및 단일-누클레오티드 다형성(single-nucleotide polymorphisms, SNP)에 대한 단서들을 제공할 수 있다는 점에서 중요하다. 하나 및 세 개 염기-쌍 불일치 표적 DNA들은 내부 염기들에서 전환 불일치를 사용하여 설계되었다(서열 내 A를 T로 치환함, A↔T). 예상된 바와 같이, 불일치된 표적은 FAM-PNA 및 산화그래핀의 첨가에 따라 완벽하게 일치하는 표적보다 더 낮은 형광 강도를 보였다(도 7의 (a)). 상부 표적 가닥의 중간에서의 단일 불일치는, 완벽하게 일치하는 표적 DNA에 비해, F/F₀ 수치가 57%로 감소되었다. 또한, F/F₀ 수치는, 세 개의 염기가 불일치하는 서열에서는 약 35%로 감소하였으며, 스크램블드 이중 가닥 DNA에서는 약 1%로 감소하였다(100 nM PNA 프로브와 인큐베이션된 100 nM의 각 표적의 시료들에서 측정한 값임)(도 7의 (b)).

실시예 5

본원의 방법이 혈청을 함유하는 생물학적 시료들에서 이중 가닥 DNA를 직접 감지하기 위해 적용될 수 있는 가능성을 확인하기 위해, 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 함유한 완충 용액들 내에서 이중 가닥 DNA 검출을 실험하였다. 형광 발산 스펙트럼은 1 X PBS에서 제조된 용액들에서의 형광 강도에 비해 약간 더 높은 형광 강도를 보였다(도 8의 (a)). 산화그래핀 표면에 비특이성 친화도를 갖는 FBS 내의 다양한 단백질들이 산화그래핀에 대한 PNA/DNA 듀플렉스의 약한 흡수를 예방할 수 있는 반면, ssPNA는 여전히 혈청 단백질 및 PNA/DNA 듀플렉스보다 산화그래핀에 대해 더 강한 친화도를 보였다. 상기 조건 하에서, 센서는 또한 식 [LOD = 3.3(SD / S)]에 따라 400 pM의 약간 더 높은 검출 한도를 나타냈으며, 이는 표적 DNA(0 ~ 2000 pM)의 동일 농도 범위 내에서 선형 형광 증가를 나타내는 것이다(도 8의 (b)). 도 8의 (b)에 나타난 바와 같이, 상기 조건 하에서, 센서는 표적 DNA(0 ~ 2000 pM)의 동일 농도 범위 내에서 선형 형광 증가를 나타냈으며 식 LOD = 3.3 (SD / S)에 따라 400 pM의 약간 더 높은 검출 한도를 보였다. 따라서 고농도의 단백질이 포함된 환경에서도 큰 검출 한도의 변화 없이 타겟 검출이 가능하므로 실제 다양한 생물학적 시료에서 dsDNA를 감지할 시 정제과정을 생략하여 짧은 시간 내 간단한 수행이 가능하다.

실시예 6

다중 표적 검출을 위해, 표적 이중 가닥 DNA 표적으로서 A 형 간염 바이러스 Vall7 폴리프로테인 유전자(HVA), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 B 형 간염 표면 항원 유전자(HVB)를 사용하였다. 상기 표 2에 기재된 바와 같은 세 개의 치명적인 바이러스로부터 유래된 독특한 서열을 갖는 15 bp를 갖는 표적 이중 가닥 DNA를 제조하고 각각 492 nm, 587 nm 및 650 nm에서 여기(excitation)되는 518 nm(녹색), 608 nm(오렌지색) 및 670 nm(적색)의 발산 최대치를 보이는 세 개의 다른 형광 염료들인 FAM, ROX(6-카르복실-X-로다민) 및 Cy5(cyanine 5)와 접합시켰다. 상기 각 표적 이중 가닥 DNA 또는 세 개의 이중 가닥 DNA(200 nM)의 다른 조합들을 1 X PBS 중 각각 10 pmol의 FAM-HVA 프로브, ROX-HIV 프로브 및 Cy5-HVB 프로브(각 프로브의 서열은 표 3에 기재된 바와 같음)를 함유하는 PNA 프로브 혼합물(각 농도= 100 nM)과 함께 인큐베이션하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 1.25 μL의 500 μg/mL 산화그래핀 스톡을 혼합물에 첨가하였다(도 10).

