CN104962595A - 一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法，将Cas9蛋白序列转化入pET28a-ccdB-CmR载体，再转化至原核表达菌株，经过诱导表达后，收集菌体，经亲和纯化、用超滤管浓缩纯化、透析后即得到纯化的Cas9蛋白；所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和Xho I酶切位点之间插入NotI-ccdB-CmR-AscI序列得到。本发明构建了高效的Cas9蛋白原核表达系统，表达得到的Cas9蛋白经体外切割实验证明具有体外活性，可特异切割体外DNA；胚胎注射实验证明纯化的Cas9蛋白具有体内活性，可用于制备基因修饰动物。

Description

一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法

技术领域

 本发明属于蛋白质技术领域。更具体地，涉及一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法。

背景技术

对于临床疾病的研究，由于很难在临床病人身上实现各种控制变量的实验，或者由于某种疾病成因差异较大、病程进展不一或疾病十分罕见，了解疾病发生进展机理以及寻找治疗手段一般都需要建立相应的实验动物模型。另外，当我们想研究某个基因在生物体中的生理功能时，也需要建立一定的实验动物模型，并从多方面考察该基因的功能。因此，基因编辑（genome editing）技术在建立动物疾病模型和研究基因功能中有着十分重要的地位。基因编辑技术包括了最早的依赖同源重组编辑、锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease）、TALE核酸酶（Transcription activator like effector nucleases, TALENs）到最新的CRISPR （clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/ Cas（CRISPR-associated）系统。除了最先的依赖同源重组编辑以外，其余三种基因编辑系统均能在双链DNA上制造双链DNA断裂（Double Strand Breaks，DSB）。双链DNA断裂产生后可通过同源重组（Homologous Recombination，HR）或非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）被重新修复。单独导入这些核酸酶，通过非同源末端连接可造成基因组特点位点的插入或缺失，有机会造成目标基因的移码，使目标蛋白失去正常功能；同时将这类核酸酶和修复模版导入细胞，通过同源重组有机会将基因组中序列替换为修复模版序列，产生人为的定向突变。

为满足研究需要，简单易用的CRISPR系统在近两年飞速发展，在许多方面得到了广泛的应用。CRISPR是原核生物和古细菌的获得性免疫系统的一部分，主要用于对抗入侵的病毒和质粒。细菌中的CRISPR系统主要由三部分组成：Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA。其中，Cas9蛋白具有解旋酶和内切酶活性，当蛋白结合到DNA上时能识别靶向序列3’端的PAM序列使双链DNA解旋，且其上的两个内切酶活性位点介导双链DNA切割；crRNA具有30nt的序列用于识别DNA；tracrRNA和crRNA部分配对，帮助crRNA成熟和于Cas9结合。现在的系统将crRNA和tracrRNA融合为一sgRNA（single-guide RNA），使系统进一步简化，只需Cas9蛋白和sgRNA就可进行DNA切割。目前，CRISPR系统可以用于在体外进行特定位点的DNA切割。利用CRISPR系统，通过生物内的DNA修复机制，可进行培养细胞的基因编辑，实现基因敲除或基因修复。目前CRISPR系统除了可用于敲除研究特定基因的功能外，数篇报道利用sgRNA文库实现了细胞水平的基因功能性筛选。将编码Cas9和sgRNA的质粒或RNA转导至胚胎干细胞、受精卵或胚胎，可快速制备果蝇、线虫、爪蟾、斑马鱼、小鼠、大鼠、猪、食蟹猴等多种基因敲除生物。此外，通过将不同蛋白融合至Cas9上，可实现基因组特点位点的活细胞成像，可人为促进或抑制细胞内基因转录。更为重要的是，目前已有研究表明CRISPR系统可在生殖干细胞和诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cell，iPSC）中进行基因修复治疗遗传疾病。另外，基于CRISPR的体细胞癌变、病原生物和病毒感染治疗也有很大的应用潜力。虽然目前对于CRISPR脱靶效应存在比较大争论，但无可否定，CRISPR系统在研究基因功能和基因治疗方面有着十分重要的意义。

