CN114645083A - 一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的pcr扩增引物、试剂盒及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增引物、试剂盒及鉴定方法，属于分子生物学技术领域。本申请的PCR扩增引物包括性别标记特异引物和内参基因引物，所述性别标记特异引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述性别标记特异引物下游序列如SEQ ID NO.2所示，所述内参基因引物上游序列如SEQ ID NO.3所示，所述内参基因引物下游序列如SEQ ID NO.4所示。本申请的PCR扩增引物能够在红螯螯虾早期鉴定出其遗传性别；本申请的方法操作简便、可进行大批量鉴定，鉴别快速、结果直观准确。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增引物、试剂盒及鉴定方法。
背景技术
红螯螯虾（Cherax quadricarinatus），隶属于甲壳动物亚门，软甲纲。红螯螯虾原产于澳大利亚，于1992年引进我国，并首先在广东和湖北两省试养成功，随后在福建、江苏、浙江、江西、广西等均开展了养殖。红螯螯虾的适应性强，生长快速，无明显的摄食偏好性，且成体规格大，离水后可存活时间长，便于长途运输。市场前景可观。目前，国内的红螯螯虾养殖产业仍处于初级阶段，由于苗种获得不易和缺乏优质亲本等问题，红螯螯虾的养殖一直未得到有效推广，存在较大的局限性，因此多地区开展了红螯螯虾的选育工作。
红螯螯虾具有多种性逆转个体类型，性逆转个体为遗传雌性、生理雄性，自然状态下能够与雌性进行交配繁殖后代，并导致后代中性逆转个体的比例升高，由于性逆转个体的规格较正常雄性小、但具有与正常雄性一样的强攻击性，同时性逆转亲本会导致后代中雌性比例降低，这对红螯螯虾的繁殖和养殖经济效益是不利的。因此在选育过程中需要将性逆转个体予以剔除，鉴于性逆转个体具有多种表型性征，甚至与正常雄性完全一致仅从表型进行区分十分困难。此外，红螯螯虾的单性化养殖需要在其性别分化早期进行人工诱导性逆转，但发育早期的幼虾难以从表型鉴定性别，因此红螯螯虾遗传性别鉴定分子标记的开发势在必行。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增引物、试剂盒及鉴定方法的技术方案。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明一方面提供一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增引物，其包括性别标记特异引物和内参基因引物，所述性别标记特异引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述性别标记特异引物下游序列如SEQ ID NO.2所示，所述内参基因引物上游序列如SEQ IDNO.3所示，所述内参基因引物下游序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明另一方面提供含有上述PCR扩增引物的快速鉴定红螯螯虾遗传性别的试剂盒。
本发明另一方面一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的方法，其包括以下步骤：
1）取红螯螯虾PCR模板，采用内参基因引物进行PCR扩增，所述内参基因引物上游序列如SEQ ID NO.3所示，所述内参基因引物下游序列如SEQ ID NO.4所示，扩增产物进行电泳，若在100-200之间显示出一条单一条带，则说明该模板DNA能够用于鉴定红螯螯虾遗传性别特异性检测；
2）取红螯螯虾PCR模板，采用性别标记特异引物进行PCR扩增，所述性别标记特异引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述性别标记特异引物下游序列如SEQ ID NO.2所示，扩增产物进行电泳，若在1900bp显示出一条单一条带，则判定为雌性，若无条带出现，则判定为雄性。
进一步，所述的红螯螯虾PCR模板通过以下步骤得到：
a）取1.5mL的无菌离心管，加入0.5mL的血淋巴抗凝剂待用；
b）从红螯螯虾螯肢关节处抽取0.5mL的血淋巴，注入上述无菌离心管中，迅速混匀后，于室温条件下3500rpm离心5min；
c）倒去上清，向沉淀中加入0.5mL的组织裂解液，并用枪头将沉淀充分悬浮后，加入10μL的20mg/ml蛋白酶K，58℃水浴30min后，即得红螯螯虾PCR模板。
进一步，所述PCR反应体系为：2×Hieff ® PCR Master Mix(With Dye)12.5μL，红螯螯虾PCR模板 2μL，10μmol上下游引物各1μL，dd水8.5μL。
进一步，所述步骤1）中PCR扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃30s，35个循环，72℃ 10min，4℃结束；步骤2）中PCR扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 30s、60℃30s、72℃ 1min30s，35个循环，72℃ 10min，4℃结束。
