JP2002085067A - ヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット - Google Patents
ヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素を分別
して定量する新しい測定技術及びそのためのプライマー
対及びプローブを提供することである。 【解決手段】 上記硫酸抱合に関与する酵素の測定に用
いられるプローブであって、遺伝子の特定領域にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；該
プローブ、及び遺伝子の特定領域にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリ
バースプライマーとのプライマー対の組合せから選ばれ
る、硫酸抱合に関与する酵素の測定キット；並びに該測
定キットを用いる、硫酸抱合に関与する酵素の測定方法
である。
して定量する新しい測定技術及びそのためのプライマー
対及びプローブを提供することである。 【解決手段】 上記硫酸抱合に関与する酵素の測定に用
いられるプローブであって、遺伝子の特定領域にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；該
プローブ、及び遺伝子の特定領域にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリ
バースプライマーとのプライマー対の組合せから選ばれ
る、硫酸抱合に関与する酵素の測定キット；並びに該測
定キットを用いる、硫酸抱合に関与する酵素の測定方法
である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトにおける硫酸
抱合に関与する酵素の測定方法及びそのためのプローブ
及びキットに関する。
抱合に関与する酵素の測定方法及びそのためのプローブ
及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】薬物代謝第II相反応の一種である硫酸抱
合は、硫酸転移酵素（sulfotransferase）によって触媒
されることはよく知られている。
合は、硫酸転移酵素（sulfotransferase）によって触媒
されることはよく知られている。
【０００３】ところで、新薬を開発する上で、該新薬を
投与した際の硫酸抱合に関与する酵素の動き（発現量の
増減）を把握することは重要である。何故なら、硫酸抱
合に関与する酵素の変動が判らないと、該新薬と併用さ
れる併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤や他
の摂取物による新薬の効力や副作用の増減が予測でき
ず、該新薬の安全性を確認することができないからであ
る。
投与した際の硫酸抱合に関与する酵素の動き（発現量の
増減）を把握することは重要である。何故なら、硫酸抱
合に関与する酵素の変動が判らないと、該新薬と併用さ
れる併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤や他
の摂取物による新薬の効力や副作用の増減が予測でき
ず、該新薬の安全性を確認することができないからであ
る。
【０００４】そこで、上記新薬開発等の分野において
は、かかるヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素に関す
る情報、殊に之等各分子種を区別して測定できる測定技
術の開発が、要望されている。かかる技術が開発できれ
ば、例えば、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時にお
ける影響等が容易に把握でき、該新薬の副作用に関する
有用な情報を得ることができ、かくして新薬の安全性を
確保することができる。
は、かかるヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素に関す
る情報、殊に之等各分子種を区別して測定できる測定技
術の開発が、要望されている。かかる技術が開発できれ
ば、例えば、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時にお
ける影響等が容易に把握でき、該新薬の副作用に関する
有用な情報を得ることができ、かくして新薬の安全性を
確保することができる。
【０００５】一方、ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、
例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、
コンペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のｍＲＮＡの検
出、定量に威力を発揮している。
（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、
例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、
コンペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のｍＲＮＡの検
出、定量に威力を発揮している。
【０００６】近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量
検出法が確立された（Taq Man PCR(Genome Res., 6(1
0), 986 (1996)), ABI PRISMTM Sequence Detection Sy
stem(Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標
識プローブ（TaqMan prove）を用いて核酸を測定する方
法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター
色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標
識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状
態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進
行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エ
キソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端
から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター
色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これによ
り、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲ
ＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍
光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の
低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、ク
エンチャー色素により制御されていたリポーター色素の
蛍光強度が増加し、かくして、該蛍光強度の増加を測定
することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選
択的に定量検出できるのである。この方法によれば、Ｐ
ＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動し
て、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要とな
り、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利
点がある。
検出法が確立された（Taq Man PCR(Genome Res., 6(1
0), 986 (1996)), ABI PRISMTM Sequence Detection Sy
stem(Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標
識プローブ（TaqMan prove）を用いて核酸を測定する方
法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター
色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標
識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状
態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進
行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エ
キソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端
から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター
色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これによ
り、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲ
ＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍
光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の
低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、ク
エンチャー色素により制御されていたリポーター色素の
蛍光強度が増加し、かくして、該蛍光強度の増加を測定
することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選
択的に定量検出できるのである。この方法によれば、Ｐ
ＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動し
て、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要とな
り、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利
点がある。
【０００７】しかして、一般に、臨床検査センター等で
臨床検査を行う場合には、非常に多数の検体について限
られた時間内に検査をする必要があり、検査を効率良く
行い得る手法の開発が要望されており、上記リアルタイ
ム検出法は、この要望に合致するものとして期待でき
る。
臨床検査を行う場合には、非常に多数の検体について限
られた時間内に検査をする必要があり、検査を効率良く
行い得る手法の開発が要望されており、上記リアルタイ
ム検出法は、この要望に合致するものとして期待でき
る。
【０００８】本発明者らは、上記ＰＣＲによるリアルタ
イム検出法に着目し、これがヒト硫酸抱合に関与する酵
素の検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一
のＰＣＲ条件で上記各酵素を区別して測定、検出できる
との着想から、鋭意研究を重ねた。
イム検出法に着目し、これがヒト硫酸抱合に関与する酵
素の検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一
のＰＣＲ条件で上記各酵素を区別して測定、検出できる
との着想から、鋭意研究を重ねた。
【０００９】しかるに、現在知られている化学物質を代
謝するヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素は、前述し
たとおり約２０種にも及び、それぞれのｍＲＮＡの配列
は知られているものの、之等をターゲット遺伝子とし
て、互いに重複する配列部分を有さず、しかも同一ＰＣ
Ｒ条件で充分に増幅し得、更に、該ターゲット遺伝子の
特定位置にハイブリダイズし得る各プライマー対として
のオリゴヌクレオチドの検索自体困難であると考えられ
た。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、
同一ＰＣＲ条件下に之等のプライマーよりも早くハイブ
リダイズし得、しかもヒトにおける硫酸抱合に関与する
各酵素に対して特異的なプローブの構築もまた、同様に
困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既
知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔ
ｍ）の計算によりある程度推定することはできるもの
の、この推定によって選択したプライマーとプローブと
の組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもた
らすわけではないことが知られていることより、現在知
られている全てのヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素
について、之等を同時に区別して測定可能な、上記ＰＣ
Ｒによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプロー
ブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大
な実験等が必要となると予想された。
謝するヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素は、前述し
たとおり約２０種にも及び、それぞれのｍＲＮＡの配列
は知られているものの、之等をターゲット遺伝子とし
て、互いに重複する配列部分を有さず、しかも同一ＰＣ
Ｒ条件で充分に増幅し得、更に、該ターゲット遺伝子の
特定位置にハイブリダイズし得る各プライマー対として
のオリゴヌクレオチドの検索自体困難であると考えられ
た。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、
同一ＰＣＲ条件下に之等のプライマーよりも早くハイブ
リダイズし得、しかもヒトにおける硫酸抱合に関与する
各酵素に対して特異的なプローブの構築もまた、同様に
困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既
知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔ
ｍ）の計算によりある程度推定することはできるもの
の、この推定によって選択したプライマーとプローブと
の組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもた
らすわけではないことが知られていることより、現在知
られている全てのヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素
について、之等を同時に区別して測定可能な、上記ＰＣ
Ｒによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプロー
ブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大
な実験等が必要となると予想された。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
における硫酸抱合に関与する酵素のＰＣＲによる測定
法、特にリアルタイム検出法の確立と、そのためのプロ
ーブ及びプライマー対を提供することにある。
における硫酸抱合に関与する酵素のＰＣＲによる測定
法、特にリアルタイム検出法の確立と、そのためのプロ
ーブ及びプライマー対を提供することにある。
【００１１】本発明者らは、上記課題を解決すべくヒト
における硫酸抱合に関与する酵素について、更に多大な
実験、研究を繰返し行った結果、１１種類の各酵素に対
する目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供す
ることに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに
至った
における硫酸抱合に関与する酵素について、更に多大な
実験、研究を繰返し行った結果、１１種類の各酵素に対
する目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供す
ることに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに
至った
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、ヒトに
おける硫酸抱合に関与する酵素の測定に用いられるプロ
ーブであって、下記(1)〜(11)の各領域のそれぞれにハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれること
を特徴とするプローブ；特にリポーター色素とクエンチ
ャー色素とが結合している該プローブ；塩基配列の長さ
が２０〜４０である該プローブ；配列番号１〜配列番号
１１に示される配列のいずれかを含む該プローブ；並び
に配列番号１〜配列番号１１に示される配列のいずれか
である該プローブが提供される。 (1)ＣＨＳＴ１遺伝子の８８５〜９１１の領域 (2)ＣＨＳＴ３遺伝子の１７４〜１９７の領域 (3)ＣＨＳＴ４遺伝子の１００３〜１０３２の領域 (4)ＣＨＳＴ５遺伝子の３２２〜３４６の領域 (5)ＣＳＴ遺伝子の７３７〜７６５の領域 (6)ＨＮＫ−１ＳＴ遺伝子の７０３〜７３２の領域 (7)ＳＵＬＴ２Ａ１遺伝子の２９９〜３２５の領域 (8)ＳＵＬＴ２Ｂ１遺伝子の３５８〜３８２の領域 (9)ＳＵＬＴＸ３遺伝子の５５４〜５８２の領域 (10)ＳＴＥ遺伝子の４５１〜４７８の領域 (11)ＴＰＳＴ２遺伝子の６５２〜６７７の領域
おける硫酸抱合に関与する酵素の測定に用いられるプロ
ーブであって、下記(1)〜(11)の各領域のそれぞれにハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれること
を特徴とするプローブ；特にリポーター色素とクエンチ
ャー色素とが結合している該プローブ；塩基配列の長さ
が２０〜４０である該プローブ；配列番号１〜配列番号
１１に示される配列のいずれかを含む該プローブ；並び
に配列番号１〜配列番号１１に示される配列のいずれか
である該プローブが提供される。 (1)ＣＨＳＴ１遺伝子の８８５〜９１１の領域 (2)ＣＨＳＴ３遺伝子の１７４〜１９７の領域 (3)ＣＨＳＴ４遺伝子の１００３〜１０３２の領域 (4)ＣＨＳＴ５遺伝子の３２２〜３４６の領域 (5)ＣＳＴ遺伝子の７３７〜７６５の領域 (6)ＨＮＫ−１ＳＴ遺伝子の７０３〜７３２の領域 (7)ＳＵＬＴ２Ａ１遺伝子の２９９〜３２５の領域 (8)ＳＵＬＴ２Ｂ１遺伝子の３５８〜３８２の領域 (9)ＳＵＬＴＸ３遺伝子の５５４〜５８２の領域 (10)ＳＴＥ遺伝子の４５１〜４７８の領域 (11)ＴＰＳＴ２遺伝子の６５２〜６７７の領域
【００１３】また、本発明によれば、ヒトにおける硫酸
抱合に関与する酵素をコードする遺伝子の下記各領域に
それぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからな
るフォワードプライマーとリバースプライマーとのプラ
イマー対、及び上記両プライマーに挟まれた下記領域に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプロー
ブの組合せから選ばれる、下記(1)〜(11)の、ヒトにお
ける硫酸抱合に関与する酵素の測定キット；特にプロー
ブが更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合さ
せたものである上記測定キットが提供される。 (1)プライマー対；ＣＨＳＴ１遺伝子の830-851領域及び
953-931領域、プローブ；885-911領域 (2)プライマー対；ＣＨＳＴ３遺伝子の149-169領域及び
231-207領域、プローブ；174-197領域 (3)プライマー対；ＣＨＳＴ４遺伝子の980-1001領域及
び1079-1059領域、プローブ；1003-1032領域 (4)プライマー対；ＣＨＳＴ５遺伝子の292-313領域及び
370-349領域、プローブ；322-346領域 (5)プライマー対；ＣＳＴ遺伝子の628-648領域及び827-