在应用CRISPR系统制作敲除动物方面，目前普遍流行将编码Cas9蛋白的mRNA和sgRNA共注射到受精卵或胚胎中。然而，由于mRNA翻译延迟，可能导致出生的动物嵌合体比例低下或同一动物体内基因修饰不一致。目前比较理想的方法是直接共注射Cas9蛋白和sgRNA，使基因编辑尽早产生。然而，现有的Cas9活性蛋白纯化手段仍比较繁琐，融合蛋白标签容易导致纯化中标签降解影响纯度和产量，在国内不容易获得大量蛋白满足制备敲除动物需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有Cas9蛋白制备方法的缺陷和技术不足，提供一种一步将带His标签的Cas9蛋白纯化出来的方法，并且保证所制备的Cas9蛋白无论在体内或体外都具有活性，适合用于胚胎注射以制备修饰动物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法，将Cas9蛋白序列转化入pET28a-ccdB-CmR载体，再转化至原核表达菌株，经过诱导表达后，收集菌体，经亲和纯化、用超滤管浓缩纯化、透析后即得到纯化的Cas9蛋白。所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和Xho I酶切位点之间插入NotI-ccdB-CmR-AscI序列得到。

所述Cas9蛋白来源于px330质粒，并包括N端和C端SV40核定位信号，通过Not I与Asc I酶切位点连于改良的pET28a质粒。所用的改良pET28a质粒在原始pET28a质粒基础上，在Hind III与Xho I之间，插入了TEV蛋白酶切位点、Not I限制性核酸内切酶位点、氯霉素抗性基因、ccdB细菌生长致死蛋白、Asc I限制性核酸内切酶位点。

优选地，本发明制备Cas9蛋白时的诱导表达条件为：按照1：100的接种量，将表达菌接种LB培养基培养，于37℃过夜培养菌种至OD600=1.0，冰上冷却30分钟后，加终浓度为0.2mM的IPTG，于15℃继续培养24小时。

优选地，本发明纯化蛋白时，使用50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM、NaCl 10%甘油和40mM咪唑组成的裂解缓冲液进行菌体裂解。

优选地，本发明纯化蛋白时，以Ni Sepharose FF柱进行纯化。

优选地，本发明纯化蛋白时，以50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油和250mM咪唑组成的洗脱缓冲液进行洗脱。

优选地，本发明纯化蛋白时，以30kDa透析袋于50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl和10%甘油组成的透析液中进行透析。

具体地，本发明所述Cas9蛋白的制备方法包括如下步骤：

S1.以携带有Cas9序列的px330质粒为模版，利用SEQ ID NO.1和2所示上下游引物进行PCR扩增；

S2.利用Not I和Not I双酶切，将PCR扩增产物连接至pET28a-ccdB-CmR载体，得到重组质粒pET-28a-Cas9；

S3.重组质粒pET-28a-Cas9转化至BL21表达菌株，菌株用终浓度为0.2mM的IPTG，于15℃诱导表达24h；

S4.纯化：利用Ni Sepharose FF进行纯化；

S5.浓缩：纯化后的Cas9蛋白再以100kDa超滤管浓缩，浓缩后蛋白加入透析液，以30kDa透析袋进行透析，透析后得到的Cas9蛋白添加甘油至终浓度50%后，分装液氮速冻保存于-80℃；

其中，步骤S2所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和Xho I酶切位点之间插入NotI-ccdB-CmR-AscI序列得到。

更具体地，本发明所述Cas9蛋白的制备方法的步骤如下：

S1.获得Cas9目的片段：以携带有Cas9序列的px330质粒为模版，利用SEQ ID NO.1和2所示上下游引物进行PCR扩增；

S2.构建重组质粒pET-28a-Cas9：PCR扩增产物纯化后，使用Not I和Not I进行双酶切，酶切产物纯化回收后，连接至同样经过Not I和Asc I双酶切处理的pET28a-ccdB-CmR载体上，鉴定后得到重组质粒pET-28a-Cas9；

其中，所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和Xho I酶切位点之间插入NotI-ccdB-CmR-AscI序列得到；