进一步，所述血淋巴抗凝剂为：EDTA 0.15g，葡萄糖 1.04g，NaCl 0.93g，柠檬酸三钠 0.44g，加dd水定容至50mL；
组织裂解液为：SDS 2.5g，Tris 0.61g，NaCl 11.7g，EDTA 0.37g，加dd水定容至500mL，并使用NaOH将溶液pH调制8。
本申请的有益效果：
1）本申请的一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增引物能够在红螯螯虾早期鉴定出其遗传性别；
2）本申请的一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的方法操作简便、可进行大批量鉴定，鉴别快速、结果直观准确；
3）本申请的红螯螯虾PCR模板制备方法无创取样、操作快捷简便、结果准确。
附图说明
图1为实施例的电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1：制备红螯螯虾PCR模板
a）取1.5mL的无菌离心管，加入0.5mL的血淋巴抗凝剂待用；血淋巴抗凝剂具体为：EDTA 0.15g，葡萄糖 1.04g，NaCl 0.93g，柠檬酸三钠 0.44g，加dd水定容至50mL；
b）使用1mL的无菌注射器从红螯螯虾螯肢关节处抽取0.5mL的血淋巴，注入上述无菌离心管中，迅速混匀后，于室温条件下3500rpm离心5min；
c）倒去上清，向沉淀中加入0.5mL的组织裂解液，组织裂解液为：SDS 2.5g，Tris0.61g，NaCl 11.7g，EDTA 0.37g，加dd水定容至500mL，并使用NaOH将溶液pH调制8，并用枪头将沉淀充分悬浮后，加入10μL的20mg/ml蛋白酶K，58℃水浴30min后，即得红螯螯虾PCR模板。
本实施例中抽取血淋巴代替取组织，无创操作，降低了虾感染的几率，减少损耗。以裂解液代替抽提DNA，节省了很长时间，也节省了试剂耗材费用，同时也保证了检测结果能够当天出。
实施例2：一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的方法
1）取红螯螯虾PCR模板，采用内参基因引物进行PCR扩增，所述内参基因引物上游序列如SEQ ID NO.3所示（TACCACCGGCATTGTCTTGG），所述内参基因引物下游序列如SEQ IDNO.4所示（ACGCAAGATAGCATGGGGAA），扩增产物进行电泳，若在100-200之间显示出一条单一条带，则说明该模板DNA能够用于鉴定红螯螯虾遗传性别特异性检测；
PCR反应体系为：2×Hieff ® PCR Master Mix(With Dye)12.5μL，模板DNA 2μL，10μmol上下游引物各1μL，dd水8.5μL；
PCR扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s，35个循环，72℃10min，4℃结束。
2）取红螯螯虾PCR模板，采用性别标记特异引物进行PCR扩增，所述性别标记特异引物上游序列如SEQ ID NO.1所示（CCCTCGAACTGTGTTGCTCA），所述性别标记特异引物下游序列如SEQ ID NO.2所示（GAAGTTGTCTGTGGACGGGT），扩增产物进行电泳，若在1900bp显示出一条单一条带，则判定为雌性，若无条带处理，则判定为雄性；
PCR反应体系为：2×Hieff ® PCR Master Mix(With Dye)12.5μL，红螯螯虾PCR模板 2μL，10μmol上下游引物各1μL，dd水8.5μL；
PCR扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min30s，35个循环，72℃10min，4℃结束。
应用例
制备红螯螯虾PCR模板：雌雄红螯螯虾各10只，抽取血淋巴1000μL，加入500μL的血淋巴抗凝剂中混匀，常温3500rpm离心5min，倒去上清液，向沉淀中加入500μL裂解液，10μL蛋白酶K，58℃水浴30min。
每个模板同时做性别检测PCR和内参基因PCR，性别检测PCR中加入2μL裂解混合物，2×Hieff ® PCR Master Mix(With Dye)（翊圣生物科技有限公司）12.5μL，SEQ IDNO.1引物1μL，SEQ ID NO.2引物1μL，dd水8.5μL，PCR扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min，35个循环，72℃ 10min，4℃结束。
内参基因PCR中加入2μL裂解混合物，2×Hieff ® PCR Master Mix(With Dye)（翊圣生物科技有限公司）12.5μL，SEQ ID NO.3引物1μL，SEQ ID NO.4引物1μL，dd水8.5μL。PCR扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s，35个循环，72℃ 10min，4℃结束。