806領域、プローブ；737-765領域 (6)プライマー対；ＨＮＫ−１ＳＴ遺伝子の669-690領域
及び950-929領域、プローブ；703-732領域 (7)プライマー対；ＳＵＬＴ２Ａ１遺伝子の277-297領域
及び476-455領域、プローブ；299-325領域 (8)プライマー対；ＳＵＬＴ２Ｂ１遺伝子の331-351領域
及び538-517領域、プローブ；358-382領域 (9)プライマー対；ＳＵＬＴＸ３遺伝子の478-498領域及
び778-758領域、プローブ；554-582領域 (10)プライマー対；ＳＴＥ遺伝子の431-449領域及び560
-539領域、プローブ；451-478領域 (11)プライマー対；ＴＰＳＴ２遺伝子の604-624領域及
び767-746領域、プローブ；652-677領域
抱合に関与する酵素をコードする遺伝子の下記各領域に
それぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからな
るフォワードプライマーとリバースプライマーとのプラ
イマー対、及び上記両プライマーに挟まれた下記領域に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプロー
ブの組合せから選ばれる、下記(1)〜(11)の、ヒトにお
ける硫酸抱合に関与する酵素の測定キット；特にプロー
ブが更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合さ
せたものである上記測定キットが提供される。 (1)プライマー対；ＣＨＳＴ１遺伝子の830-851領域及び
953-931領域、プローブ；885-911領域 (2)プライマー対；ＣＨＳＴ３遺伝子の149-169領域及び
231-207領域、プローブ；174-197領域 (3)プライマー対；ＣＨＳＴ４遺伝子の980-1001領域及
び1079-1059領域、プローブ；1003-1032領域 (4)プライマー対；ＣＨＳＴ５遺伝子の292-313領域及び
370-349領域、プローブ；322-346領域 (5)プライマー対；ＣＳＴ遺伝子の628-648領域及び827-
806領域、プローブ；737-765領域 (6)プライマー対；ＨＮＫ−１ＳＴ遺伝子の669-690領域
及び950-929領域、プローブ；703-732領域 (7)プライマー対；ＳＵＬＴ２Ａ１遺伝子の277-297領域
及び476-455領域、プローブ；299-325領域 (8)プライマー対；ＳＵＬＴ２Ｂ１遺伝子の331-351領域
及び538-517領域、プローブ；358-382領域 (9)プライマー対；ＳＵＬＴＸ３遺伝子の478-498領域及
び778-758領域、プローブ；554-582領域 (10)プライマー対；ＳＴＥ遺伝子の431-449領域及び560
-539領域、プローブ；451-478領域 (11)プライマー対；ＴＰＳＴ２遺伝子の604-624領域及
び767-746領域、プローブ；652-677領域
【００１４】上記キットを構成するプライマー対とプロ
ーブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下
記(1)〜(11)から選ばれる各配列番号で示される配列を
含むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列の
ものを挙げることができる。 (1)プライマー対；配列番号１２及び１３、プローブ；
配列番号１ (2)プライマー対；配列番号１４及び１５、プローブ；
配列番号２ (3)プライマー対；配列番号１６及び１７、プローブ；
配列番号３ (4)プライマー対；配列番号１８及び１９、プローブ；
配列番号４ (5)プライマー対；配列番号２０及び２１、プローブ；
配列番号５ (6)プライマー対；配列番号２２及び２３、プローブ；
配列番号６ (7)プライマー対；配列番号２４及び２５、プローブ；
配列番号７ (8)プライマー対；配列番号２６及び２７、プローブ；
配列番号８ (9)プライマー対；配列番号２８及び２９、プローブ；
配列番号９ (10)プライマー対；配列番号３０及び３１、プローブ；
配列番号１０ (11)プライマー対；配列番号３２及び３３、プローブ；
配列番号１１
ーブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下
記(1)〜(11)から選ばれる各配列番号で示される配列を
含むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列の
ものを挙げることができる。 (1)プライマー対；配列番号１２及び１３、プローブ；
配列番号１ (2)プライマー対；配列番号１４及び１５、プローブ；
配列番号２ (3)プライマー対；配列番号１６及び１７、プローブ；
配列番号３ (4)プライマー対；配列番号１８及び１９、プローブ；
配列番号４ (5)プライマー対；配列番号２０及び２１、プローブ；
配列番号５ (6)プライマー対；配列番号２２及び２３、プローブ；
配列番号６ (7)プライマー対；配列番号２４及び２５、プローブ；
配列番号７ (8)プライマー対；配列番号２６及び２７、プローブ；
配列番号８ (9)プライマー対；配列番号２８及び２９、プローブ；
配列番号９ (10)プライマー対；配列番号３０及び３１、プローブ；
配列番号１０ (11)プライマー対；配列番号３２及び３３、プローブ；
配列番号１１
【００１５】また、上記各セットはそれぞれ以下の硫酸
抱合に関与する酵素の測定用であることができる。 (1)のセット；ＣＨＳＴ１測定用 (2)のセット；ＣＨＳＴ３測定用 (3)のセット；ＣＨＳＴ４測定用 (4)のセット；ＣＨＳＴ５測定用 (5)のセット；ＣＳＴ測定用 (6)のセット；ＨＮＫ−１ＳＴ測定用 (7)のセット；ＳＵＬＴ２Ａ１測定用 (8)のセット；ＳＵＬＴ２Ｂ１測定用 (9)のセット；ＳＵＬＴＸ３測定用 (10)のセット；ＳＴＥ測定用 (11)のセット；ＴＰＳＴ２測定用 本発明によれば、更にヒトにおける硫酸抱合に関与する
酵素の遺伝子を含む検体について、上記いずれかに記載
の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、
ＲＴ−ＰＣＲを含む）を行い、用いたプローブの加水分
解の有無を測定することを特徴とするヒトにおける硫酸
抱合に関与する酵素の測定方法、特に上記加水分解の有
無が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされ
る上記測定方法が提供される。
抱合に関与する酵素の測定用であることができる。 (1)のセット；ＣＨＳＴ１測定用 (2)のセット；ＣＨＳＴ３測定用 (3)のセット；ＣＨＳＴ４測定用 (4)のセット；ＣＨＳＴ５測定用 (5)のセット；ＣＳＴ測定用 (6)のセット；ＨＮＫ−１ＳＴ測定用 (7)のセット；ＳＵＬＴ２Ａ１測定用 (8)のセット；ＳＵＬＴ２Ｂ１測定用 (9)のセット；ＳＵＬＴＸ３測定用 (10)のセット；ＳＴＥ測定用 (11)のセット；ＴＰＳＴ２測定用 本発明によれば、更にヒトにおける硫酸抱合に関与する
酵素の遺伝子を含む検体について、上記いずれかに記載
の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、
ＲＴ−ＰＣＲを含む）を行い、用いたプローブの加水分
解の有無を測定することを特徴とするヒトにおける硫酸
抱合に関与する酵素の測定方法、特に上記加水分解の有
無が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされ
る上記測定方法が提供される。
【００１６】より詳しくは、フォーワードプライマー及
びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター
色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟ま
れた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを
用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤ
ＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を行うことによって、ヒトにおける硫酸抱合に関与
する酵素の遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提
供される。
びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター
色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟ま
れた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを
用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤ
ＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を行うことによって、ヒトにおける硫酸抱合に関与
する酵素の遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提
供される。
【００１７】本発明に係わるヒトにおける硫酸抱合に関
与する酵素のリアルタイム検出方法は、同一ＰＣＲ乃至
ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速
に、各種酵素を分別定量できるものであり、その確立
は、臨床分野、医薬品分野において非常に有益である。
例えば、本発明方法によって、医薬品開発における動態
試験において重要な位置を占める薬物代謝の硫酸抱合に
関与する酵素のヒト試料中でのｍＲＮＡの発現を容易に
定量することができる。これによって、医薬品等の化学
物質に曝露された場合の硫酸抱合に関与する各酵素の変
化を知ることができる。
与する酵素のリアルタイム検出方法は、同一ＰＣＲ乃至
ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速
に、各種酵素を分別定量できるものであり、その確立
は、臨床分野、医薬品分野において非常に有益である。
例えば、本発明方法によって、医薬品開発における動態
試験において重要な位置を占める薬物代謝の硫酸抱合に