所述鉴定为酶切鉴定和测序鉴定，所述酶切鉴定是分别使用Asc I或Not I单酶切和Asc I或Not I双酶切进行酶切鉴定；

S3.Cas9蛋白的原核表达

S31.将鉴定正确的重组质粒pET-28a-Cas9转化至BL21表达菌株中，经过阳性鉴定获得重组菌；

S32.挑取重组菌的单克隆至LB培养基中37℃培养过夜，再按照1%的接种量，将过夜培养的菌种接种至新的LB培养基中37℃培养至OD600=1.0，冰水浴30min，加IPTG至终浓度为0.2mM，于15℃继续培养24h（诱导表达）；

S4.Cas9蛋白的纯化

诱导表达后的菌液进行离心，将菌体重悬于裂解缓冲液中，与平衡后的Ni Sepharose FF在4℃结合半小时，以大于10倍柱床体积的裂解缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱缓冲液进行洗脱，得到Cas9蛋白；

所述裂解缓冲液包含50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油、40mM咪唑；

所述洗脱缓冲液包含50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油、250mM咪唑；

S5.浓缩：得到的Cas9蛋白稀释三倍后，以100kDa超滤管浓缩，浓缩后蛋白加入透析液，以30kDa透析袋进行透析，透析后得到的Cas9蛋白添加甘油至终浓度50%后，分装液氮速冻保存于-80℃；

所述稀释使用的稀释液包含50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油；

所述透析液包含50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油。

其中，上述步骤S1所述携带有Cas9序列的px330质粒是将包括N端和C端SV40核定位信号的Cas9蛋白，通过Not I与Asc I酶切位点连于改良pET28a质粒获得；所述改良pET28a质粒是在原始pET28a质粒的基础上，在Hind III与Xho I之间，插入了TEV蛋白酶切位点、Not I限制性核酸内切酶位点、氯霉素抗性基因、ccdB细菌生长致死蛋白、Asc I限制性核酸内切酶位点获得。

另外，本发明上述制备方法中所用到的所述NotI-ccdB-CmR-AscI序列是以原核表达载体pDEST17-ccdB-CmR为基础，在PCR引物两端分别加上Hind III和Xho I酶切位点，通过PCR扩增将NotI酶切位点、TEV蛋白酶切位点、细菌致死蛋白ccdB、氯霉素抗性CmR扩增和AscI酶切位点进行扩增得到；

其中，所述pDEST17-ccdB-CmR是以原核表达载体pDEST15为基础，在PCR引物两端分别加上Not I和Asc I酶切位点，通过PCR扩增将细菌致死蛋白ccdB和氯霉素抗性CmR进行扩增，连接至经过Not I和Asc I消化的pDEST17-TEV-MCS载体中得到；

其中，所述pDEST17-TEV-MCS是以原核表达载体pDEST17为基础，通过LR反应与克隆载体pENTR-TEV-MCS进行重组得到；

其中，所述pENTR-TEV-MCS是以克隆载体pENTR为基础，通过引物退火将包含TEV蛋白酶切位点、Not I酶切位点和Asc I酶切位点的引物退火连接至经Not I与Asc I消化的pENTR载体中得到。

经过本发明上述原核表达的Cas9蛋白，为来源化脓链球菌的CRISPR/Cas9系统的蛋白组分，其分子量约160kDa，N端和C端分别连有SV40核定位序列，能与体外转录的sgRNA结合，对靶向体外DNA序列或体内基因组序列进行特异切割，可应用于DNA的体外切割和基因修饰动物的制备。

因此，根据本发明所述制备方法得到的Cas9蛋白在与体外转录的gRNA体外切割DNA序列、与体外转录的gRNA通过胚胎注射制备转基因动物中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明以原核系统表达了具有活性的Cas9蛋白，体外切割实验证明纯化的Cas9蛋白具有体外活性，可特异切割体外DNA；胚胎注射实验证明纯化的Cas9蛋白具有体内活性，可用于制备基因修饰动物。

在研究过程中，我们经过了大量的研究和探索发现，对于Cas9蛋白的原核表达系统的构建，存在着许多的问题，重组质粒的构建、Cas9蛋白的诱导表达、Cas9蛋白的纯化等条件需要严格的优化控制，整个方法是一个系统的相互协调起作用的有机整体，环环相扣，甚至是非常细微的变化，都会引起截然不同的效果，影响Cas9蛋白的成功获得以及蛋白的纯度和得率。