FAM-PNA, ROX-PNA 및 Cy5-PNA는 균일 용액 내에서 492 nm, 587 nm 및 650 nm에서 여기되었다. 각 프로브의 형광 강도는 각각 518 nm, 608 nm, 및 670 nm에서 측정되었다. 녹색, 오렌지색, 및 적색 형광 발산 스펙트럼 및 이미지들이 각 상응하는 HVA, HIV 및 HVB 표적 이중 가닥 DNA를 함유하는 시료들에서만 수득되었다(도 11의 (a) 및 (b)). 또한, 서열 특이 형광 반응은 분석체 이중 가닥 DNA의 다른 조합들로부터 수득된 각 형광 강도들을 보이는 막대 그래프로부터도 확인할 수 있었다(도 11의 (c)).

결론적으로, 본원에 의하면 PNA 프로브를 사용하는 이중 가닥 DNA 검출을 위한 신규한 GO-기저 플랫폼을 제조할 수 있다. 이는 산화그래핀에 근거하여 이중 가닥 DNA를 서열-특이적 및 정량적으로 검출하는 것을 최초로 시도하여 그 유용성을 입증한 것이다. 본 실시예의 이중 가닥 DNA 센서는 PNA 및 산화그래핀의 독특한 특성들을 사용한 것이다. 첫째로, PNA는 서열 한정 없이 표적 이중 가닥 DNA의 상보적 가닥의 말단에 침입한 후, 상보적 DNA에 대한 우수한 결합 친화도를 이용하여 가닥 치환을 유도한다. 두 번째로, 산화그래핀은 단백질 및 자연적으로 발생한 핵산과 같은 다른 생체분자에 비해 비전하 ssPNA에 대한 우수한 흡착 능력을 갖는다. 또한, 산화그래핀은 PNA 프로브에 부착되는 염료의 형광을 효과적으로 ??칭한다. 본원에 따라 PNA 프로브를 산화그래핀과 결합시킴으로써, 정량적 형광분석 이중 가닥 DNA 감지가 LOD의 광범위한 변화 없이 혈청 함유 시료 내에서도 가능케 할 수 있으며, 이는 DNA 프로브를 사용할 경우 달성할 수 없는 효과라는 점에서 본원 고유의 효과라 할 수 있다. 본원에 따라 PNA 및 산화그래핀을 조합하여 핵산 검출에 이용할 경우, 종래의 DNA 또는 RNA 프로브의 문제점들을 해소할 수 있으므로, 이에 따라 산화그래핀 기저 센서의 적용 분야를 더 넓힐 수 있다. 본원에 따른 이중 가닥 DNA 센서는 기술적으로 간단하고 다중화된 감지 포맷들과 호환가능하다는 이점도 있다. 본원의 핵산 검출 방법에서는 다양한 시료들이 적용될 수 있으며, 번거로운 다단계를 거칠 필요 없이 혼합 및 인큐베이션 후에 시료의 형광 이미지를 수득함으로써 표적 핵산의 정량적 다중 검출을 수행할 수 있다. 본원에 따른 이중 가닥 DNA 검출 플랫폼은 표적 DNA 서열에 따라 PNA 프로브의 서열을 변경함으로써 설정될 수 있으며, 이에 따라 어떠한 서열 한도도 없이 다양한 핵산 검출에 적용될 수 있다는 이점이 있다. 본원의 PNA 프로브를 사용하는 이러한 신규한 직접 산화그래핀-기저 핵산 검출 방법은, 바이러스 질환 및 유전 장애의 진단 및 개인 맞춤형 의료 분야에서 유용하게 적용될 수 있을 것이다.

실시예 7

온도에 따른 감지 효율을 확인하기 위해, 약 25℃ 내지 약 75℃의 다양한 온도 범위 하에서 형광 강도를 측정하였다.

let-7a miRNA(서열번호 19)를 표적으로 사용하고, 이의 염기서열에 대해서 다양한 위치에 단일 염기 변이가 존재하는 let-7c miRNA(서열번호 20) 및 let-7f miRNA(서열번호 21)를 비교군으로 선택하였다(표 4). 우선, 표적인 let-7a miRNA에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 PNA(서열번호 22)(표 4)에 FAM 형광염료를 부착한 후, 이를 1 X PBS 용액 내에서 표적 및 비교군으로 선택된 let-7 miRNA와 함께 실온에 두어 이중 가닥 형성을 유도하였다. 이때, 비선택적으로 이루어진 이중 가닥에 산화그래핀을 첨가한 후 5 분간 혼합물을 실온(약 25℃) 또는 다양한 온도 범위(약 55℃ 내지 약 75℃)에서 인큐베이션하였다. 마지막으로 2 분 내지 3 분 가량 실온에 방치하여 온도가 낮아진 혼합물들의 형광 신호를 측정함으로써 표적 miRNA와 비교군 miRNA 간의 차이를 확인하였다.