関与する酵素のヒト試料中でのｍＲＮＡの発現を容易に
定量することができる。これによって、医薬品等の化学
物質に曝露された場合の硫酸抱合に関与する各酵素の変
化を知ることができる。
【００１８】また、手術で摘出した組織やバイオプシー
により摘出した組織中の硫酸抱合に関与する酵素のｍＲ
ＮＡ発現を見る上で、迅速且つ多種の試料を処理でき、
また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可能で
ある。
により摘出した組織中の硫酸抱合に関与する酵素のｍＲ
ＮＡ発現を見る上で、迅速且つ多種の試料を処理でき、
また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可能で
ある。
【００１９】更に、特定の硫酸抱合に関与する酵素にお
いては、肝臓、腎臓等での酵素誘導などによる発現量の
変化が血液中（血液に含まれる核を有する細胞）の値の
変化と相関する可能性が考えられるが、この血液中の発
現量は小さく、測定には多くの血液を必要とする。しか
し、本発明者の設計したプライマーとプローブを用いれ
ば少ないサンプルで測定が可能である機器での測定が可
能であり、血液中の発現量を測定することに有用であ
る。また、特定の硫酸抱合に関与する酵素においては、
肝臓、腎臓等での酵素誘導などによる発現量の変化が唾
液中など分泌液中に含まれる核を有する細胞の値の変化
と相関する可能性が考えられるが、この唾液中など分泌
液中に含まれる核を有する細胞中の発現量は小さく、測
定には多くの唾液などの分泌液を必要とする。しかし、
本発明者の設計したプライマーとプローブを用いれば少
ないサンプルで測定が可能である機器での測定が可能で
あり、唾液中などの発現量を測定することに有用であ
る。
いては、肝臓、腎臓等での酵素誘導などによる発現量の
変化が血液中（血液に含まれる核を有する細胞）の値の
変化と相関する可能性が考えられるが、この血液中の発
現量は小さく、測定には多くの血液を必要とする。しか
し、本発明者の設計したプライマーとプローブを用いれ
ば少ないサンプルで測定が可能である機器での測定が可
能であり、血液中の発現量を測定することに有用であ
る。また、特定の硫酸抱合に関与する酵素においては、
肝臓、腎臓等での酵素誘導などによる発現量の変化が唾
液中など分泌液中に含まれる核を有する細胞の値の変化
と相関する可能性が考えられるが、この唾液中など分泌
液中に含まれる核を有する細胞中の発現量は小さく、測
定には多くの唾液などの分泌液を必要とする。しかし、
本発明者の設計したプライマーとプローブを用いれば少
ないサンプルで測定が可能である機器での測定が可能で
あり、唾液中などの発現量を測定することに有用であ
る。
【００２０】以下、本発明方法に利用するプローブ及び
プライマー対につき詳述すれば、之等各プローブ及びプ
ライマーは、上述した通り、硫酸抱合に関与する酵素の
遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドから選択される。
プライマー対につき詳述すれば、之等各プローブ及びプ
ライマーは、上述した通り、硫酸抱合に関与する酵素の
遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドから選択される。
【００２１】ここで「ハイブリダイズする」とは、後述
するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズす
ることをいう。
するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズす
ることをいう。
【００２２】本発明に係わるプローブ及びプライマーに
共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基
対の長さであること、プライマーとプローブができる限
り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及
びＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であるこ
と、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことを挙
げることができる。また、その他の本発明プローブにみ
られる要件としてはＴｍ値が７０℃前後であることを挙
げることができ、同様にプライマーにはＴｍ値が６０℃
前後であることを挙げることができる。
共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基
対の長さであること、プライマーとプローブができる限
り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及
びＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であるこ
と、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことを挙
げることができる。また、その他の本発明プローブにみ
られる要件としてはＴｍ値が７０℃前後であることを挙
げることができ、同様にプライマーにはＴｍ値が６０℃
前後であることを挙げることができる。
【００２３】硫酸抱合に関与する各酵素のｍＲＮＡ配列
は公知であり、それぞれジーンバンク（GenBank）に以
下の登録番号で登録されている。 (1)ＣＨＳＴ１遺伝子；ＮＭ＿００３６５４ (2)ＣＨＳＴ３遺伝子；ＮＭ＿００４２７３ (3)ＣＨＳＴ４遺伝子；ＮＭ＿００５７６９ (4)ＣＨＳＴ５遺伝子；ＮＭ＿０１２１２６ (5)ＣＳＴ遺伝子；ＮＭ＿００４８６１ (6)ＨＮＫ−１ＳＴ遺伝子；ＮＭ＿００４８５４ (7)ＳＵＬＴ２Ａ１遺伝子；ＮＭ＿００３１６７ (8)ＳＵＬＴ２Ｂ１遺伝子；ＮＭ＿００４６０５ (9)ＳＵＬＴＸ３遺伝子；ＮＭ＿０１４３５１ (10)ＳＴＥ遺伝子；ＮＭ＿００５４２０ (11)ＴＰＳＴ２遺伝子；ＮＭ＿００３５９５
は公知であり、それぞれジーンバンク（GenBank）に以
下の登録番号で登録されている。 (1)ＣＨＳＴ１遺伝子；ＮＭ＿００３６５４ (2)ＣＨＳＴ３遺伝子；ＮＭ＿００４２７３ (3)ＣＨＳＴ４遺伝子；ＮＭ＿００５７６９ (4)ＣＨＳＴ５遺伝子；ＮＭ＿０１２１２６ (5)ＣＳＴ遺伝子；ＮＭ＿００４８６１ (6)ＨＮＫ−１ＳＴ遺伝子；ＮＭ＿００４８５４ (7)ＳＵＬＴ２Ａ１遺伝子；ＮＭ＿００３１６７ (8)ＳＵＬＴ２Ｂ１遺伝子；ＮＭ＿００４６０５ (9)ＳＵＬＴＸ３遺伝子；ＮＭ＿０１４３５１ (10)ＳＴＥ遺伝子；ＮＭ＿００５４２０ (11)ＴＰＳＴ２遺伝子；ＮＭ＿００３５９５
【００２４】本明細書において、各酵素の特定領域の表
示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の配
列に従うものである。
示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の配
列に従うものである。
【００２５】之等各プライマー及びプローブ用のオリゴ
ヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、
通常１５〜５０個、好ましくは２０〜４０個の範囲にあ
るのがよい。之等プライマー及びプローブのヌクレオチ
ド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮ
Ａにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さす
ぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
ヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、
通常１５〜５０個、好ましくは２０〜４０個の範囲にあ
るのがよい。之等プライマー及びプローブのヌクレオチ
ド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮ
Ａにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さす
ぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００２６】プライマー及びプローブの特定のヌクレオ
チド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとお
り、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号１〜１１（プ
ローブの場合）並びに配列番号１２〜３３（プライマー
の場合）に示されるとおりである。
チド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとお
り、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号１〜１１（プ
ローブの場合）並びに配列番号１２〜３３（プライマー
の場合）に示されるとおりである。
【００２７】尚、例えば２０ヌクレオチドからなるプラ
イマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッ
チが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマー
として又は検出用プローブとして機能し得ることが知ら
れている。従って本発明プライマー及びプローブもま
た、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定
されず、これをその一部として含むものや、この配列中
の例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失及び／又
は付加による修飾のなされた配列を包含することができ
る。
イマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッ
チが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマー
として又は検出用プローブとして機能し得ることが知ら
れている。従って本発明プライマー及びプローブもま