本发明具有以下有益效果：

本发明克服了现有技术中Cas9活性蛋白纯化手段繁琐、融合蛋白标签容易导致纯化中标签降解影响纯度和产量的问题，建立了一种高效的原核表达系统，成功的一步将带His标签的Cas9蛋白纯化出来，并且保证所制备的Cas9蛋白无论在体内或体外都具有活性，适合用于胚胎注射以制备修饰动物。

经过体外切割实验证明了本发明纯化的Cas9蛋白具有体外活性，可特异切割体外DNA；胚胎注射实验证明了纯化的Cas9蛋白具有体内活性，可用于制备基因修饰动物。

附图说明

图1 为Cas9蛋白的DNA的扩增结果（1%琼脂糖凝胶，Gelred染色）；M：marker，50～70：退火温度梯度。

图2为pET28a-Cas9表达载体示意；如图所示，带有N端和C端核定位信号（NLS）的Cas9融合蛋白DNA片段通过NotI和AscI被插入到改造过的pET28a原核表达载体中。

图3 为pET-28a-Cas9载体酶切鉴定（1%琼脂糖凝胶，Gelred染色）；第一道为原质粒；第二道为NotⅠ酶切产物（预期条带约为9620bp）；第三道为AscⅠ酶切产物（预期条带约为9620bp）；第四道为NotⅠ和AscⅠ共同酶切产物（预期条带为4120bp+5500bp）。

图4 为不同表达载体的Cas9蛋白的表达状况及可溶度；图为在不同表达载体的Cas9蛋白的表达菌株诱导表达后，经超声裂解，分离上清和沉淀，进行电泳分析；对照组为一已知表达约60kDa蛋白的菌株，五角星形位置所示为重组Cas9蛋白电泳位置（约170kDa）；M: marker; P: 沉淀; S: 上清;

图5 为pCold-Cas9重组蛋白纯化结果 图为pCold-Cas9重组蛋白亲和纯化结果；五角星形位置所示为重组Cas9蛋白电泳位置（约170kDa）；E1～E5分别为第1至5次洗脱产物。

图6 为不同诱导温度Cas9蛋白的表达状况及可溶度示意图（SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色）；表达菌株在不同温度诱导表达后，经超声裂解，分离上清和沉淀，进行电泳分析；对照组为一已知表达约60kDa蛋白的菌株，五角星形位置所示为重组Cas9蛋白电泳位置（约170kDa）；M: marker; P: 沉淀; S: 上清; 15℃～37℃: 菌株诱导温度。

图7 为不同添加剂在不同离子强度对Cas9重组蛋白纯化的影响；图为不同添加剂在不同离子强度对Cas9重组蛋白纯化影响示意。五角星形位置所示为重组Cas9蛋白电泳位置（约170kDa）；S: 超声裂解后的上清; E: 洗脱后产物; NA: 无添加剂; G: 10% 甘油; T: 1% Triton X-100

图8 为亲和纯化时不同咪唑浓度对纯度的影响示意图（SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色）；在结合缓冲液中加入一定浓度咪唑纯化重组Cas9蛋白（170kDa）后的结果；10mM～40mM: 咪唑浓度; S: 上清; E: 洗脱后产物; M: marker。

图9 为 Cas9蛋白纯化结果示意图（SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色）；经优化后的纯化结果S: 上清；P：沉淀；F：流传；E1～E4：第1～4次洗脱。五角星形处为目的条带。

图10为纯化 Cas9蛋白体外活性检测示意图（1%琼脂糖凝胶，Gelred染色）。用体外转录的sgRNA及纯化的Cas9蛋白对靶向DNA进行切割。蓝色五角星形（从上往下第一颗五角星）所示为未切割的DNA；红色五角星形（从上往下第二、第四颗五角星）所示为被Cas9和sgRNA切割的DNA；绿色五角星形（从上往下第三颗五角星）所示为体外转录sgRNA的转录模板。

图11 为纯化Cas9蛋白体内活性检测示意；将针对Card14位点的sgRNA和Cas9蛋白注射至胚胎并进行PCR检测，箭头所示测序双峰表示靶向序列被切割及修复；WT: 野生型。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。如下述实施例中所用的异丙基硫化-D-半乳糖苷（IPTG）购买自生工生物公司。Ni Sepharose FF购买自GE Healthcare。蛋白纯化耗材购买自碧云天公司。Amicon 4 100kDa超滤管购买自Millipore公司。30kDa透析袋购买自生工生物公司。Phusion DNA聚合酶、FastDigestNotI、FastDigestAscI内切酶、T4连接酶购买自Thermo公司。PCR clean up和凝胶回收试剂盒均购买自Qiagen公司。

