CN112680479A

CN112680479A - Cyp1b1基因缺失斑马鱼的制备

Info

Publication number: CN112680479A
Application number: CN202110043837.4A
Authority: CN
Inventors: 汪利平
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2021-04-20

Abstract

本发明利用CRISPR/Cas9技术，构建成了CYP1B1基因缺失斑马鱼，具体步骤包括：1)根据CYP1B1基因序列，确定CYP1B1靶位点；2)制备gRNA；3)体外转录Cas9mRNA；4)将Cas9mRNA和gRNA混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；5)将F₀胚胎饲养至性成熟；6)与野生型成鱼外交，筛选F₀；7)选取可产生有效突变的F₀自交，筛选F₁；8)从F₁代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F₂代；9)筛选CYP1B1基因敲除纯合子即为稳定遗传的CYP1B1基因缺失斑马鱼。本发明构建的CYP1B1基因缺失斑马鱼可稳定遗传，CYP1B1基因缺失斑马鱼可用于结肠癌、胃癌、食管癌病的研究。

Description

CYP1B1基因缺失斑马鱼的制备

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及CYP1B1基因缺失斑马鱼的制备。

背景技术

细胞色素P450(cytochrome P450 proteins，CYP)是一个多基因的家族酶，细胞色素P4501B1(cytochrome P450，family1，subfamily B，polypeptide 1，CYP1B1)属于CYP1家族，CYP1B1可以通过代谢杂环芳香胺、多环芳香烃和其他致癌原激活癌症，同时也参与了与结直肠癌的发生脂肪酸和性激素的代谢。CYP1B1是Ⅰ阶段外源性代谢酶，已经发现CYP1B1在多种恶性肿瘤组织中高表达，如消化系肿瘤(结肠癌、胃癌、食管癌等)、妇科肿瘤(子宫颈癌、子宫内膜癌等)、泌尿系肿瘤(膀胱癌、前列腺癌等)以及乳腺癌等，并发挥着重要的生物学作用。

斑马鱼具有体外受精、体外发育、透明、产卵量高、实验用药量小，是大鼠和小鼠后第三大脊椎类模式动物，斑马鱼与人类基因同源性高达85％，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，已经广泛应用于发育生物学研究、人类疾病模型研究、新药筛选、药物毒性与安全性评价以及环境毒理学研究等领域。

发明内容

本发明的目的是利用CRISPR/Cas9系统构建一种CYP1B1基因缺失斑马鱼。

本发明的制备过程如下：

本发明靶位点DNA序列为：5’-GGACGTGTTTCAGATCAAAC-3’。

本发明提供一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括两条Oligo序列，其序列为5’-TAGGACGTGTTTCAGATCAAAC-3’，5’-AAACGTTTGATCTGAAACACGT-3’，使用该试剂盒可以用于CYP1B1基因表达的沉默。

本发明提供了一种基因敲除方法，所述方法的步骤如下：利用所述的Oligo片段识别目的基因的靶位点，与Cas9结合并识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因靶位点处，并开始进行剪切，形成DSB缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。

进一步的，所述靶点为一个或以上。

进一步的，本发明提供CYP1B1基因缺失斑马鱼的制备方法，所述制备方法包括：

1.根据CYP1B1基因序列，确定CYP1B1靶位点；

2.根据CYP1B1靶位点，设计Oligo序列；

3.构建gRNA体外转录载体；

4.PCR获得gRNA体外转录模板；

5.对步骤4获得的模板进行体外转录，得到gRNA；

6.制备Cas9 mRNA的体外转录模板；

7.体外转录Cas9 mRNA；

8.添加polyA序列、回收Cas9 mRNA；

9.将Cas9 mRNA和gRNA混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；

10.将F₀胚胎饲养至性成熟；

11.与野生型成鱼外交，筛选F₀；

12.选取可产生有效突变的F₀自交，筛选F₁；

13.从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代；

14.筛选CYP1B1基因敲除纯合子即为稳定遗传的CYP1B1基因缺失斑马鱼。

本发明的有益效果和优点在于：

本发明构建的CYP1B1基因缺失斑马鱼为国内外首例。

本发明构建的CYP1B1基因缺失斑马鱼可稳定遗传，可用于结肠癌、胃癌、食管癌病的研究。

附图说明

图1：克隆骨架pT7-gRNA-BbsⅠ电泳图

图2：菌液PCR鉴定

图3：gRNA体外转录模板

图4：体外转录Cas9 mRNA

图5：PCR、酶切鉴定突变体

图6：CYP1B1基因缺失斑马鱼与野生型序列对比

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1：本发明动物模型的制备

1.实验动物

按标准化方案养殖野生型斑马鱼(TU品系)，水温28.5℃，光照/黑暗周期为14h/10h，成体斑马鱼产卵后收集胚胎，养殖于E3孵化液，以受精的小时数(hours post fertilization，hpf)或受精的天数(days post fertilization，dpf)表示胚胎和幼鱼的发育阶段。

2.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计

在NCBI上查询斑马鱼CYP1B1基因序列，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx上设计CYP1B1靶位点，靶位点包含20个碱基，靶点的选择标准为：5’-GG-(N)18-NGG-3’；其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，靶位点3’端是NGG。