た、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定
されず、これをその一部として含むものや、この配列中
の例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失及び／又
は付加による修飾のなされた配列を包含することができ
る。
【００２８】上記本発明プローブ及びプライマーとして
の各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、
例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等
を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌ
クレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリ
ッジ等を用いて精製することもできる。
の各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、
例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等
を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌ
クレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリ
ッジ等を用いて精製することもできる。
【００２９】本発明のリアルタイム検出用プローブは、
その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合し
ており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー
色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光
の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー
は、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合
レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作
用を有するものであることができる。該レポーター色素
の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイ
ン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレ
ッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジ
クロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、
ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥ
Ｘ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、
例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（Ｔ
ＡＭＲＡ）等が挙げられる。
その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合し
ており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー
色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光
の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー
は、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合
レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作
用を有するものであることができる。該レポーター色素
の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイ
ン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレ
ッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジ
クロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、
ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥ
Ｘ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、
例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（Ｔ
ＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００３０】本発明プローブは、前記特定配列のプロー
ブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチ
ャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプ
ローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーと
し、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形
で結合させることができる。また、３′側には、下に示
す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を
結合させ得る。
ブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチ
ャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプ
ローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーと
し、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形
で結合させることができる。また、３′側には、下に示
す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を
結合させ得る。
【００３１】
【化１】
【００３２】以下、本発明プライマー対及びプローブを
利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法につき詳述す
る。
利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法につき詳述す
る。
【００３３】本発明方法は、前述した本発明プライマー
対及びプローブを利用することを必須として、他は公知
のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参
照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)
参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PC
R, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, App
lied Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施す
ることができる。
対及びプローブを利用することを必須として、他は公知
のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参
照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)
参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PC
R, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, App
lied Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施す
ることができる。
【００３４】該方法は、特に本発明が対象とする硫酸抱
合に関与する各酵素の発現量の測定方法として、ｍＲＮ
Ａを測定する場合に有用である。この場合、特定酵素を
発現している生体組織を採取し、常法に従って全ＲＮＡ
を抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に
従って合成した後、本発明プライマー対とプローブとを
用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全Ｒ
ＮＡを抽出後、本発明プライマーとプローブとを用い
て、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともできる。
合に関与する各酵素の発現量の測定方法として、ｍＲＮ
Ａを測定する場合に有用である。この場合、特定酵素を
発現している生体組織を採取し、常法に従って全ＲＮＡ
を抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に
従って合成した後、本発明プライマー対とプローブとを
用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全Ｒ
ＮＡを抽出後、本発明プライマーとプローブとを用い
て、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともできる。
【００３５】ＰＣＲ反応、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的
には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件
も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に異
なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件