实施例1 构建重组质粒pET-28a-Cas9及Cas9蛋白的原核表达

1、PCR扩增Cas9序列

（1）设计引物

根据px330质粒上的Cas9序列设计了上下游引物，序列如下：

上游引物（SEQ ID NO.1所示）：

AAAGCGGCCGCCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAG；

下游引物（SEQ ID NO.2所示）：

AAAGGCGCGCCACTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCC。

（2）PCR扩增

以px330质粒为模版，利用上述上下游引物，使用高保真DNA聚合酶（phusion DNA聚合酶）在不同退火温度下对目的片段进行PCR扩增。结果如附图1所示，五角星形处表示PCR目的条带（约4000bp）。

2、构建重组质粒pET-28a-Cas9

（1）PCR扩增产物纯化：PCR扩增后产物通过Qiagen公司的纯化试剂盒（Clean up试剂盒）进行纯化处理；

（2）使用Thermo公司的快速限制性内切酶 Not I（FastDigest Not I）和Not I（FastDigest Asc I）进行双酶切；

（3）酶切产物通过Qiagen公司的微量样品凝胶回收试剂盒（MiniElute）纯化回收；

（4）纯化回收的产物连接至同样经过Not I和Asc I双酶切处理的pET28a-ccdB-CmR载体上，得到重组质粒pET-28a-Cas9（如附图2所示）；

其中，所用pET-28-ccdB-CmR载体为本实验室保存，是以原核表达载体pET28a（购于生物通代理）基础，经改造在Hind III和Xho I酶切位点之间添加NotI-ccdB-CmR-AscI序列，制成pET-28-ccdB-CmR载体。

其中，所述NotI-ccdB-CmR-AscI序列是以原核表达载体pDEST17-ccdB-CmR为基础，在PCR引物两端分别加上Hind III和Xho I酶切位点，通过PCR扩增将NotI酶切位点、TEV蛋白酶切位点、细菌致死蛋白ccdB、氯霉素抗性CmR扩增和AscI酶切位点进行扩增得到；

其中，所述pDEST17-ccdB-CmR是以原核表达载体pDEST15为基础，在PCR引物两端分别加上Not I和Asc I酶切位点，通过PCR扩增将细菌致死蛋白ccdB和氯霉素抗性CmR进行扩增，连接至经过Not I和Asc I消化的pDEST17-TEV-MCS载体中得到；

其中，所述pDEST17-TEV-MCS是以原核表达载体pDEST17为基础，通过LR反应与克隆载体pENTR-TEV-MCS进行重组得到；

其中，所述pENTR-TEV-MCS是以克隆载体pENTR为基础，通过引物退火将包含TEV蛋白酶切位点、Not I酶切位点和Asc I酶切位点的引物退火连接至经Not I与Asc I消化的pENTR载体中得到。

3、重组质粒pET-28a-Cas9的鉴定

为鉴定pET-28a-Cas9重组载体正确与否，我们对重组质粒pET-28a-Cas9进行酶切鉴定和测序鉴定。

分别使用Asc I或Not I单酶切和Asc I或Not I双酶切进行酶切鉴定，结果如附图3所示，实验结果表明，所有实验组的酶切产物大小均为与预期相符，因而可初步判断我们得到的载体为正确的pET-28a-Cas9载体。

另外，测序结果也表明Cas9序列被正确地克隆至pET28a。

4、Cas9蛋白的原核表达

（1）将鉴定正确的重组质粒pET-28a-Cas9转化至BL21（DE3）表达菌株（购于Transgen公司）中。经过阳性鉴定获得重组菌。

（2）挑取重组菌的单克隆至50mL LB培养基中37℃培养过夜。按照1：100的接种量，将过夜菌种接种至1L LB培养基中37℃培养至OD600=1.0，冰水浴30min，加IPTG至终浓度为0.2mM，于15℃继续培养24h。离心收集菌体于-80℃保存。