도 13의 (a)에서 볼 수 있는 바와 같이, 실온인 25℃에서는 완벽하게 일치되지 않는 표적에 대해서도 20% 이상의 신호가 검출되며 이는 적은 양의 표적 존재시 나타나는 신호와 구분이 불가능하다. 반면에, 고온으로 온도를 조절할 경우 불일치가 있는 이중 가닥만을 선택적으로 분리하고 산화그래핀으로의 흡착이 유도되어 5% 이하의 신호만 검출되었다(도 13의 (b)). 이는 형광 스펙트럼 분석을 통해 정확히 일치되는 표적만이 형광신호를 강하게 나타내는 것으로 다시 확인할 수 있다(도 13의 (b)). (구분 효율(%) = 100 * (F- F_scrambled/F_perfect _matched-F_scrambled))

도 14에서 볼 수 있는 바와 같이, 온도 조절에 따라 표적을 검출할 때 표적의 농도에 비례하는 형광 신호가 나타났다(도 14의 (a)). 단일 불일치를 구분 가능한 조건(70℃, 5 분)에서 검출 한계를 측정하였을 때 약 0.23 nM(LOD = 3.3(SD/S))이 나왔다(도 14의 (b)). 결과적으로 온도 조절 단계가 포함된 새로운 시스템을 활용하여 핵산 검출을 시도할 때 단일 염기 변이를 완벽하게 구분 가능함과 동시에 0.23 nM의 타겟 농도까지 정량적 검출이 가능함을 확인하였다.

실시예 8

자궁경부암 세포주인 HeLa의 용해물이 포함된 1 X PBS 용액 내에 표 4에 나타낸 바와 같은 miRNA를 넣음으로써 실제 진단 시 단백질 등을 포함한 체액 내 표적 검출 환경을 재현하였다. 이때, 하나의 검출용 시료당 10000 개의 Hela 세포 용해물 포함되어 있으며 다양한 종류의 단백질과 지질, 핵산 등이 표적 핵산과 함께 존재하고 있어, 실제 혈액이나 조직액 등의 환경과 유사하다. 본 단계에서는 다양한 생분자로 인한 PNA와 산화그래핀과의 상호작용 세기의 변화를 고려하여 산화그래핀의 양을 재조절함으로써 검출 조건을 수정하였다. 실시예 7과 동일한 방법으로 형광 염료가 부착된 PNA를 용해물과 표적 RNA가 함께 포함된 수용액에 두어 이중 가닥을 형성시킨 후 현 조건에서 최적화된 산화그래핀을 넣고 고온 처리를 5 분 동안 함으로써 정확하게 일치하는 염기 서열의 표적만을 특이적으로 검출하는 것이 가능하였다(도 15의 (a)). 이러한 환경에서의 검출한계는 0.81 nM 로 PBS 버퍼에서의 환경과 큰 변화가 없었다(도 15의 (b)).