を好ましく採用できる。
には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件
も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に異
なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件
を好ましく採用できる。
【００３６】検出も、基本的には常法に従って、例え
ば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射さ
れる蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行
なうことができる。
ば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射さ
れる蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行
なうことができる。
【００３７】かくして、本発明方法の実施によって、所
期の硫酸抱合に関与する各酵素を容易且つ迅速に、しか
も各酵素毎に区別して測定、検出することができる。
期の硫酸抱合に関与する各酵素を容易且つ迅速に、しか
も各酵素毎に区別して測定、検出することができる。
【００３８】本発明は更に、上記方法の実施のためのキ
ットをも提供する。このキットは上記プライマー対及び
プローブを含んでなる。本発明キットには、対照として
使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定する
ためのプライマー対及びプローブを更に含んでいてもよ
い。
ットをも提供する。このキットは上記プライマー対及び
プローブを含んでなる。本発明キットには、対照として
使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定する
ためのプライマー対及びプローブを更に含んでいてもよ
い。
【００３９】本発明方法によれば、硫酸抱合に関与する
各酵素の遺伝子をその酵素毎に分別して測定、検出でき
るため、これによって、硫酸抱合に関与する各酵素の定
量が迅速に、精度よく行なうことができる。かくして、
新薬の他剤との相互作用や配合禁忌等に関連する基礎デ
ーターを効率よく得ることができる。
各酵素の遺伝子をその酵素毎に分別して測定、検出でき
るため、これによって、硫酸抱合に関与する各酵素の定
量が迅速に、精度よく行なうことができる。かくして、
新薬の他剤との相互作用や配合禁忌等に関連する基礎デ
ーターを効率よく得ることができる。
【００４０】
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため試験
例を挙げる。
例を挙げる。
【００４１】
【試験例】リアルタイム検出法による検量線の作成 (1)試験方法 本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣ
Ｒ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応
を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できる
ものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反
応とを行なうことができる。
Ｒ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応
を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できる
ものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反
応とを行なうことができる。
【００４２】本定量の原理は、隣接した２種類の蛍光色
素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長
と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間
で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用した
ものである。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端
に結合させたプローブ（TaqMan probe）がＰＣＲで増幅
した特定のＰ４５０分子種由来のｃＤＮＡにハイブリダ
イゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始ま
り、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エ
ンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが
加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエンチャー
色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制
されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、この蛍
光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するた
め、これをＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望
の定量が可能となる。
素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長
と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間
で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用した
ものである。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端
に結合させたプローブ（TaqMan probe）がＰＣＲで増幅
した特定のＰ４５０分子種由来のｃＤＮＡにハイブリダ
イゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始ま
り、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エ
ンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが
加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエンチャー
色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制
されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、この蛍
光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するた
め、これをＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望
の定量が可能となる。
【００４３】本試験では、プローブの５’末端側にはリ
ポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチ
ャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。之等各色素の結
合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献
記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）に従っ
て行なった。
ポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチ
ャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。之等各色素の結
合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献
記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）に従っ
て行なった。
【００４４】また、各プライマー及びプローブとしての
オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢ
Ｉ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮ
ＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。
オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢ
Ｉ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮ
ＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。
【００４５】検体ＲＮＡとしては、成人の脳、成人の腎
臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プ
ールより精製された全ＲＮＡを用いた。尚、之等の全Ｒ
ＮＡはいずれもクローンテック社（Clontech Laborator
ies, Inc.）より購入した。
臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プ
ールより精製された全ＲＮＡを用いた。尚、之等の全Ｒ
ＮＡはいずれもクローンテック社（Clontech Laborator
ies, Inc.）より購入した。
【００４６】成人の脳、成人の腎臓、成人の肺、成人の
小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プールより精製された全
ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、２０μｇ／