5、检测并优化Cas9蛋白表达

（1）重组质粒构建所用基础载体对Cas9蛋白表达的影响

将重组质粒pDEST15-Cas9，pDEST17-Cas9，pGEX5-Cas9，pCold-Cas9，pMBP-Cas9，pET-28a-Cas9分别转入BL21（DE3）中，在37℃以0.2mM诱导蛋白表达，并对裂解后沉淀和上清进行电泳分析。从结果可知，pET28-Cas9与pCold-Cas9上清表达的Cas9蛋白量较多，适宜用于后续纯化（如附图4所示）。然而，pCold-Cas9纯化后杂带较多，效果并不理想（如附图5所示）。

（2）不同诱导温度对Cas9蛋白表达的影响

我们对pET28-Cas9表达进行优化，将重组质粒pET-28a-Cas9转入BL21（DE3）中，分别用不同温度（15℃，20℃，25℃，30℃，37℃）诱导蛋白表达，用裂解液重悬菌体，超声后分离上清及沉淀，分别进行SDS-PAGE分析。以pET28a-B5载体构建重组质粒并转化表达菌株，作为蛋白诱导表达阳性对照，可表达约60kDa蛋白，pET28a-B5载体由本实验室构建保存。

与对照组（会表达约60kDa蛋白的菌株）相比，实验组有明显的条带（约为170kDa）。可知，在15℃诱导24hrs的条件下，Cas9蛋白总量及上清表达量最高（如附图6所示）。

实施例2 Cas9蛋白的纯化

1、Cas9蛋白的纯化

诱导表达后的菌液进行离心，将菌体重悬于裂解缓冲液（包含50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油、40mM咪唑）中，与平衡后的Ni Sepharose FF在4℃结合半小时，以大于10倍柱床体积的裂解缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱缓冲液（包含50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油、250mM咪唑）进行洗脱，洗脱后进行SDS-PAGE分析，考染观察结果。

得到的蛋白以50mM Tris-HCl pH8.0 300mM NaCl 10%甘油稀释三倍，并以100kDa超滤管浓缩。浓缩后蛋白以30kDa透析袋于50mM Tris-HCl pH8.0 300mM NaCl 10%甘油液进行透析。添加甘油至终浓度50%后，分装液氮速冻保存于-80℃。

2、优化Cas9蛋白纯化

首先，我们筛选了最适合用于纯化重组Cas9蛋白的条件。我们分别在低、高离子强度下，通过添加甘油或Triton X100，尝试提高Cas9蛋白可溶性和得率。从实验结果可知，仅当在使用300mM NaCl并且添加10%甘油的条件下，才能有可观的重组Cas9蛋白得率。然而，在72kD左右仍然存在杂带，影响蛋白纯度（如附图7所示）。

此外，为了提高Cas9蛋白纯度，我们用添加了不同浓度的咪唑的裂解液分别重悬菌体并进行超声，离心取上清与Ni Sepharose FF结合。由附图8可知，在10～30mM的咪唑浓度下所纯化的蛋白皆有一杂带，而在40mM的咪唑浓度的作用下，所得的Cas9蛋白并无杂带，纯度相对较高且对Cas9蛋白的产量并无明显影响（如附图8所示）。因此我们选择40mM的咪唑浓度作为后期大量纯化的条件。

3、Cas9蛋白纯化结果

在优化纯化步骤后，再次进行大量纯化，目的条带约为170kDa。如附图9所示，上清中存有大量Cas9蛋白，意味着上清中Cas9蛋白表达良好；沉淀中有少量不可溶的Cas9蛋白，说明仍有少量Cas9蛋白因折叠有误等原因而无法溶解；流穿液中也有少量未与咪唑结合的目的蛋白，一方面因为咪唑竞争是结合率稍有下降，另一方面亲和填料的饱和也会影响结合率。经洗脱后，洗脱的2～4次里有大量Cas9蛋白，可见纯化的纯度及产量较高。

实施例3 纯化的Cas9蛋白活性检测

分别通过体外和体内实验验证纯化的Cas9活性。

1、体外活性检测

为检测Cas9蛋白的活性，我们首先进行体外活性检测。已知Cas9蛋白与sgRNA结合后可对DNA进行切割，我们准备了BIE质粒作为检验Cas9蛋白活性的底物，选取BIE质粒上的一个位点设计sgRNA，有活性的Cas9蛋白与sgRNA结合后可将靶向DNA切割成两个片段，从而确定Cas9蛋白有活性与否。