실시예 9

하나의 염기 차이가 있는 두 표적을 한 수용액 내에서 정확하게 검출할 수 있는 다중 검지가 가능함을 확인하기 위해, 실시예 7에서와 같은 let-7a와 let-7c를 이용하여 한 수용액 내에서 다양한 표적의 조합에 따른 신호를 관찰하였다. 두 가지 표적 RNA에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 PNA(서열번호 22: 5' FAM-OO-AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC A 3'; 및 서열번호 23: 5' FAM- OO-AAC CAT ACA ACC TAC TAC CTC A 3')를 제조하고 각각 492 nm 및 587 nm에서 여기되어 518 nm(녹색), 및 608 nm(오렌지색)의 발산 최대치를 보이는 형광염료인 FAM과 ROX를 접합시켰다. let-7a와 let-7c miRNA의 다양한 조합을 포함하는 버퍼 수용액에 두 가지의 상기 PNA를 동량으로 첨가한 후 인큐베이션하여 먼저 비선택적 이중 가닥을 형성시켰다. 그런 다음, 산화그래핀을 참가한 후 고온 처리를 5 분간 한 후 실온에 방치하였다. 결과적으로, 도 16에서 볼 수 있는 바와 같이, 해당 표적이 포함된 경우에만 신호가 나타나는 것을 확인하였다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> METHOD FOR DETECTING NUCLEIC ACID AND KIT FOR DETECTING NUCLEIC ACID <130> DP20150312KR <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA strand <400> 1 ataagcgtaa cttccctcaa a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA strand <400> 2 tttgagggaa gttacgctta t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA strand <400> 3 ataagcgtaa cttccctcaa a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA strand <400> 4 tttgagggaa gatacgctta t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA strand <400> 5 ataagcgaat ctaccctcaa a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA strand <400> 6 tttgagggta gattcgctta t 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA strand <400> 7 tagcttatca gactgatgtt ga 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA strand <400> 8 tcaacatcag tctgataagc ta 22 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> HVA <400> 9 ttagagttgc atgga 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> HVA <400> 10 tccatgcaac tctaa 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> HIV <400> 11 taacatgacc tggat 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> HIV <400> 12 atccaggtca tgtta 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> HVB <400> 13 atggatgatg tggta 15 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> HVB <400> 14 taccacatca tccat 15 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 15 tttgagggaa gttacgctta t 21 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 16 tccatgcaac tctaa 15 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 17 atccaggtca tgtta 15 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 18 taccacatca tccat 15 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA <400> 19 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 20 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let-7 miRNA <400> 20 ugagguagua gguuguaugg uu 22 <210> 21 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let-7 miRNA <400> 21 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 22 aactatacaa cctactacct ca 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 22 aaccatacaa cctactacct ca 22

Claims

표적 핵산을 포함하는 시료를 준비하는 단계;
형광 물질을 함유하며, 상기 표적 핵산에 상보적인 PNA 프로브를 상기 시료에 첨가하여 혼합물을 수득하는 단계; 및
상기 혼합물에 산화그래핀을 첨가한 후에 열처리하는 단계
를 포함하는,
핵산의 검출 방법으로서,
상기 PNA 프로브는 서로 상이한 형광 물질을 함유하는 두 종류 이상의 PNA 프로브를 포함하고,
상기 표적 핵산은 상기 두 종류 이상의 PNA 프로브 각각과 결합하는 두 종류 이상의 핵산을 포함함으로써, 서로 상이한 핵산을 다중 검출할 수 있는 것이며,
상기 열처리는 50℃ 내지 80℃의 온도 범위에서 수행되는 것이고,
상기 열처리에 의하여 상기 핵산 중 단일 불일치된 핵산과 미스매치된 이중 가닥을 배제하여 상기 표적 핵산을 검출하는 것이고,
상기 형광 물질의 발광은 실시간으로 측정되어 상기 표적 핵산이 실시간으로 검출되는 것이고,
상기 표적 핵산을 포함하는 시료는 혈액, 혈청, 소변, 타액, 혈장 또는 체액을 포함하는 것인,
핵산의 검출 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 표적 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산을 포함하는 것인, 핵산의 검출 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 표적 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함하는 것인, 핵산의 검출 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 상기 표적 핵산과 혼성화되는 것인, 핵산의 검출 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 표적 핵산과 혼성화되지 못한 잔여 PNA 프로브 및 잔여 핵산이 상기 산화그래핀에 흡착되는 것인, 핵산의 검출 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 산화그래핀에 흡착된 PNA 프로브에 포함된 형광 물질이 ??칭(quenching)되는 것인, 핵산의 검출 방법.
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제 1 항에 있어서,
상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태인, 핵산의 검출 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 단일 가닥 PNA를 포함하는 것인, 핵산의 검출 방법.
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형광 물질을 함유하며, 표적 핵산에 상보적인 PNA 프로브; 및,
산화그래핀을 함유하는 용액
을 포함하는, 핵산 검출용 키트로서,
상기 핵산 검출용 키트는 제 1 항에 따른 핵산의 검출 방법에 의하여 사용되는 것이며,
상기 PNA 프로브는 두 종류 이상의 서로 상이한 표적 핵산의 다중 검출을 위해, 서로 상이한 형광 물질을 함유하는 두 종류 이상의 상보적인 PNA 프로브를 포함하며,
상기 두 종류 이상의 서로 상이한 표적 핵산은 각각 상보적인 PNA 프로브와 결합할 수 있는 것인,
핵산 검출용 키트.
제 14 항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 단일 가닥 PNA를 포함하는 것인, 핵산 검출용 키트.
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제 14 항에 있어서,
상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태인 것인, 핵산 검출용 키트.