ｍＬとした。その後、これら６種類を等量ずつ混合し、
検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイース
トｔＲＮＡ（Yeast tRNA, GIBCO社製）を用いて、５倍
公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プールより精製された全
ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、２０μｇ／
ｍＬとした。その後、これら６種類を等量ずつ混合し、
検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイース
トｔＲＮＡ（Yeast tRNA, GIBCO社製）を用いて、５倍
公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
【００４７】ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワ
ードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー及び２
００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PC
R Master Mix Reagents Kit (PE Applied Biosystems)
を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ ＰＲＩ
ＳＭTM７７００ Sequence Detection System（PE Appl
ied Biosystems）にて行なった。温度条件は、４８℃で
３０分間、９５℃で１０分間で保温した後、９５℃で１
５秒間、６０℃で１分間のサイクルを５０回行い、各サ
イクルごとに蛍光強度を測定した。
ードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー及び２
００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PC
R Master Mix Reagents Kit (PE Applied Biosystems)
を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ ＰＲＩ
ＳＭTM７７００ Sequence Detection System（PE Appl
ied Biosystems）にて行なった。温度条件は、４８℃で
３０分間、９５℃で１０分間で保温した後、９５℃で１
５秒間、６０℃で１分間のサイクルを５０回行い、各サ
イクルごとに蛍光強度を測定した。
【００４８】(2)試験結果 下記表１に示す各酵素に対して各配列番号に示される配
列のプライマー対及びプローブを用いて行なった上記試
験の結果（検量線）を表２に示す。
列のプライマー対及びプローブを用いて行なった上記試
験の結果（検量線）を表２に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】上記表２より、１０００００ｐｇ全ＲＮＡ
／５０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を
作成したところ、ＣＨＳＴ１については、３２ｐｇ全Ｒ
ＮＡ／５０μＬ反応液量まで定量性を有しており、他の
酵素についても６．４ｐｇから８００ｐｇ全ＲＮＡを定
量下限とした検量線の相関係数（ｒ）は０．９９以上で
あった。但し、ＳＵＬＴ２Ｂ１は定量下限が４０００、
相関係数が０．９８であった。
／５０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を
作成したところ、ＣＨＳＴ１については、３２ｐｇ全Ｒ
ＮＡ／５０μＬ反応液量まで定量性を有しており、他の
酵素についても６．４ｐｇから８００ｐｇ全ＲＮＡを定
量下限とした検量線の相関係数（ｒ）は０．９９以上で
あった。但し、ＳＵＬＴ２Ｂ１は定量下限が４０００、
相関係数が０．９８であった。
【００５２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. <120> ヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素の測定方法、そのためのプローブ及 びキット <130> 00P1075 <160> 33 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> human CHST1 gene <400> 1 caagtacatg ttggtgcgct acgagga 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> human CHST3 gene <400> 2 tctagcagat gccaacagca ccga 24 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> human CHST4 gene <400> 3 cgctggtctt tgccctatga aaaggtttct 30 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> human CHST5 gene <400> 4 tttgatgcct acatgccaca gagcc 25 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> human CST gene <400> 5 tccacctggt gctccttcaa gagtacttc 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> human HNK-1ST gene <400> 6 atccagtttg aagatttcgt gcgctacctc 30 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> human SULT2A1 gene <400> 7 tccccatcca gttattcccc aagtctt 27 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> human SULT2B1 gene <400> 8 ttcttcagct ccaaggccaa ggtga 25 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> human SULTX3 gene <400> 9 accgcatgga ctcgaacgtg ctttttctc 29 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> human STE gene <400> 10 cctggatcct ttccagagtt tgtggaga 28 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> human TPST2 gene <400> 11 atcgaggtga tgtacgccca gtgcat 26 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> human CHST1 gene <400> 12 aggacttctc caactccgtg tc 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> human CHST1 gene <400> 13 ccgtagatct cctcggtctt ctt 23 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> human CHST3 gene <400> 14 acaagctgaa gcagattccc c 21 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> human CHST3 gene <400> 15 gagagatgcg ttctcagcta agatc 25 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> human CHST4 gene <400> 16 cccttaatgt ctcccaggct tg 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> human CHST4 gene <400> 17 cggtagccca gcaaattcat g 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> human CHST5 gene <400> 18 cgctctatct ttttgtgcga ca 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> human CHST5 gene <400> 19 agttgaaaaa ggcggacagg tt 22 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> human CST gene <400> 20 aatgcccact acctccgaaa c 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> human CST gene <400> 21 aagtagagca cgtcctccag ct 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> human HNK-1ST gene <400> 22 aaaatacagg aggaaccgga ca 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> human HNK-1ST gene <400> 23 ctgttataca cggtaatgcc cg 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> human SULT2A1 gene <400> 24 ccacgtttat tctcctccca c 