具体是将100ng经NcoI线性化的BIE质粒，20ng B2 sgRNA，250ng纯化后的Cas9蛋白，混匀于1×NEB buffer终体积10μL，37℃孵育30min，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析Cas9蛋白体外活性。结果如附图10所示，只有当添加了Cas9蛋白后DNA才可被成功切割成两个片段，从而证实我们所提取、纯化的Cas9蛋白在体外有活性。

实验中所述B2 gRNA的获得：设计能识别BIE质粒的靶向序列：GGGTCGCAGCACAGCT，将其克隆至pDR274中，经过BglII将质粒线性化，通过T7 RNA聚合酶转录出sgRNA。所述BIE质粒：将IRES-GFP通过Hind III和Nhe I连接至pDR274上制成。

2、体内活性检测

紧接着我们进行Cas9蛋白的体内活性检测。设计靶向特异基因的gRNA，并合成引物，将gRNA的DNA序列克隆到pDR274载体中。通过体外转录的方法合成gRNA。第一天，给C57BL/6雌鼠注射5～10 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG，也称为马绒毛膜促性腺激素），44～48小时后注射5～10 IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG），将雌鼠与雄鼠合笼。次日早上检栓，处死交配成功的雌鼠从中收集0.5天的受精卵。然后将50ng/μL gRNA和纯化好的100ng/μL Cas9 蛋白共注射到小鼠的受精卵的胞质中。将注射过的胚胎培养到1.5天，通过PCR的方式扩增出靶区域，通过测序检测Cas9蛋白的活性。

试验中，首先进行C57BL/6母鼠超量排卵并收集胚胎，然后将Cas9蛋白与针对Card14位点的sgRNA混合，进行胚胎注射。培养后将收集的胚胎针对Card14位点进行PCR和测序，结果如附图11所示，切割位点往后出现双峰，表明该位点被Cas9蛋白成功切割，并修复成与原序列不同的新序列。从而得知Cas9蛋白在体内有活性。

综上所述，本发明分别通过体外切割实验证明了纯化的Cas9蛋白具有体外活性，可特异切割体外DNA；胚胎注射实验证明了纯化的Cas9蛋白具有体内活性，可用于制备基因修饰动物。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  广州美格生物科技有限公司

 

<120>  一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  36

<212>  DNA

<213>  上游引物

 

<400>  1

aaagcggccg ccatggcccc aaagaagaag cggaag                               36

 

 

<210>  2

<211>  37

<212>  DNA

<213>  下游引物

 

<400>  2

aaaggcgcgc cactttttct tttttgcctg gccggcc                              37

 

 

Claims (10)

1.一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法，其特征在于，将Cas9蛋白序列转化入pET28a-ccdB-CmR载体，再转化至原核表达菌株，经过诱导表达后，收集菌体，经亲和纯化、用超滤管浓缩纯化、透析后即得到纯化的Cas9蛋白；所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和Xho I酶切位点之间插入NotI-ccdB-CmR-AscI序列得到。

2. 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：按照1：100的接种量，将表达菌接种LB培养基培养，于37℃过夜培养菌种至OD600=1.0，冰上冷却30分钟后，加终浓度为0.2mM的IPTG，于15℃继续培养24小时。

3. 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，纯化蛋白时，使用50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM、NaCl 10%甘油和40mM咪唑组成的裂解缓冲液进行菌体裂解。

4. 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，纯化蛋白时，以Ni Sepharose FF柱进行纯化。

5. 根据根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，纯化蛋白时，以50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油和250mM咪唑组成的洗脱缓冲液进行洗脱。

6. 根据根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，纯化蛋白时，以30kDa透析袋于50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl和10%甘油组成的透析液中进行透析。

7. 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.以携带有Cas9序列的px330质粒为模版，利用SEQ ID NO.1和2所示上下游引物进行PCR扩增；