使用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行条带检测，结果如图所示：20个红螯螯虾样品内参基因均有条带，说明模板有效，其中10个雌性个体在1900bp处具有阳性条带，10个雄性个体无条带，说明该引物对红螯螯虾性别鉴定的准确率为100%。
实验结果：其中No1为性别鉴定pcr产物，No2为内参基因pcr产物。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增引物、试剂盒及鉴定方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctcgaact gtgttgctca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaagttgtct gtggacgggt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taccaccggc attgtcttgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgcaagata gcatggggaa 20
Claims (7)
1.一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增引物，其特征在于包括性别标记特异引物和内参基因引物，所述性别标记特异引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述性别标记特异引物下游序列如SEQ ID NO.2所示，所述内参基因引物上游序列如SEQ ID NO.3所示，所述内参基因引物下游序列如SEQ ID NO.4所示。
2.含有权利要求1所述PCR扩增引物的快速鉴定红螯螯虾遗传性别的试剂盒。
3.一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取红螯螯虾PCR模板，采用内参基因引物进行PCR扩增，所述内参基因引物上游序列如SEQ ID NO.3所示，所述内参基因引物下游序列如SEQ ID NO.4所示，扩增产物进行电泳，若在100-200之间显示出一条单一条带，则说明该模板DNA能够用于鉴定红螯螯虾遗传性别特异性检测；
2）取红螯螯虾PCR模板，采用性别标记特异引物进行PCR扩增，所述性别标记特异引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述性别标记特异引物下游序列如SEQ ID NO.2所示，扩增产物进行电泳，若在1900bp显示出一条单一条带，则判定为雌性，若无条带处理，则判定为雄性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述红螯螯虾PCR模板通过以下步骤得到：
a）取1.5mL的无菌离心管，加入0.5mL的血淋巴抗凝剂待用；
b）从红螯螯虾螯肢关节处抽取0.5mL的血淋巴，注入上述无菌离心管中，迅速混匀后，于室温条件下3500rpm离心5min；
c）倒去上清，向沉淀中加入0.5mL的组织裂解液，并用枪头将沉淀充分悬浮后，加入10μL的20mg/ml蛋白酶K，58℃水浴30min后，即得红螯螯虾PCR模板。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于PCR反应体系为：2×Hieff ® PCR MasterMix(With Dye)12.5μL，PCR模板 2μL，10μmol上下游引物各1μL，dd水8.5μL。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤1）中PCR扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s，35个循环，72℃ 10min，4℃结束；所述步骤2）中PCR扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min30s，35个循环，72℃ 10min，4℃结束。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述血淋巴抗凝剂为：EDTA 0.15g，葡萄糖1.04g，NaCl 0.93g，柠檬酸三钠 0.44g，加dd水定容至50mL；
所述组织裂解液为：SDS 2.5g，Tris 0.61g，NaCl 11.7g，EDTA 0.37g，加dd水定容至500mL，并使用NaOH将溶液pH调制8。
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| CN113699224A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-26 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种用于中国对虾性别鉴定的分子标记c2及其应用 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114645083B (zh) | 2023-06-13 |
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