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> human SULT2A1 gene <400> 25 agcacagttc cttgacaaaa cc 22 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> human SULT2B1 gene <400> 26 cttcccatcc agatcttcac c 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> human SULT2B1 gene <400> 27 ccttaatgtg gtcgaaccag ga 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> human SULTX3 gene <400> 28 gaattctgcc ggaggtttat g 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> human SULTX3 gene <400> 29 agacggtgaa gatgtccttc c 21 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> human STE gene <400> 30 tggtggctgg tcatccaaa <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> human STE gene <400> 31 acacgtggac tctttccctt tt 22 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> human TPST2 gene <400> 32 tttgacctca gcagctaccg t 21 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> human TPST2 gene <400> 33 aggaagtcga ggatgagctt ga 22
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01 GA07 GB21 2G054 CA22 CE02 EA03 GA04 GB02 4B024 AA11 BA10 CA01 CA09 HA11 4B063 QA05 QA19 QQ02 QQ26 QQ42 QR08 QR32 QR62 QR66 QS03 QS28 QS36 QX02
Claims (12)
- 【請求項１】 ヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素の
測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(11)の
各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドから選ばれることを特徴とするプローブ。 (1)ＣＨＳＴ１遺伝子の８８５〜９１１の領域 (2)ＣＨＳＴ３遺伝子の１７４〜１９７の領域 (3)ＣＨＳＴ４遺伝子の１００３〜１０３２の領域 (4)ＣＨＳＴ５遺伝子の３２２〜３４６の領域 (5)ＣＳＴ遺伝子の７３７〜７６５の領域 (6)ＨＮＫ−１ＳＴ遺伝子の７０３〜７３２の領域 (7)ＳＵＬＴ２Ａ１遺伝子の２９９〜３２５の領域 (8)ＳＵＬＴ２Ｂ１遺伝子の３５８〜３８２の領域 (9)ＳＵＬＴＸ３遺伝子の５５４〜５８２の領域 (10)ＳＴＥ遺伝子の４５１〜４７８の領域 (11)ＴＰＳＴ２遺伝子の６５２〜６７７の領域 - 【請求項２】 リポーター色素とクエンチャー色素とが
結合している請求項１に記載のプローブ。 - 【請求項３】 塩基配列の長さが２０〜４０である請求
項１に記載のプローブ。 - 【請求項４】 配列番号１〜配列番号１１に示される配
列のいずれかを含むものである請求項１〜３のいずれか
に記載のプローブ。 - 【請求項５】 配列番号１〜配列番号１１に示される配
列のいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のプ
ローブ。 - 【請求項６】 下記(1)〜(11)の、ヒトにおける硫酸抱合
に関与する酵素をコードする遺伝子の下記各領域にそれ
ぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフ
ォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマ
ー対、及び上記両プライマーに挟まれた下記領域にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブの
組合せから選ばれる、ヒトにおける硫酸抱合に関与する
酵素の測定キット。 (1)プライマー対；ＣＨＳＴ１遺伝子の830-851領域及び
953-931領域、プローブ；885-911領域 (2)プライマー対；ＣＨＳＴ３遺伝子の149-169領域及び
231-207領域、プローブ；174-197領域 (3)プライマー対；ＣＨＳＴ４遺伝子の980-1001領域及
び1079-1059領域、プローブ；1003-1032領域 (4)プライマー対；ＣＨＳＴ５遺伝子の292-313領域及び
370-349領域、プローブ；322-346領域 (5)プライマー対；ＣＳＴ遺伝子の628-648領域及び827-
806領域、プローブ；737-765領域 (6)プライマー対；ＨＮＫ−１ＳＴ遺伝子の669-690領域
及び950-929領域、プローブ；703-732領域 (7)プライマー対；ＳＵＬＴ２Ａ１遺伝子の277-297領域
及び476-455領域、プローブ；299-325領域 (8)プライマー対；ＳＵＬＴ２Ｂ１遺伝子の331-351領域
及び538-517領域、プローブ；358-382領域 (9)プライマー対；ＳＵＬＴＸ３遺伝子の478-498領域及
び778-758領域、プローブ；554-582領域 (10)プライマー対；ＳＴＥ遺伝子の431-449領域及び560
-539領域、プローブ；451-478領域 (11)プライマー対；ＴＰＳＴ２遺伝子の604-624領域及
び767-746領域、プローブ；652-677領域 - 【請求項７】 プローブが、更にリポーター色素とクエ
ンチャー色素とを結合させたものである請求項６に記載
の測定キット。 - 【請求項８】 下記(1)〜(11)に示されるセットの、各配
列番号で示される配列を含むオリゴヌクレオチドからな
るプライマー対とプローブとの組合せから選ばれる、請
求項７に記載の測定キット。 (1)プライマー対；配列番号１２及び１３、プローブ；
配列番号１ (2)プライマー対；配列番号１４及び１５、プローブ；
配列番号２ (3)プライマー対；配列番号１６及び１７、プローブ；
配列番号３ (4)プライマー対；配列番号１８及び１９、プローブ；
配列番号４ (5)プライマー対；配列番号２０及び２１、プローブ；
配列番号５ (6)プライマー対；配列番号２２及び２３、プローブ；
配列番号６ (7)プライマー対；配列番号２４及び２５、プローブ；
配列番号７ (8)プライマー対；配列番号２６及び２７、プローブ；
配列番号８ (9)プライマー対；配列番号２８及び２９、プローブ；
配列番号９ (10)プライマー対；配列番号３０及び３１、プローブ；
配列番号１０ (11)プライマー対；配列番号３２及び３３、プローブ；
配列番号１１ - 【請求項９】 請求項８に記載の測定キットであって、
(1)のセットがＣＨＳＴ１の測定用で、(2)のセットがＣ
ＨＳＴ３の測定用で、(3)のセットがＣＨＳＴ４の測定
用で、(4)のセットがＣＨＳＴ５の測定用で、(5)のセッ
トがＣＳＴの測定用で、(6)のセットがＨＮＫ−１ＳＴ
の測定用で、(7)のセットがＳＵＬＴ２Ａ１の測定用
で、(8)のセットがＳＵＬＴ２Ｂ１の測定用で、(9)のセ
ットがＳＵＬＴＸ３の測定用で、(10)のセットがＳＴＥ
の測定用で、(11)のセットがＴＰＳＴ２の測定用である
測定キット。 - 【請求項１０】 請求項８に記載の(1)〜(11)に示される
セットの、各配列番号で示される配列を有するオリゴヌ
クレオチドからなるプライマー対とプローブとの組合せ
から選ばれる、請求項９に記載の測定キット。 - 【請求項１１】 ヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素
を含む検体について、請求項６〜１０のいずれかに記載
の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定するこ
とを特徴とするヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素の
測定方法。 - 【請求項１２】加水分解の有無が、励起光照射による蛍
光の発色の有無によりなされる請求項１１に記載の測定
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000272229A JP2002085067A (ja) | 2000-09-07 | 2000-09-07 | ヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000272229A JP2002085067A (ja) | 2000-09-07 | 2000-09-07 | ヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002085067A true JP2002085067A (ja) | 2002-03-26 |
Family
ID=18758383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000272229A Pending JP2002085067A (ja) | 2000-09-07 | 2000-09-07 | ヒトにおける硫酸抱合に関与する酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002085067A (ja) |
-
2000
- 2000-09-07 JP JP2000272229A patent/JP2002085067A/ja active Pending
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