S2.利用Not I和Not I双酶切，将PCR扩增产物连接至pET28a-ccdB-CmR载体，得到重组质粒pET-28a-Cas9；

S3.重组质粒pET-28a-Cas9转化至BL21表达菌株，菌株用终浓度为0.2mM的IPTG，于15℃诱导表达24h；

S4.纯化：利用Ni Sepharose FF进行纯化；

S5.浓缩：纯化后的Cas9蛋白再以100kDa超滤管浓缩，浓缩后蛋白加入透析液，以30kDa透析袋进行透析，透析后得到的Cas9蛋白添加甘油至终浓度50%后，分装液氮速冻保存于-80℃；

其中，步骤S2所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和Xho I酶切位点之间插入NotI-ccdB-CmR-AscI序列得到。

8. 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤如下：

S1.获得Cas9目的片段：以携带有Cas9序列的px330质粒为模版，利用SEQ ID NO.1和2所示上下游引物进行PCR扩增；

S2.构建重组质粒pET-28a-Cas9：PCR扩增产物纯化后，使用Not I和Not I进行双酶切，酶切产物纯化回收后，连接至同样经过Not I和Asc I双酶切处理的pET28a-ccdB-CmR载体上，鉴定后得到重组质粒pET-28a-Cas9；

其中，所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和Xho I酶切位点之间插入NotI-ccdB-CmR-AscI序列得到；

S3.Cas9蛋白的原核表达

S31.将鉴定正确的重组质粒pET-28a-Cas9转化至BL21表达菌株中，经过阳性鉴定获得重组菌；

S32.挑取重组菌的单克隆至LB培养基中37℃培养过夜，再按照1%的接种量，将过夜培养的菌种接种至新的LB培养基中37℃培养至OD600=1.0，冰水浴30min，加IPTG至终浓度为0.2mM，于15℃继续培养24h；

S4.Cas9蛋白的纯化

诱导表达后的菌液进行离心，将菌体重悬于裂解缓冲液中，与平衡后的Ni Sepharose FF在4℃结合半小时，以大于10倍柱床体积的裂解缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱缓冲液进行洗脱，得到Cas9蛋白；

所述裂解缓冲液包含50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油、40mM咪唑；

所述洗脱缓冲液包含50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油、250mM咪唑；

S5.浓缩：得到的Cas9蛋白稀释三倍后，以100kDa超滤管浓缩，浓缩后蛋白加入透析液，以30kDa透析袋进行透析，透析后得到的Cas9蛋白添加甘油至终浓度50%后，分装液氮速冻保存于-80℃；

所述稀释使用的稀释液包含50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油；

所述透析液包含50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油。

9. 权利要求7或8所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述携带有Cas9序列的px330质粒是将包括N端和C端SV40核定位信号的Cas9蛋白，通过Not I与Asc I酶切位点连于改良pET28a质粒获得；

所述改良pET28a质粒是在原始pET28a质粒的基础上，在Hind III与Xho I之间，插入了TEV蛋白酶切位点、Not I限制性核酸内切酶位点、氯霉素抗性基因、ccdB细菌生长致死蛋白、Asc I限制性核酸内切酶位点获得。

10. 根据权利要求1、7或8所述制备方法，其特征在于，所述NotI-ccdB-CmR-AscI序列是以原核表达载体pDEST17-ccdB-CmR为基础，在PCR引物两端分别加上Hind III和Xho I酶切位点，通过PCR扩增将NotI酶切位点、TEV蛋白酶切位点、细菌致死蛋白ccdB、氯霉素抗性CmR扩增和AscI酶切位点进行扩增得到；

其中，所述pDEST17-ccdB-CmR是以原核表达载体pDEST15为基础，在PCR引物两端分别加上Not I和Asc I酶切位点，通过PCR扩增将细菌致死蛋白ccdB和氯霉素抗性CmR进行扩增，连接至经过Not I和Asc I消化的pDEST17-TEV-MCS载体中得到；

其中，所述pDEST17-TEV-MCS是以原核表达载体pDEST17为基础，通过LR反应与克隆载体pENTR-TEV-MCS进行重组得到；

其中，所述pENTR-TEV-MCS是以克隆载体pENTR为基础，通过引物退火将包含TEV蛋白酶切位点、Not I酶切位点和Asc I酶切位点的引物退火连接至经Not I与Asc I消化的pENTR载体中得到。