3.构建gRNA体外转录载体

3.1用BbsⅠ酶切pT7-gRNA、切胶回收(见图1)，得到gRNA克隆骨架pT7-gR NA-BbsⅠ，酶切体系如下表1：

表1酶切体系：

3.2根据靶位点订购两条oligo，oligo1序列为5’-TAGGACGTGTTTCAGATCAAAC-3’，oligo2序列为5’-AAACGTTTGATCTGAAACACGT-3’；

3.3用ddH₂O分别将oligo溶解为10μM的溶液，退火，得到粘性末端小片段，退火程序见表2；

表2退火程序

3.4将退火后的片段与回收的上述gRNA克隆骨架pT7-gRNA-BbsⅠ连接、转化，挑取克隆，用RV-M与Oligo2作为引物进行菌液PCR鉴定(58℃退火，延伸30sec，30cycle)，目的条带约为130bp(见图2)，挑取阳性克隆送去测序，选取序列正确的克隆甘油保菌、提质粒，RV-M序列：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’，连接体系见表3；

表3连接体系

4.制备gRNA

4.1用T7-cr fwd和tracr rev引物对，以构建好的gRNA体外转录载体为模板，使用高保真酶PCR，得到gRNA体外转录模板(58℃退火，延伸30sec，40cycle，40μl体系)，取1μlPCR产物电泳，确认为单一条带(125bp)后直接回收PCR产物(见图3)，用于后续的实验，T7-cr fwd序列：5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’，tracr rev序列：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’；

4.2体外转录gRNA

gRNA体外转录体系见表4；

表4体外转录mRNA反应体系

4.3回收gRNA

4.3.1用RNase-free water将gRNA转录体系稀释到300μl，加入330μl无水乙醇；

4.3.2将溶液加到回收柱中，10000g/min离心15s；

4.3.3加入700μl的miRNA Wash SolutionⅠ，离心5-10s；

4.3.4加入500μl的Wash SolutionⅡ，离心5-10s，重复一次；

4.3.5弃去收集管中的液体，离心1min，去除残余的液体；

4.3.6加入适量95℃预热的RNase-free water，最大转速离心20-30s，收集得到gRN A溶液；

5.制备Cas9 mRNA

5.1制备Cas9 mRNA的体外转录模板：通过XbaⅠ单酶切线性化pSP6-2sNLS-spC as9载体(37℃，4h以上)；取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物；

5.2体外转录Cas9 mRNA，mRNA体外转录体系见表5；

表5 Cas9 mRNA体外转录体系

5.3添加polyA序列，回收得到的mRNA(图4)可用于显微注射；

表6 mRNA加polyA的反应体系

6.制备F₀代斑马鱼

6.1将Cas9 mRNA和gRNA混合，注射到单细胞其斑马鱼胚胎中，同时将未注射的同批胚胎作为对照，Cas9 mRNA 300-500pg，gRNA 25-200pg；

6.2取2-4dpf注射后表型正常的胚胎，提取基因组DNA，PCR、T7E1酶切检测靶位点突变效率(图5)；

6.3将未切开的条带回收、TA克隆测序，检测突变类型；

6.4选取突变效率较高、存活率较高的同批次注射的F₀胚胎饲养至性成熟；

6.5与野生型成鱼外交，将3-5个1dpf的F1胚胎混和为一组提取基因组DNA；

6.6通过PCR和酶切检测靶位点突变情况；

6.7回收未切开的条带、TA克隆测序，确定突变类型；

6.8选取可产生有效突变的F₀鱼交配，大量饲养F₁。

7.筛选携带靶位点突变的F₁成鱼

7.1将F₁饲养至足够大，直至适合剪尾鳍；

7.2F₁成鱼剪尾鳍、提基因组，通过PCR和酶切逐条进行基因检测，筛选出F₁杂合子；

7.3回收未切开的条带、TA克隆，测序确定突变类型；

8.从F1代突变体重挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28.5℃培养，于4dpf取部分胚胎，每个胚胎单独提取基因组DNA，再以引物对，引物序列如下：

9.通过PCR条带分析鉴定为纯合突变的效率，进一步进行测序鉴定(图6)。

Claims

1.CYP1B1基因缺失斑马鱼的制备，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据CYP1B1基因序列，确定CYP1B1靶位点；

2)根据CYP1B1靶位点，设计Oligo序列；

3)构建gRNA体外转录载体；

4)PCR获得gRNA体外转录模板；

5)对步骤4获得的模板进行体外转录，得到gRNA；

6)制备Cas9 mRNA的体外转录模板；

7)体外转录Cas9 mRNA；

8)添加polyA序列、回收Cas9 mRNA；

9)将Cas9 mRNA和gRNA混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；

10)将F₀胚胎饲养至性成熟；

11)与野生型成鱼外交，筛选F₀；

12)选取可产生有效突变的F₀自交，筛选F₁；

13)从F₁代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F₂代；

14)筛选CYP1B1基因敲除纯合子即为稳定遗传的CYP1B1基因缺失斑马鱼。

2.如权利要求1所述的CYP1B1基因缺失斑马鱼的应用，所述的CYP1B1基因缺失斑马鱼用于结肠癌、胃癌、食管癌病的研究。